第三讲量子点荧光探针ppt课件.ppt

第三讲 量子点荧光探针,2,量子点概述,当半导体材料降至一定临界尺寸后，电子在三维上的运动受到了限制，表现出量子局限效应。这类材料都称为量子点（quantum dots，QDs）,量子局限效应导致费米能级附近的电子能级由连续变为离散能级或能隙变宽，具有类似分子特性的分立能级结构，受激后可以发射荧光。,3,量子点又称为半导体纳米晶（nanocrystals，NCs）、半导体纳米粒子（nanoparticles，NPs）,-族：SiC，SiGe；,量子点 种类,-族：CdSe，CdTe，ZnS，MgSe等；,-族：GaAs，InAs，GaSb等；,族：Si，Ge；,-族：PbSe；,单量子点：Au，Pd，Co等；,什么是量子点？,量子点是准零维的纳米材料，由少量的原子所构成。粗略的说，量子点的三个维度的尺寸都在100纳米以下，外观恰似一极小的点状物，其内部电子在各方向上的运动都受到局限，所以量子局限效应特别显著。由于量子局限效应会导致类似原子的不连续电子能级结构，因此量子点又被称为“人造原子”。科学家已经发明许多不同的方法来制造量子点，并预期这种纳米材料在21世纪的纳米电子学上有极大的应用潜力。,quantum confinement effect,量子点可用来作激光器的工作物质,nanoelectronics,什么是量子点？,若要严格定义量子点，则必须由量子力学出发。电子的物质波特性取决于其费米波长。F=2/kF在一般的材料中，电子的波长远小于材料的尺寸，因此量子局限效应不显著。如果将某一个维度的尺寸缩到小于一个波长，此时电子只能在另外两个维度所构成的二维空间中自由运动，这样的系统我们称之为量子阱；如果我们再将另一个维度的尺寸缩到小于一个波长，则电子只能在一维方向上运动，我们称之为量子线；当三个维度的尺寸都缩到一个波长以下时，就成为量子点了。,什么是量子点？,由此可见，并非小到100nm以下的材料就是量子点，真正的关键尺寸是由电子的德布罗意波长或平均自由程。一般而言，电子费米波长在半导体内较在金属内长得多，例如在半导体材料砷化镓GaAs中，费米波长约40nm，在铝金属中却只有0.36nm。,量子阱、量子线及量子点能级比较关系示意图,70 年代，量子点由于其独特的光学特性,认为其应用主要集中在电子与光学方面。80 年代，生物学家已经对量子点产生了浓厚的兴趣，但由于它的荧光量子产率低，工作集中在研究量子点的基本特性方面。1997 年以来，量子点制备技术的不断提高,量子点已越来越可能应用于生物学研究。量子点可作为生物探针是从1998年Alivisatos AP.和Chan WC两个研究小组开始，此后量子点的功能进一步被发现、推广，使之成为生物学领域研究的热点。,量子点研究的历史,量子点的制备方法,目前，量子点的制备方法主要有以下四种.1.化学溶胶法(chemical colloidal method)：以化学溶胶方式合成，可制作复层量子点(multilayered)，过程简单，且可大量生产。,量子点的制备方法,2.自组成法(self-assembly method)：采用分子束磊晶(molecular-beam epitaxy)或化学气相沉积(chemical vapor deposition)过程，并利用晶格不匹配(lattice mismatch)的原理，使量子点在特定基材表面自聚生长，可大量生产排列规则的量子点。,在GaAs基材上以自组成法生长 InAs量子点的STM影像,量子点的制备方法,3.微影蚀刻法(lithographyandetching)：以光束或电子束直接在基材上蚀刻制作出所要之图案，由于相当费时因而无法大量生产。,以GaAs基材蚀刻窄圆柱式量子点之SEM影像，水平线条约0.5微米,量子点的制备方法,4.分闸法(split-gate approach)：以外加电压的方式在二维量子井平面上产生二维局限，可控制闸极改变量子点的形状与大小，适合用于学术研究，无法大量生产。,以分闸法产生GaAs/AlGaAs量子点之SEM影像,量子点的制备方法小结,合成方法,Top-down,Bottom-up,晶体表面刻蚀,组成器件,化学制备,生物体系标记,波长范围宽，发射峰尖锐，发射波长可以通过纳米粒子粒径调节，易于自组织,14,量子点的光学特性,宽吸收峰：能吸收所有比它第一发射波长更短的“较蓝”的光。,窄发射峰：具有非常窄且十分对称的荧光发射光谱。,大斯托克斯位移：消除激发光和散射光等背景干扰。,15,光稳定性：抵抗紫外、化学物质、生理代谢对其的降解。,安全：细胞毒性低，可用于活细胞及体内研究。,高量子效率：荧光强度大，发光时间长，便于长期跟踪和保存结果。,16,发射波长尺寸可调：通过控制量子点大小或组成合成任意所需发射波长的量子点，达到同时检测多种指标的要求。,独特优越的光学、电子和表面可修饰性！,17,18,量子点的应用,光电子学方面的应用：电致发光的光电子器件,80s后期，生物学家开始关注量子点在生物学方面的应用；,1998年，Alivisatos和Nie研究小组的工作：半导体量子点在生物学研究的应用取得重大突破。,量子点在生物上的应用,(A)Excitation(dashed)and fluorescence(solid)spectra of fluorescein;(B)A typical water-soluble nanocrystal sample in PBS,传统荧光素,量子点,激发光-虚线；发射光-实线；半峰高宽度：67nm vs.32nm；10%峰高宽度：100nm vs.67nm；量子点光谱优点：无红外延伸，连续、宽激发谱,广激发谱，窄发射谱,发射光波长易调节,染色稳定性,22,M.Bruchez,M.Moronne,P.Gin,Weiss,A.Alivisatos.Science.1998,281:2013-2016.,采用两种QDs标记3T3小鼠纤维原细胞。一种发绿色荧光（2nm）：经TEOS、尿素及乙酸作用后，对细胞核具有很强亲和力；一种发红色荧光（4nm）：表面经生物素修饰后，与亲和素修饰的肌动蛋白丝发生特异性吸附。,QDs用于荧光生物标记,23,QDs用于非同位素标记生物分子的超灵敏检测,QDs表面连接上巯基乙酸（HS-CH2COOH),从而使量子点既具有水溶性，还能与生物分子（如蛋白质、多肽、核酸等）结合，然后通过光致发光检测出QDs，从而使生物分子识别一些特定的物质。,CdSe：发光核心 Zns：包壳它们是在有机溶剂中制备的，不溶于水，无生物亲和性。巯基集团作用：S与ZnS包壳中Zn 原子结合，而有机集团与蛋白质结合，这样量子点探针就溶于水，且有生物亲和性了。,24,A,B,C,original QDs,mercapto-solubilized QDs,QD-IgG conjugates,转铁蛋白与量子点共价交联，在受体的介导下发生内吞作用，转移至HeLa细胞中，证明连接的量子点仍具有生物活性。,裸量子点,结合巯基,结合了巯基蛋白质,25,两个创新点：发挥QDs的水溶性 将QDs与生物分子的偶联,单个波长可激发所有的量子点，而不同染料分子的荧光探针需多个激发波长。应用范围广：可用于多领域和多仪器多种颜色：颜色取决于量子点的大小，在同一激发波长下，可发出多种激发光，达到同时检测多种指标的要求。抗光致漂白性安全：细胞毒性低，可用于活细胞及体内研究荧光时间长：荧光时间较普通荧光分子长数千倍，便于长期跟踪和保存结果,量子点在生物上的应用,27,基于QDs与生物分子间的特异性相互作用,构建量子点-生物复合探针,特异性靶向作用,保持荧光强度及稳定性,减少其他分子非特异性吸附,28,量子点的制备,Top-down,Bottom-up,晶体表面刻蚀,组成器件,化学制备,生物标记,有机相制备水相制备,29,前驱体,稳定剂：巯基乙酸、巯基乙醇、2-硫代二乙醇、左旋半胱氨酸等,形成的量子点类型：CdSe传统核型，CdSe-CdS核-壳型，CdTe-CdS-ZnS核-壳-壳型，Eu掺杂CdSe,ie：在绝氧的条件下，向以巯基乙酸为稳定剂的CdCl2溶液中引入H2Te气体，通过高温或微波，使量子点快速成核及生长。,阳离子：Zn2+、Cd2+等；阴离子：Te2-、Se2-等。,30,量子点的表面修饰与生物功能化,1、使用双功能试剂，与量子点表面金属离子配合,31,3、对量子点表面进行硅烷化处理，并嵌入可与生物分子连接的官能团,2、表面修饰有三正辛基氧化磷（TOPO）的量子点先与双亲聚合物的疏水长链以疏水作用力相结合，再通过聚合物的亲水基团与生物分子连接,32,4、在量子点表面修饰带负电荷的基团，通过电荷作用力与带正电的生物分子结合,5、将量子点并入带空隙的微珠或纳米级的微球中，形成胶囊，再通过双功能试剂将微球与生物分子连接,33,生物成像 荧光免疫分析 生物芯片 生物传感器 基于FRET研究生物分子间作用,34,Wu X,Liu H,Liu J,Nat Biotechnol,2003,21（1）:41-46,Wu等将CdSe/ZnS量子点与羊抗鼠IgG或链霉素结合，并将其作为二抗与抗Her2的单体克隆抗体进行免疫反应，从而实现乳腺癌细胞的特异性检测。,QDs用于生物成像技术,35,a.PEG-coated CdSe/ZnS量子点标记的小鼠肺部：血管、肿瘤细胞、肿瘤中的血管和淋巴管b.近红外荧光QDs被前哨淋巴结吸收。,组织成像,Kim S,Lim Y T,Soltesz E G.Nat.Biotechnol.2004,22:93-97,36,c.包含各种量子点的不同颜色的微珠被注射到小鼠体内用于活体成像d.用连接有抗体的红色量子点进行小鼠活体内前列腺癌细胞的特异性标记和成像,X Gao,M L.Richard,Shuming Nie.Nat.Biotechnol,2004,22:959-960,活体成像,37,QDs用于免疫分析,是临床医学上鉴别某些生物标志的重要生物技术手段。,同时分析多种荧光物质,有机荧光染料,？,量子点,量子点与免疫球蛋白IgG结合，再捕捉抗原,38,Goldman E R,Clapp A R,Anderson G P.AnaL Chem,2004,76(3):684,Goldman等人用四种不同颜色的量子点分别于抗霍乱毒素、蓖麻毒素、志和菌毒素1和葡萄球菌肠毒素B的抗体偶联，在一个微孔板上实现了四种毒素的同时检测。,39,QDs应用于生物芯片技术量子点色彩的多样性满足了对生物高分子（蛋白质、DNA）所蕴含海量信息进行分析的要求,将聚合物和量子点结合形成聚合物微珠，微珠可以携带不同尺寸（颜色）的量子点，被照射后开始发光，经棱镜折射后传出，形成几种指定密度谱线（条形码），这种条形码在基因芯片和蛋白质芯片技术中有光明的应用前景。,40,CdSe/ZnS与有机磷水解蛋白（OPH）通过静电作用偶联，测定对氧磷。,QDs应用于生物传感器,41,X Ji,J Zheng,K.R.Vipin,M.L.Roger.J.Phys.Chem.B,2005,109,3793-3799,42,QDs基于FRET研究生物分子间相互作用,1)能量供体的发射光谱与能量受体的吸收光谱必须重叠；,2)能量供体与能量受体的荧光生色团必须以适当的方式排列；,3)能量供体、能量受体之间必须足够接近，这样发生能量转移的几率才会高,发生FRET的条件：,43,C Zhang,L.W.Johnson,Anal.Chem.2009,81:30513055,44,Single Quantum Dot-Based Nanosensor for Multiple DNA Detection基于单量子点纳米传感器用于多DNA检测,Chunyang Zhang,Juan Hu.Anal.Chem.2010,82,1921-1927,QDs用于DNA检测,45,传 统,DNA检测,生物传感器单分子检测,核酸杂交技术,聚合酶链反应,操作复杂，条件难控制，耗时长，灵敏度受限制,双色重合法,双色荧光交联光谱,检测单个靶分子底物，荧光光谱重叠干扰,46,基于单量子点纳米传感器,本文根据量子点的宽激发谱带，窄且对称性好的发射谱带，高量子产率，光稳定性好的特点，基于双色同时检测法（two-color coincidence）以及荧光共振能量转移（FRET）检测法，在均相体系中的单分子水平下多通道检测HIV-1和HIV-2。,纳米传感器是以纳米级离子为敏感材料，能够探测、感受外界的信号、物理条件或化学组成，并将探知的信息传递给其他装置的功能单体或仪器。,47,two biotinylated capture probes：capture probe 1,5-TAG TAA GAA TGT ATA GC-3-TEG-Biontin；capture probe 2，5-GCA ACT AAA TTC A-3-TEG-Biontin。,two alexa fluor reporter probes：reporter probe1，Alexa Fluor 488-5-CTG GGA TTA AAT AAA A-3；reporter probe2，Alexa Fluor 647-5-AAA GGA CCA GGC-3。,two target oligonucleotides：target DNA1 for HIV-1，5-GCT ATA CAT TCT TAC TAT TTT ATT TAA TCC CAG-3；target DNA2 for HIV-2，5-TGA ATT TAG TTG CGC CTG GTC CTT T-3。,Experimental Section,48,The hybridization experiments：Buffered solution（pH=8.0）：100mM tris-HCl、10mM(NH4)2SO4，3mM MgCl2T=40,t=30mins,Mix biotinylated capture probes,Alexa Fluor 488-and Alexa Fluor 647-labeled reporter probes,and the target DNAs.（capture probes:repoter probes=1:1）.At room temperature,Add the streptavidin-coated 605-nm-emission QDs(605QDs c=2.510-11M).,49,Schematic view of the experimental apparatus used for simultaneous detection of the photons emitted from the 605QD,Alexa Fluor 488,and Alexa Fluor 647.Photons emitted from the 605QD,Alexa Fluor 488,and Alexa Fluor 647 were separated by three dichroic mirrors and etected by three avalanche photodiodes(APDs),respectively.,50,The normalized absorption and emission spectra of the 605QD,Alexa Fluor 488,and Alexa Fluor 647.Blue line,absorption spectrum of Alexa Fluor 488;green line,emission spectrum of Alexa Fluor 488;black line,absorption spectrum of the 605QD;magenta line,emission spectrum of the 605QD;cyan line,bsorption spectrum of Alexa Fluor 647;red line,emission spectrum of Alexa Fluor 647.,51,Results and Discussion,52,Representative traces of the fluorescence bursts from Alexa Fluor 488,the 605QD,and Alexa Fluor 647 detected with a single QD-based nanosensors for multiple DNA detection in a microfluidic flow.The fluorescence signals of Alexa Fluor 488 were shown in green.The fluorescence signals of the 605QD were shown in blue.The fluorescence signals of Alexa Fluor 647 were shown in red.,53,54,Conclusions,The QD functioned as both a fluorescence pair for coincidence detection and a FRET donor for FRET detection.,Functioned as a local nanoconcentrator which significantly amplified the coincidencerelated fluorescence signals and the FRET signals,Simple probepreparation,PCR-free,high sensitivity,and low cost,A simple and ultrasensitive approach for multiple DNA detection at single-molecule level in a homogeneous format and might find wide applications in gene expression studies,point-of-care testing,high-throughput screening,and clinical diagnostics.,55,展 望,1、设计水溶性、生物相容性、高荧光效率的量子点仍然有很大发展空间。,2、在高选择性、高特异性标记细胞核生物分子的技术上推陈出新。,3、QDs对活体的长期毒性还有待验证。,4、提高QDs在活体深层组织中的成像技术。,尽管在应用中存在着这些难点，量子点作为一种新的荧光标记物仍将为荧光成像及检测技术带来新的高峰，对细胞生物学、光子学成像及医学领域也将会产生深远的影响！,