第5章维生素的测定ppt课件.ppt

第五章 维生素的测定,第一节 概 述第二节 脂溶性维生素的测定第三节 水溶性维生素的测定,一、维生素的故事,人类对维生素的认识始于3000多年前。当时古埃及人发现夜盲症可以被一些食物治愈，虽然他们并不清楚食物中什么物质起了医疗作用，这是人类对维生素最朦胧的认识。,第一节 概述,1519年，葡萄牙航海家麦哲伦率领的远洋船队从南美洲东岸向太平洋进发。三个月后，有的船员牙床破了，有的船员流鼻血，有的船员浑身无力，待船到达目的地时，原来的200多人，活下来的只有35人，人们对此找不出原因。,1734年，在开往格陵兰的海船上，有一个船员得了严重的坏血病，当时这种病无法医治，其他船员只好把他抛弃在一个荒岛上。待他苏醒过来，用野草充饥，几天后他的坏血病竟不治而愈了。诸如此类的坏血病，曾夺去了几十万英国水手的生命。1747年英国海军军医林德总结了前人的经验，建议海军和远征船队的船员在远航时要多吃些柠檬，他的意建被采纳，从此未曾发生过坏血病。但那时还不知柠檬中的什么物质对坏血病有抵抗作用。,第一节 概述,1912年，波兰科学家丰克，经过千百次的试验，终于从米糠中提取出一种能够治疗脚气病的白色物质。这种物质被丰克称为“维持生命的营养素”，简称Vitamin(维他命），也称维生素。随着时间的推移，越来越多的维生素种类被人们认识和发现，维生素成了一个大家族。人们把它们排列起来以便于记忆，维生素按A、B、C一直排列到L、P、U等几十种。,第一节 概述,第一节 概述,发现,第一节 概述,发现,第一节概 述,维生素的结构复杂：分为：胺类（B1）醛类（B6）醇类（A）酚 醌类等,维生素的命名,多根据发现的时间顺序以英文字母排序，如维生素A、维生素B1、B2，维 生 素C，维生素E等。根据特定生理功能，如抗干眼病因子、抗坏血酸、生育酚等。按照其化学结构如视黄醇、硫胺素、烟酸、叶酸等。,维生素都具有以下共同特点：,化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；不能供给机体热能，也不是构成组织的基本原料，主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小；一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。,维生素A缺乏时的具体表现为：,影响视觉，眼睛的结膜、角膜干燥，暗适应减弱，乃至夜盲。皮肤干燥、脱屑，上皮组织改变，腺体分泌减少。免疫力降低，反复呼吸道感染、腹泻。头发干枯、易断，指甲无光泽。牙质萎缩，骨骼发育不良。味觉、嗅觉不佳、食欲差，生长发育停滞。影响智力发育。,缺乏症：轻度缺乏可引起疲乏、头痛、食欲下降、恶心、便秘、烦躁易怒及注意力下降等症状；重度缺乏则导致抑郁、记忆力差、肌肉软弱无力、神经麻木及烧灼 感、进行性麻痹等不适。食入过多 无害。食物来源：奶及奶制品、肉、全麦面包、谷类（粗米）、家禽、坚果类（如栗子）。,维生素B1又称硫胺素，为水溶性维生素。作用：神经传导、脂肪、碳水化合物和酒精的代谢、能量代谢（作为a酮酸脱羧酶及转酮基酶的辅酶）。,缺乏症：早期出现畏光、视物模糊、眼睛烧灼和痒感，口角疮、舌面光滑并呈鲜红色。病势进展，角膜血管充血、角膜溃疡、生长障碍。多与其它b族维生素缺乏同时出现。,维生素B2又称核黄素，为水溶性维生素。作用：作为氧化还原酶类的辅酶，参与体内许多代谢和能量产生过程中的氧化还原反应，如参与葡萄糖、某些氨基酸和脂肪的氧化过程，为机体提供热能。,测定食品中维生素含量的意义,评价食品的营养价值；寻找富含维生素的食品资源；指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症或维生素中毒；研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导人们制定合理的加工工艺及贮存条件；监督维生素强化食品的强化剂量，防止因摄入过多而引起维生素中毒。,维生素的分类,脂溶性维生素（如A、D、E、K等）；水溶性维生素（如B1、B2、B6、C、B12等）。,按维生素溶解性能可将它们分成两大类：,脂溶性维生素：溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与脂类共存的一类维生素，包括A、D、E、K 各小类，其共同特点：是摄入后存在于脂肪组织中，不能从尿中排除，大剂量摄入时可能引起中毒；由于可储藏在脂肪中，故不需每天供给。水溶性维生素：溶于水，包括B、C 各小类，其共同特点：是一般只存在于植物性食品中，满足组织需要后都能从机体排出。需要每天供给。,维生素的分析方法,水溶性维生素：标准测定法维生素B1-荧光法 GB/T5009.84-2003维生素B2-荧光法 GB/T5009.885-2003总维生素C-荧光法 GB/T5009.86-2003(第一国标法)总维生素C-2.4-二硝基苯肼法(GB/T5009.86-2003(第二国标法)保健食品中盐酸硫胺素、吡哆醇、烟酰胺测定-GB/T5009.197-2003,脂溶性维生素：标准测定法胡萝卜素：HPLC GB/T5009.83-2003(第一国标法)纸层析 法(色谱)GB/T5009.83-2003(第二国标法)维生素A、维生素E-HPLC GB/T5009.82-2003维生素A-比色法 GB/T5009.82-2003 维生素D-比色法 GB/T5413.9-1997-HPLC 此两法是AOAC选定的正式方法,维生素测定的标准方法及代号,第二节 水溶性维生素的测定,水溶性维生素包括：维生素B1(硫胺素)维生素B2（核黄素）维生素B6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）维生素PP（烟酸）叶酸、泛酸（维生素B3）生物素（维生素B7）维生素C 等，,特点：水溶性维生素都易溶于水,不溶于苯、乙醚、氯仿等大多数有机溶剂。在酸性介质中很稳定，即使加热也不破坏；但在碱性介质中不稳定，如果同时加热，更易于破坏或分解。,第二节 水溶性维生素的测定,广泛存在于动植物组织中，在食物中常以辅酶的多种形式存在，满足组织需要后，多余的量都能从机体排出。,第二节 水溶性维生素的测定,易受空气、光、热、酶、金属离子等的影响。维生素B2 对光，特别是紫外线敏感，易被光线破坏；维生素C 对氧、铜离子敏感，易被氧化。测定水溶性维生素时，一般多在酸性溶液中进行前处理。维生素B1、B2 通常采用盐酸水解，或再经淀粉酶、木瓜蛋白酶等酶解作用，使结合态维生素游离出来，再进行提取。,维生素C：草酸、草酸-醋酸、偏磷酸-醋酸溶液直接提取。维生素C 既具有有机酸的性质，也具有还原剂的性质草酸价廉，使用方便，对维生素C 有很好的稳定作用偏磷酸：不稳定，只能保存710 天，价格较贵，溶解费时，但它能沉淀蛋白质，澄清提取液，适合于蛋白质含量高的样品,第二节 水溶性维生素的测定,VB1又叫硫胺素、抗神经炎素。1、食品中VB1的存在形式 常以游离态存在 复合脂形式存在（磷蛋白）辅羧酶形式存在,一、维生素B1的测定,2、VB1的性质 VB1在中性、碱性下不稳定，易分解；VB1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定；VB1为白色结晶，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3，易溶于水。,一、维生素B1的测定,VB1的测定方法：荧光法、紫外分光光度法、比色法、色谱法等。荧光法原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被氧化成一种兰色荧光物质，即为硫色素，在紫外光下，硫色素发出荧光。,一、维生素B1的测定,测定方法 萃取 100g样品于干燥烧杯中，加入100ml0.1N H2SO4，打成匀浆，煮沸30分钟，称取一定的样品经高压锅121、20分钟高压酸解 水解 在酸解的样品中冷却后加入含有10%糖化酶的10ml 2.5M NaAC溶液，摇匀，用15%NaOH调pH=4.5，用淀粉酶使淀粉水解，也可用磷酸酶使淀粉水解，于50恒温箱中12小时。,3、VB1的测定,一、维生素B1的测定,纯化（采用柱层析提纯）吸附剂采用的是人造浮石。人造浮石用25%KCl溶液分数次洗涤，主要是把VB1吸附上去，吸附上去后，再用热水淋洗，最后用25%KCl-HAC把VB1洗脱下来，这样就得到纯VB1，再根据上面的原理在碱性下分析。分析装填柱子（离子交换柱）提纯 氧化 测定,3、VB1的测定,一、维生素B1的测定,维生素B1测定方法液相色谱法,方法原理：样品在稀盐酸溶液中经消化，使用淀粉酶和木瓜酶分解样液中的淀粉和蛋白质后，在碱性铁氰化钾溶液中氧化后，用异丁醇提取所得维生素B1测定样液。然后用C18柱，乙腈-磷酸盐缓冲溶液作流动相，以荧光检测器进行液相色谱法测定，求出样品中的维生素B1。,教材P364,二、维生素B2测定,维生素B2又名核黄素、乳黄素橙黄色针状结晶，熔点为282耐热，对空气、氧气稳定，溶于水。水溶液呈黄绿色荧光，在强酸性和强碱性溶液中则充分溶解。,在强酸性溶液中即使加热也很稳定，而在强碱性溶液中则不稳定，特别是具有遇光易分解的性质。维生素B2在自然界中较多存在于酵母、肝脏、蛋、牛乳、肉类中，在天然物中维生素B2不仅有游离型的，还有与核酸结合在一起。测定时要经过适当的前处理，使其分离后进行测定。测定方法有荧光法、液相色谱法、微生物法等。,二、维生素B2测定,维生素B2的测定液相色谱法,方法原理：样品在稀盐酸溶液中经消化，使用淀粉酶和木瓜酶分解样液中的淀粉和蛋白质后，用C18柱，乙腈-磷酸盐缓冲溶液作流动相，以荧光检测器进行液相色谱法测定，求出样品中的维生素B2。,教材P364,三、维生素C的测定,维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸。Vc广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。Vc具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性，进一步水解则生成2，3二酮古乐糖酸，失去生理作用。食品分析中的所谓总抗坏血酸是指：抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量。不包括二酮古乐糖酸和进一步的氧化产物。,氧化,氧化,还原型抗坏血酸 脱氢抗坏血酸 2，3二酮古乐糖酸,三、维生素C的测定,维生素C（还原型）纯品为白色无臭结晶，熔点190192，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。如果进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。,三、维生素C的测定,荧光分光光度法(第一法)2，4-二硝基苯肼比色法（总VC）(第二法)碘量法 2，6-二氯靛酚法（还原型VC）电位法高效液相色谱法 HPLC,三、维生素C的测定,根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。,常用的测定方法有：,(一)荧光法一、原理 样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化生成脱氢型抗坏血酸后，与邻苯二胺反应生成具有荧光的喹喔啉。在一定条件下，喹喔啉的荧光强度与脱氢抗坏血酸的浓度成正比，以此测定食物中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。一定条件：激发光：338nm 发射光：420nm,三、维生素C的测定,（二）2，4-二硝基苯肼法-Vc总量GB/T 5009.862003 蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸含量测定方法第二法,总抗坏血酸包括：还原型 脱氢型 二酮古乐糖酸型。此法是将样品的还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与2，4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎。脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总Vc。,三、维生素C的测定,1、原理：用酸处理过的活性碳把还原型的抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，再与2，4二硝基苯肼作用，生成红色的脎，其呈色强度与总抗坏血酸含量成正比，进行比色测定。在硫酸溶液中显色稳定，520nm波长处有最大吸收。,三、维生素C的测定,（二）2，4-二硝基苯肼法-Vc总量,三、维生素C的测定,（二）2，4-二硝基苯肼法-Vc总量,2、测定步骤(1)样品提取 同2，6-二氯靛酚滴定法(2)氧化处理：取25ml样品滤液+2g活性炭 振摇1min 过滤收集滤液+2%硫脲10ml(目的：防止Vc继续氧化)(3)显色反应:取三支试管，每支试管都加入上述氧化稀释液4mL。其中一支试管作空白，另两只试管各加入1.0mL22，4二硝基苯肼溶液，将三支试管放入（370.5）恒温箱或水浴中准确保温3h。取出试管放入冰水中。,空白管冷至室温后加入0.1mL22，4二硝基苯肼溶液，1015min 后也放入冰水中。向每支试管滴加 5mL85硫酸，边加边摇动，滴加时间至少需要1min。加完硫酸后将试管从冰水中取出，室温下准确放置30min 后立即比色。,三、维生素C的测定,（二）2，4-二硝基苯肼法-Vc总量,(4)比色：用1cm 比色杯以空白液调零点，于500nm 波长下测吸光值。,(5)标准曲线的绘制 取5个50ml容量瓶编号 1 2 3 4 5 加VC标准液 10 20 30 40 50ml 取5个比色管取相应 2 2 2 2 2 加硫脲溶液（滴）1 1 1 1 1 2，4-二硝基苯肼（ml）0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 于37保温箱3小时，取出于冰浴中，然后滴加85%硫酸5ml取出放30分钟在540nm下,测各消光值绘标准曲线，同时做空白。计算：每百克食品中抗坏血酸的毫克数=C/W*100,三、维生素C的测定,（二）2，4-二硝基苯肼法-Vc总量,三、维生素C的测定,（三）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc*,1、原理：抗坏血酸（Vc）结构中有烯二醇结构存在，因此具有还原性，能将蓝色染料2，6-二氯靛酚还原为无色的化合物，Vc则被氧化为脱氢Vc。根据此染料酸碱指示及氧化还原指示特性，用碱性蓝色染料的标准溶液滴定植物样品酸性浸出液中的Vc到刚变为浅红色为终点，有蓝色的用用量即可计算Vc的含量。,还原型Vc 染料（显色）氧化型Vc 被还原的染料（不显色）,三、维生素C的测定,（三）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,2、试剂2%草酸溶液：称20g草酸，加水至1000ml；维生素C标准液：准确称20mgVC溶于1%草酸中，并稀释至100ml，吸5ml于50ml容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此溶液每毫升含有0.02mgVC；0.02%2，6-二氯靛酚溶液：称取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200ml含有52mg碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至250ml，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每星期标定一次。,三、维生素C的测定,（三）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,0.001N KIO3标液：吸0.1N KIO3溶液5ml于500ml容量瓶内加水至刻度，每毫升相当于VC0.008mg；0.5%淀粉溶液；6%KI溶液。,三、维生素C的测定,（三）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,标定一：吸标液（VC）5ml于三角瓶加6%KI溶液0.5ml 加2%草酸溶液10ml 加1%淀粉3滴用KIO3标液滴定到淡兰色。计算：抗坏血酸浓度（mg/ml）=c V1 88/V2 c-KIO3标液的浓度（mol/L）V1-滴定时消耗KIO3标液的体积（ml）V2-维生素C溶液量,三、维生素C的测定,（三）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,标定二：吸5ml已知浓度V C标液 加5ml1%草酸 用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在15秒不褪色为终点计算：每毫升2，6-二氯靛酚相当于维生素C的毫克数等于滴定度（T）T=（C V1）/V2C-维生素C的浓度（mg/ml）V1-维生素C的体积（ml）V2-消耗2，6-二氯靛酚的体积（ml）,三、维生素C的测定,（三）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,三、维生素C的测定,（三）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,A.样品处理新鲜果蔬样品：称取鲜样50.0100.0g，放入组织捣碎机的杯中加入等重量的20 g/L草酸提取液，快速捣碎1分钟，将样品打成浆状。样品处理的整个过程应在10分钟内完成，以免VC被空气氧化。用小烧杯称取浆状物10.030.0 g（含还原性VC 15 mg），放入100mL容量瓶中，用20g/L草酸溶液定容，若有泡沫可加2滴辛醇除去。过滤，如果滤液颜色深，影响滴定终点的判定时，可加入12勺白陶土脱色，不易过滤，可用离心机分离。,多汁果蔬样品：可用纱布压汁后脱脂棉花快速过滤，量取1020mL汁液，立即用20g/L草酸溶液定容至100mL容量瓶中。干样品：称取1.0004.000 g（含还原性Vc 15mg），放入研钵中，加入少许20g/L草酸溶液研磨成浆状液，洗入100mL容量瓶中，用20g/L草酸溶液定容。含有还原性物质的样品：含有较多Fe2+的样品可用用80 mg/L醋酸代替用20 g/L草酸溶液作为浸提剂。亚硫化脱水样品，可与稀释至一定容量之前加入20mL丙酮，以除去SO2的干扰。,（三）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,B 滴定：吸取以上制备的无色滤液5.0010mL（含Vc约0.21mg）放入50mL三角瓶中，用棕色半微量滴定管中装的2，6-二氯靛酚标准溶液滴定至浅红色，约在15秒内不褪色为终点,同时以浸提剂作为空白（空白值为0.080.10 mL）进行滴定。计算：Vc（mg/100g)=(VV0)T/m100式中：x样品中还原型抗坏血酸含量，mg/100g；V滴定时样液消耗染料的体积，mL；V0空白滴定时消耗染料的体积，mL；T用标准还原型抗坏血酸溶液标定染料溶液所得出1mL 染料溶液相当于抗坏血酸的量，mg/mL；m滴定时所取滤液中含有样品的质量，g,（三）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,注意事项:所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；滴定时，可同时吸二个样品。一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考；样品进入实验室后，应浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，损失维生素C；贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子（Fe2+），要用8%的醋酸代替2%草酸。这时如用草酸，低铁离子可以还原2，6-二氯靛酚，使测定数字增高，使用醋酸可以避免这种情况的发生；,三、维生素C的测定,（三）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化；在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除；测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。,三、维生素C的测定,（三）2，6-二氯靛酚滴定法还原性Vc,原理与2，6-二氯靛酚滴定法相同，以化学电池电动势判断终点。测草莓的、山楂中等有色水果的Vc方法：先用Al(OH)3乳液脱色，再用电位法滴定。,三、维生素C的测定,(四)电位法：,(五)高效液相色谱法用6%磷酸提取Vc，定容过滤微孔膜过滤0.45 m 进样检测。此法可将还原态、氧化态Vc分开，分别定量。特点：灵敏度高、重现性好、速度快、分离度高、操作简单。,三、维生素C的测定,1溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。2耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定；维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。,第三节脂溶性维生素的测定,VA、VD、VE、与类脂物一起存于食物中，摄食时一道被人体吸收，可在体内积贮。,脂溶性维生素理化性质：,3耐热性、耐氧化性：耐热性 氧化性VA 好，能经受煮沸 易被氧化（光、热促进其 氧化）V D 好，能经受煮沸 不易被氧化 V E 好，能经受煮沸 在空气中能慢慢被氧化（光、热、碱促进其氧化）,根据上述性质测定脂溶性维生素时，通常：样品 皂化 提取脂溶性维生素(不皂化物)浓缩 溶于适当的溶剂 测定。在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。分析操作一般要在避光条件下进行。,1、-胡萝卜素的测定,特性：-胡萝卜素对酸、碱、热稳定，易光解、氧化，测定时避光防氧化。-胡萝卜素是一种色素，在 450nm波长处有最大吸收，因此可采用比色法测定。,1、胡萝卜素的测定,测定的关键是：分离分离的方法二种：纸层析法-GB123891990 标准分析法 溶剂萃取法,纸层析法：原理：胡萝卜素为脂溶性维生素易溶于有机溶剂中，以丙酮和石油醚提取食物中的，胡萝卜素及其他植物色素，以石油醚为展开剂(流动相)进行纸层析，胡萝卜素极性最小，移动速度最快，从而与其他色素分离，剪下含胡萝卜素斑点的滤纸，用石油醚溶解而后在450nm比色测定。,1、胡萝卜素的测定,1、胡萝卜素的测定,纸层析法：,操作：(1)样品提取与洗涤 粮食：直接磨粉 蔬菜等植物性食品：打成匀浆取适量样品用有机溶剂(丙酮、石油醚)反复提取,用100ml 5%的硫酸钠洗涤，弃去水层。植物油和高脂肪样品：提取色素前需要先经50KOH 脱醛乙醇溶液进行皂化处理，皂化液用石油醚反复提取，最后用水洗涤至中性。,1、胡萝卜素的测定,纸层析法：,(2)浓缩与定容 将石油醚提取液经无水硫酸钠滤入旋转蒸发器的球形蒸发瓶内，用约少量石油醚冲洗漏斗及无水硫酸钠3次，洗液并入蒸发瓶内，减压蒸馏，回收石油醚。待瓶中剩下约2ml石油醚时，取下蒸发瓶，用氮气冲干。立即加入2.00ml石油醚定容。(3)纸层析 按纸层析要求点样与层析，国标法中推荐层析剂为石油醚，待胡萝卜素与其他色素完全分开后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，剪下胡萝卜素层析带，用石油醚洗脱后，供比色测定。,1、胡萝卜素的测定,纸层析法：,操作:点样：滤纸及点样规格：18*30cm在滤纸下端距底边4cm处作一基线，在基线上取A、B、C、D四点。采用带状点样：吸取 0.1000.400ml样品浓缩液，在AB两点之间和CD两点之间迅速来回进行带状点样，一次点完。展开：将纸上所点样液自然挥发至干后，将滤纸卷成圆筒状，将两边连接，基线处于纸筒底端，置于预先用石油醚饱和过的层析缸内，上行展开。,1、胡萝卜素的测定,纸层析法：,洗脱：待胡萝卜素与其他色素分离后，取出滤纸，自然挥发干石油醚，剪下胡萝卜素(色斑)层析带，快速用石油醚溶解，然后，供比色测定。(4)比色与含量计算国标法采用1cm 比色杯，于450nm 波长下测吸光度，从标准曲线上查出 胡萝卜素含量，再计算出样品中胡萝卜素含量（以胡萝卜素计）。(5)标准曲线的绘制,1、胡萝卜素的测定,纸层析法：,1此法为国家标准方法，方法简便，色带清晰，最小检出限为0.11ug。2样品的提取和标准液的制备一定要注意避免丢失。3浓缩提取液时，一定要防止蒸干，胡萝卜素在空气中氧化或因高温、紫外线直射等破坏，所以定容、点样、层析后剪样点等操作环节一定要迅速。4纸层析法、柱层析法均不能区分、和胡萝卜素，虽然标准品为胡萝卜素，但实际结果为总胡萝卜素。由于天然食品中大部分为胡萝卜素，故对结果影响不大。,目前维生素A都是合成的，来源：（1）从动物肝脏中得到；（2）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指类胡萝卜素，主要是-胡萝卜素）维生素A的测定常用的方法有:三氯化锑比色法 紫外分光光度法 荧光分析法 液相色谱法。,2、维生素A的测定,维生素A的性质,因有许多不饱和链，故见光易分解；在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。对碱稳定。,2、维生素A的测定,测定步骤,样品用有机溶剂萃取脂类 即索氏抽提法，采用乙醚作提取剂，也可用热苯回流方法提取脂类。脂类的皂化 脂类有维生素和脂肪这两部分通过皂化（50%KOH、无水C2H5OH、热回流）把它们分开，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。提取：不皂化物和皂化物经水、苯、乙醚萃取可得到不皂化物。,2、维生素A的测定,2、维生素A的测定,柱层析分离干扰物质 采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把-胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素A与-胡萝卜素就是一个混合物，还要将它们分离开。如果样品中只有维生素A而不含-胡萝卜素时，这时可直接定容。维生素A与-胡萝卜素分离：吸附剂：8分中性Al2O3和2分碱性Al2O3混合，装柱 分离方法：a.用2%丙酮石油醚洗-胡萝卜素；b.用乙醚洗VA。,测定步骤,2、维生素A的测定,测定方法,三氯化锑 SbCl3比色法 维生素ACHCl3 SbCl3CHCl3形成兰色物质在620nm有最大吸收峰 这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。计算：每百克样品含VA的量=C（V1/V2）（100/W）C：从标准曲线上查得VA的量 V1：CHCl3定容的量 V2：测定所取样液体积,2、维生素A的测定,测定方法,紫外分光光度法 a.原理：VA为脂溶性的，测定VA时必须先将样品中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化部分，在经柱层析除去杂质等干扰物质，在紫外328nm下测定，求出含量。,2、维生素A的测定,测定方法,b.测定方法 1）提取及皂化:称样10.00g 于烧杯中 加40ml水搅匀 移250ml分液漏斗中 加氨水5ml 加乙醇35ml 摇匀 用乙醚抽提（每次40ml抽提三次）收集乙醚层 用10ml水洗乙醚层三次 水层再用30ml乙醚抽提一次 合并所用乙醚 用索氏法除乙醚 待瓶中乙醚除尽后 加30ml80%的KOH 40mlC2H5OH 加0.8g焦性没食子酸 83水浴30分钟（皂化脂肪）冷却后移入250ml分液漏斗中 加60ml水 用40ml乙醚抽提三次 合并乙醚抽提液 用水洗至中性 用索氏法除乙醚 除去后用5ml石油醚溶解瓶中内容物 然后移入刻度试管中,2、维生素A的测定,测定方法,2）层析 在层析柱内装8cm高度中性氧化铝 2cm高度碱性氧化铝及1cm无水硫酸钠 以石油醚浸透 装皂化后的样液慢慢于柱内 用12ml石油醚洗试管 洗液倒入柱内，活塞打开以每分钟为35滴左右的速度打开，当液面降到接近硫酸钠时 加5ml石油醚 随后用5ml洗脱液逐次洗涤。层析柱上第一个黄色层析层，一般是-胡萝卜素，此带在12%洗脱液前后洗去，收集于10ml容量瓶中直到流出物不呈黄色为止，此层可测-胡萝卜素用，而VA一般在50%洗脱液洗出，用2ml刻度吸管收集1ml。吸约0.2ml于小试管中加0.3ml25%三氯化锑溶液如呈兰色表明有VA存在，故0.5ml用石油醚定容10ml。,1.大多数维生素定量方法中，维生素必须先从食品中提取出来，通常使用哪些方法提取维生素？对于一水溶性维生素和一脂溶性维生素，分别给出一个适当的提取方法。2.维生素有哪些种类？为什么它们的分析测定是一项比较复杂的工作？3.2,6-二氯靛酚测定还原型Vc的原理是什么，浸提和测定为什么要在酸性的介质中进行，有哪些物质会干扰测定？4.Vc的总量包括哪些物质，你认为用2,4-二硝基苯肼比色法测定Vc总量要注意些什么问题？,思考题,