生物工程下游技术第4章微生物细胞破碎ppt课件.ppt

第四章 微生物细胞破碎,微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢物、细茵产生的碱性蛋白酶、霉菌产生的糖化酶等，称为胞外产物。但有些目的产物存在于细胞内部、如大多数酶蛋白、类脂和部分抗生素等，称为胞内产物。许多基因工程产品都是胞内产物。分离提取胞内产物时，首先必须将细胞破碎，使产物得以释放，才能进一步提取。因此细胞破碎是提取胞内产物的关键步骤。,第一节 细胞壁的组成与结构,细胞破碎的主要阻力来自于细胞壁，不同类型的微生物其细胞壁的结构特性是不同的。一、细菌细胞壁主要化学成分：肽聚糖；主要阻力肽聚糖的网状结构。二、酵母菌细胞壁主要化学成分：葡聚糖(30一34)、甘露聚糖(30)、蛋白质(6一8)和脂类；主要阻力壁结构交联的紧密程度和它的厚度。三、霉菌细胞壁主要化学成分：几丁质和葡聚糖；主要阻力几丁质或纤维素的纤维状结构。细胞壁结构与细胞破碎：细胞个体小、球形、壁厚、聚合物交联程度高是最难破碎的。,几丁质结构,第二节 常用破碎方法,方法很多，按其是否使用外加作用力可分为机械法和非机械法两大类。机械法：有珠磨法、高压匀浆法、超声破碎法等。在机械破碎法中，由于消耗的机械能转为热量会使温度上升，在大多数情况下要采用冷却措施，以防止生物产品受热破坏。非机械法：有酶溶法、化学法、物理法和干燥法等，其中某些方法的应用受到限制。目前人们仍在探寻新的细胞破碎方法。,一、珠磨法,珠磨法特点,破碎率较高适合大规模细胞破碎碎片较小，胞内物质释放完全温度容易急剧上升，需要良好的降温配套设备相对与酵母和细菌，珠磨法更适合真菌菌丝和藻类,影响细胞破碎的因素,搅拌速度（7001450r/min）料液的循环速度（50500L/h）细胞浓度（0.30.5g/mL）珠粒大小和填充量（0.451mm；7090),二、高压匀浆法,高压匀浆器,高压匀浆法特点,破碎率较高适合大规模细胞破碎碎片细小，胞内物质释放完全适合格兰氏阳性菌和酵母的破碎，不适合霉菌合格兰氏阴性菌,影响因素,操作压力（5070MPa）细胞浓度（20）温度循环次数(25),三、超声破碎法,超声破碎通常采用的超声破碎机在1525kHz的频率下操作。其破碎机理尚未完全清楚，可能与空化现象引起的冲击波和剪切作用有关。超声破碎的效率与声频、声能、处理时间、细胞浓度及菌种类型等因素有关。对不同菌种的发酵液超声破碎的效果差别较大。一般地，杆菌比球菌较易破碎，革兰氏阴性细菌细胞比革兰氏阳性细菌细胞较易破碎，对酵母菌的效果较差。优点：操作简便，液量损失少，适合实验室规模。缺点：易引起温度的剧烈上升，在大规模操作中，声能传递和散热困难，产生的化学自由基团能使某些敏感性活性物质失活。,电声超声波发生器,四、酶溶法,利用酶反应,分解破坏细胞壁上的特殊键，从而达到破壁的目的。1.外加酶法:常用的溶酶有溶菌酶、-1，3-葡聚糖酶、-1，6-葡聚糖酶、蛋白酶、甘露糖酶、糖苷酶、肽键内切酶、壳多糖酶等，而细胞壁溶解酶是几种酶的复合物。其中溶菌酶主要用于细菌类，其他酶对酵母作用较显著。2.自溶法:影响自溶过程的主要因素有温度、时间、pH、激活剂和细胞代谢途径等。微生物细胞的自溶法常采用加热法或干燥法。,五、化学渗透法,(1)表面活性物质:可促使细胞某些组分溶解，其增溶作用有助于细胞的破碎。(2)EDTA螯合剂:革兰氏阴性菌的外层膜结构通常靠二价阳离子Ca2+或Mg2+结合脂多糖和蛋白质来维持，一旦EDTA将Ca2+或Mg2+螯合，大量的脂多糖分子将脱落，使细胞壁外层膜出现洞穴。这些区域由内层膜的磷脂来填补，从而导致内层膜通透性的增强。(3)有机溶剂:能分解或溶解细胞壁中的类脂。(4)变性剂:变性剂与水中氢键作用，削弱溶质分子间的疏水作用，从而使疏水性化合物溶于水溶液。,化学渗透法有如下优缺点：,优点：(1)对产物释放具有一定选择性。(2)细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，易于固液分离和进一步提取。缺点：(1)通用性差，某种试剂只能作用于某些特定类型的细胞。(2)时间长，效率低，一般胞内物质释放率不超过 50。(3)有些化学试剂有毒性，在其后的产物提取精制过程中需设法分离除去。,第三节 破碎率的测定与破碎 技术的研究方向,一、破碎率的测定 1直接测定法 2目的产物测定法 3导电率测定法二、破碎技术的研究方向 1多种破碎方法相结合 2与上游过程相结合 3与下游过程相结合,