生物选修3基因工程ppt课件.ppt
,生物选修3,专题1 基因工程,一、基因工程的概念,基因工程的别名,基因拼接技术或DNA重组技术,操作对象,操作环境,操作水平,基本过程,结果,生物体外,基 因,DNA分子水平,剪切、拼接、导入、表达,人类需要的基因产物,基因工程：按照人们的意愿，把一种生物的某种基因提取出来，加以修饰改造，然后放到另一种生物的细胞里，定向地改造生物的遗传性状。,基因拼接技术或DNA重组技术,1、“基因剪刀”限制性核酸内切酶,二、基因操作的工具,限制酶,限制酶切开的是什么键？,（左上与右下相同，左下与右上相同）,磷酸二酯键,限制性核酸内切酶,1）特点：2）结果：3）功能：4）来源：,专一性（即识别特定核苷酸序列，在特定的切点切割）,产生黏性末端或平末端,切开每条链中两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键,原核生物,左上与右下相同左下与右上相同,磷酸二酯键,2、要想获得某个特定性状的基因必须要用限制酶切几个切口？切断几个磷酸二酯键？可产生几个黏性末端？,要切两个切口,切断四个磷酸二酯键，产生四个黏性末端。,思考：,1、限制性核酸内切酶与DNA水解酶相比有何不同？,DNA水解酶将DNA分子水解成单个核苷酸，限制性核酸内切酶只能将DNA分子分解成特定的DNA片段,2、末端特点？,1、EcoRI、SmaI限制酶识别序列？切点？,5-A3-TTCGA,AGCTT-3 A-5,5-CTGCA 3-G,G-3ACGTC-5,5-AAT3-TTA,GGG-3CCC-5,5-CCC3-GGG,ATT-3TAA-5,2、“基因的针线”DNA连接酶,作用实质：结果：,具有缝合DNA片段的作用（用同一种限制酶切开的不同来源的DNA的黏性末端之间的缝隙“缝合”起来）,形成磷酸二酯键,种类：,连接黏性末端,既能连接黏性末端，又可以连接平末端,DNA连接酶与DNA聚合酶异同？,DNA连接酶,DNA聚合酶,DNA连接酶与DNA聚合酶的比较,催化两个脱氧核苷酸之间形成磷酸二酯键,不需要模板,以DNA的一条链为模板,游离的DNA片段,单个的脱氧核苷酸,形成完整的DNA分子,形成DNA的一条链,基因工程,DNA复制,运载体,种类：质粒的特点：,3、运载体能将外源基因送入细胞的工具,（3）常含有标记基因（如：抗生素抗性基因、抗生素合成基因、固氮基因、色素基因）,质粒、噬菌体可以将外源基因载入大肠杆菌等宿主细胞中，而植物病毒和动物病毒能够将外源基因分别带到植物细胞和动物细胞中,质粒、噬菌体的衍生物、动植物病毒。,（1）细胞质中能自主复制的小型双链环状DNA分子；以独立于染色体（或拟核DNA分子）之外的方式存在。,（2）存在于许多细菌及酵母菌等生物体内,（4）能在受体细胞中复制并稳定保存,（5）具有一个至多个限制性核酸内切酶切点，供外源DNA片段插入,作为运载体必须具备哪些条件？,1.能够在宿主细胞中复制并稳定地保存。2.具多个限制酶切点，以便与外源基因连接。3.具有某些标记基因，便于进行筛选。如抗菌素的抗性基因、产物具有颜色反应 的基因等。4.大小适中，便于操作。5.对宿主细胞无害、易分离。,能自我复制并带着插入的目的基因一起复制,有切割位点,有标记基因的存在，将来可用含青霉素的培养基鉴别。,1.以下说法正确的是（）A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有一个或多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、DNA连接酶使黏性末段的碱基之间形成氢键,C,2、不属于质粒被选为基因运载体的理由是（）A、能复制 B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,3、DNA连接酶催化的反应是()ADNA复制时母链与子链之间形成氢键 B黏性末端碱基之间形成氢键C两个DNA片段黏性末端之间的缝隙的连接 DA、B、C都不正确,C,4、作为基因的运输工具载体，必须具备的条件及理由是()A、能够在宿主细胞中稳定地保存下来并大量复制，以便于对目的基因进行筛选B、具有多个限制酶切点，以便于目的基因的表达C具有某些标记基因，以便于进行筛选D、能够在宿主细胞中复制并稳定保存，以便为目的基因的插入,C,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、将目的基因导入受体细胞4、目的基因的检测与鉴定,第一步：目的基因的获取,1、目的基因主要是指 _,编码蛋白质的结构基因,2、方法：,1)、人工合成,2)、从基因文库中获取,3)、利用PCR技术扩增,(基因比较小，序列已知),聚合酶链式反应,反转录法获取目的基因的过程,逆转录酶,DNA聚合酶,人工合成目的基因,DNA合成仪,人工合成目的基因,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的脱氧核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,反转录法：,目的基因的mRNA,杂交双链(单链RNA/单链DNA),单链DNA,反转录酶,DNA聚合酶,双链DNA(目的基因),根据已知的氨基酸序列合成DNA法：,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,基因的脱氧核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,人工合成目的基因 小结,基因文库？,将含有某种生物不同基因的许多DNA片断，导入到受体菌的群体中，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库,从基因文库中获取目的基因,受体菌的整个群体包含了这种生物的全部基因,基因组文库的构建模式图,基因组文库与部分基因文库的关系,cDNA文库的构建模式图,杂交双链(单链RNA/单链DNA),单链DNA,双链DNA(cDNA),与载体连接后导入受体菌贮存，组成cDNA文库,原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,启动子,终止子,真核细胞的基因结构,非编码序列,mRNA,多肽链,初始mRNA,成熟mRNA,多肽链,出核孔,原核、真核基因表达比较,启动子.VS.起始密码/终止子.VS./终止密码,存在分子：,作用：,DNA(基因),启动/终止转录,mRNA,起始/终止翻译,mRNA中存在启动子/终止子的序列吗？,？,概念：PCR全称为_，是一项在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、_、_、_.,原理：_,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,DNA复制,已知基因的核苷酸序列,四种脱氧核苷酸,1对引物,DNA聚合酶(Taq酶),利用PCR技术扩增目的基因,变性,复性,延伸,1.变性（90-95）双链DNA模板在热作用下，_断裂，形成_,氢键,单链DNA,2.复性(55-65)温度降低，与DNA模板结合，形成局部_。,双链,引物,3.延伸（70-75）在 的作用下，连接，合 成与模板互补的DNA链。,脱氧核苷酸,Taq酶,利用PCR技术扩增目的基因,PCR技术与DNA复制的比较,解旋酶催化,高温变性解旋,细胞内 主要在细胞核内,细胞外 主要在PCR扩增仪内,解旋酶、普通的DNA聚合酶等,耐热的DNA聚合酶（Taq酶）,细胞内温和条件,需控制温度，在较高温度下进行,需要（一对）,不需要,模板、原料均相同,第二步：基因表达载体的构建（核心）,2、基因表达载体的组成？,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代,使目的基因能够表达和发挥作用,启动子,目的基因,终止子,标记基因,1、基因表达载体构建的目的？（P162）,抗生素抗性基因,用相同的限制核酸内切酶分别切割目的基因和载体DNA（如质粒），目的基因和载体DNA的两端形成相同的黏性末端，在DNA连接酶的作用下，将目的基因和载体DNA连接在一起，形成重组DNA分子。,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,抗生素抗性基因,第三步：将目的基因导入受体细胞,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,转化,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法：农杆菌转化法（1）农杆菌介绍：（2）适用范围及原理,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌 转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞 染色体DNA,新性状,农杆菌,适用于双子叶植物裸子植物,组织培养技术,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,适用于单子叶植物,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,适用于被子植物,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理（氯化钙），增加细胞壁的通透性,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因：繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？,若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。,目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。,常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。,第四步：目的基因的检测与鉴定,1.检测目的基因是否插入受体细胞的DNA中？,2.检测目的基因是否能转录出mRNA？,3.检测目的基因是否能翻译出蛋白质？,4.受体是否具有转基因特征？,（一）分子水平,1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因,提取受体生物全部DNA,适当限制酶切割,DNA片段,用同位素标记的目的基因片段杂交,显 出杂交带,（表明目的基因已插入）,分子杂交技术,从转基因生物中提取的基因组DNA,探针？,杂交的对象？,用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段,DNA-DNA分子杂交,2.检测目的基因是否转录出了mRNA,提取受体生物的mRNA,用同位素标记的目的基因片段杂交,显 出杂交带,（表明目的基因已转录出了mRNA）,用放射性同位素标记的含目的基因的DNA片段,探针？,杂交的对象？,从转基因生物中提取的mRNA.,DNA-mRNA分子杂交,3.检测目的基因是否翻译出蛋白质,抗原抗体杂交,提取受体生物的蛋白质,与相应抗体杂交,显 出杂交带,（表明目的基因已形成蛋白质产品）,从转基因生物中提取的蛋白质,抗原？,抗体？,将目的基因编码的蛋白质注射进动物体内进行免疫产生的相应抗体,（二）个体水平,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,抗性鉴定（抗虫鉴定、抗病鉴定）、活性鉴定等,目的基因的表达和检测 小结,个体接种实验（抗性鉴定）,抗原抗体杂交,DNA-mRNA分子杂交,DNA-DNA分子杂交,6、1997年，科学家将动物体内的能够合成胰岛素的基因与大肠杆菌的DNA分子重组，并且在大肠杆菌中表达成功。请据右下图回答问题。,(1)此图表示的是采取 合成基因的方法获取 基因的过程。(2)图中DNA是以 为模板，形成单链DNA，在酶的作用下合成双链DNA，从而获得了所需要的目的基因。(3)图中代表，它往往含 基因，以便对目的基因的检测。(4)图中表示，为使此过程顺利进行，一般须将大肠杆菌用 处理，以增大其细胞壁的。（5）图中表示 随大肠杆菌的繁殖而进行增殖，此目的基因在大肠杆菌内表达的标志是。,逆转录,目的,控制胰岛素合成的信使RNA,将目的基因导入受体细胞,标记,重组DNA分子,氯化钙,通透性,目的基因,大肠杆菌能产生人的胰岛素,【例】科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。但在进行基因工程的操作过程中，需使用特定的限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制性核酸内切酶的识别序列和切点是GGATCC，限制性核酸内切酶的识别序列和切点是GATC，据图回答：,(1)过程表示的是采取_ _的方法来获取目的基因。（2）根据图示分析，在形成重组DNA分子过程中，应用限制性核酸内切酶_（或）切割质粒，用限制性核酸内切酶_（或）切割目的基因。用限制性核酸内切酶切割目的基因和质粒后形成的黏性末端通过_ _原则进行连接。(3)人的基因之所以能与大肠杆菌的DNA分子进行重组，原因是_(4)人体的生长激素基因能在细菌体内成功表达出人的生长激素是因为_ _。写出目的基因导入细菌中表达的过程,反转录（人工合成）,碱基互补配对,人的基因与大肠杆菌DNA组成成分相同，结构相同,两种生物共用一套（遗传）密码,总结：,两者的组成成分及结构基本相同,目的基因通过转录和翻译表达遗传信息,生物共用一套遗传密码,基因重组,一、基因工程相关原理,DNA-DNA分子杂交,分子杂交：有一定同源性的两条核酸单链，在适宜的温度和离子浓度等条件下，通过碱基互补退火形成稳定的双链分子的过程。,DNA-RNA分子杂交,目的基因,目的基因未插入受体细胞DNA中,受体细胞的DNA片段,目的基因,目的基因未插入受体细胞DNA中,受体细胞的DNA片段,目的基因,目的基因已插入受体细胞DNA中,受体细胞的DNA片段,目的基因,目的基因已插入受体细胞DNA中,受体细胞的DNA片段,目的基因,目的基因已插入受体细胞DNA中,基因探针,基因探针，是一段带有检测标记，且序列已知的，含有目的基因的核酸序列。基因探针通过分子杂交与目的基因结合，产生杂交信号，能从浩翰的基因组中把目的基因显示出来。,基因工程的应用,一、植物基因工程,转基因工程技术主要用于提高农作物的抗逆能力,以及改良农作物的品质和利用植物生产药物等方面。,1、抗虫转基因植物2、抗病转基因植物3、抗逆转基因植物4、利用转基因改良植物的品质,受体细胞？,1.抗虫转基因植物,优点：减少环境污染、减低生产成本、提高产量,例子：棉花、水稻、玉米、马铃薯、番茄等等,主要杀虫基因：Bt毒蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物凝集素基因等,典型例子：转基因抗虫棉Bt毒蛋白基因,2.抗病转基因植物,抗病基因：病毒外壳蛋白基因、病毒的复制酶基因.抗真菌基因：几丁质酶基因、抗毒素合成基因.,3.抗逆转基因植物,转黄瓜抗青枯病基因的甜椒,4.利用转基因改良植物的品质,不会引起过敏的转基因大豆,优点：改善粮食作物的营养成分含量，如氨基酸、蛋白质,二、动物基因工程,特点：发展较迟，应用方面广,1、提高生长速度2、改善畜产品的品质3、生产药物4、作为器官移植的供体,受体细胞？,受精卵细胞,1.用于提高动物生长速度,原因：外源生长激素基因的表达可以使转基因动物生长更快,转基因鲤鱼,2.用于改善畜产品的品质,优点：避免食物过敏、腹泻、恶心等不适,转基因牛的乳汁，降低乳糖含量,3.用转基因的动物生产药物（重点）,优点：产量高、质量好、成本低、易提取,方法：乳腺生物反应器 膀胱生物反应器,注意：其中乳腺生物反应器只有雌性个体才能生产药物,为什么乳腺能成为基因药物最理想的表达场所呢？乳腺是一个外分泌器官，乳汁不进入体内循环，不会影响转基因动物本身的生理代谢反应。从乳汁中获取目的基因产物，产量高，易提纯，表达的蛋白质已经过充分的修饰加工，具有稳定的生物活性。从乳汁中源源不断获得目的基因的产物的同时，转基因动物又可无限繁殖。,过程：1、重组药用蛋白基因与乳腺蛋白基因的启动子2、用显微注射法导入到受精卵3、将受精卵送入母体生长发育4、转基因动物进入泌乳期后，提取乳汁,产物：抗凝血酶、血清白蛋白、生长激素、-抗胰蛋白酶,在传统的药品生产中，某些药品如胰岛素、干扰素直接生物体的哪些结构中提取？药品直接从生物的组织、细胞或血液中提取。如何高效生产？利用基因工程方法制造“工程菌”，可高效率地生产出各种高质量、低成本的药品。,三、基因工程药物（转基因微生物）,用基因工程的方法，使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。（如：含有人胰岛素基因的大肠杆菌菌株、含有抗虫基因的土壤农杆菌菌株）,胰岛素从猪、牛等动物的胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g的胰岛素，其产量之低和价格之高可想而知。,将合成的胰岛素基因导入大肠杆菌，每2000L培养液就能产生100g胰岛素！使其价格降低了30%-50%!,基因工程药品 胰岛素,干扰素是病毒侵入细胞后产生的一种糖蛋白。干扰素几乎能抵抗所有病毒引起的感染，是一种抗病毒的特效药。此外干扰素对治疗某些癌症和白血病也有一定疗效。传统的干扰素生产方法是从人血液中的白细胞内提取，每300L血液只能提取出1mg干扰素。19801982年，科学家用基因工程方法在大肠杆菌及酵母菌细胞内获得了干扰素，是传统的生产量的12万倍。1987年上述干扰素大量投放市场。,基因工程药品 干扰素,基因工程药品 生长激素,治疗侏儒症的唯一方法，是向人体注射生长激素。而生长激素的获得很困难。以前，要获得生长激素，需解剖尸体，从大脑的底部摘取垂体，并从中提取生长激素。现可利用基因工程方法，将人的生长激素基因导入大肠杆菌中，使其生产生长激素。人们从450L大肠杆菌培养液中提取的生长激素，相当于6万具尸体的全部产量。,生长激素释放抑制素参与生长的调节 可用来治疗肢端肥大症、急性胰腺炎等疾病胰岛素治疗糖尿病TPA（组织纤维酶原激活剂）治疗心脏、肺、脑血栓病 EPO（促红细胞生成素）治疗肾功能受损 引起的贫血、出血白细胞介素-2治疗肿瘤和感染性疾病 还有干扰素、生长激素、溶血栓剂、凝血因子、人造血液代用品、基因疫苗等等,基因诊断：也称为DNA诊断或基因探针技术，即在DNA水平分析检测某一基因，从而对特定的疾病进行诊断。探针制备：放射性同位素(如32P)、荧光分子等标记的DNA分子；原 理：利用DNA分子杂交原理；,四、基因诊断与基因治疗,目的：检测疾病,基因治疗：是指是把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的。,体外基因治疗：体内基因治疗：,目的：治疗疾病,蛋白质工程,蛋白质工程崛起的缘由基因工程在原则上只能生产自然界已存在的蛋白质，它们的结构和功能符合特定物种生存的需要，却不一定完全符合人类生产和生活的需要。,例如：,蛋白质工程的基本原理目标：根据人们对蛋白质功能的特定需求，对蛋白质的结构进行分子设计。最终还必须通过基因来完成。流程：,基因表达流程图,蛋白质工程流程图,基本途径：从预期的蛋白质功能出发 设计预期的蛋白质结构 推测应有的氨基酸序列 合成相应的脱氧核苷酸序列(基因）,胰岛素改造天然胰岛素制剂在储存中易形成二聚体和六聚体，延缓胰岛素从注射部位进入血液，从而延缓了其降血糖作用，也增加了抗原性，这是胰岛素B23-B28氨基酸残基结构所致。利用蛋白质工程技术改变这些残基，则可降低其聚合作用，使胰岛素快速起作用。该速效胰岛素已通过临床实验。,比较基因工程和蛋白质工程,蛋白质工程是在基因工程基础上的延伸，是第二代基因工程,联系,自然不存在的蛋白,天然存在的蛋白,结果,操作环境生物体外；操作对象基因；操作水平分子,相同点,蛋白质工程,基因工程,1.科学家将含人的-抗胰蛋白酶基因的DNA片段，注射到羊的受精卵中，该受精卵发育的羊能分泌含-抗胰蛋白酶的奶。这一过程不涉及（）A DNA按照碱基互补配对原则自我复制B DNA以其一条链为模板合成RNAC 按照RNA密码子的排列顺序合成蛋白质D RNA以自身为模板自我复制,D,2.基因治疗是指（）A、把健康的外源基因导入有基因缺陷的细胞中，达到治疗疾病的目的B.对有缺陷的细胞进行修复，从而使其恢复正常，达到治疗疾病的目的C.运用人工诱变的方法，使有基因缺陷的细胞发生基因突变回复正常D.运用基因工程技术，把有缺陷的基因切除，达到治疗疾病的目的,A,3.下列不属于利用基因工程技术制取的药物是（）A、从大肠杆菌体内制取白细胞介素 B、在酵母菌体内获得的干扰素 C、高产青霉素的青霉菌 D、产胰岛素的大肠杆菌,C,
