第二章中药化学成分的一般研究方法doc-第二章中药化学成.docx

教学目的要求和内容第二章 中药有效成分研究的一般方法【目的要求】1. 掌握中药化学成分的类型、一般理化性质、提取、分离的一般方法。2. 了解中药化学成分生合成及结构鉴定的一般方法。【教学内容】1. 中药中所含各类化学成分及生合成简介。2. 提取中药有效成分常用的方法：溶剂提取法、水蒸气蒸馏法、升华法、超声波提取法及超临界流体萃取法等。3. 分离中药有效成分常用的方法：系统溶剂分离法、两相溶剂萃取法、 沉淀法、盐析法、分馏法、结晶法及各种色谱法等。4. 中药有效成分结构研究方法简介：中药化学成分的结构鉴定程序、紫外光谱、红外光谱、核磁共振谱（一维谱：1H-NMR谱、13C-NMR谱、INEPT谱、DEPT谱；二维谱：1H-1H COSY谱、HMQC谱、HMBC谱应用简介）、质谱（EI-MS、FD-MS、FAB-MS、MS/MS等）、旋光谱、圆二色谱等在中药化学成分结构研究中的应用及晶体X射线衍射法简介。【教学方法】课堂讲授。第二章 中药化学成分研究的一般方法（10学时） 第一节 中药化学成分及生物合成简介（1学时）第二节 中药有效成分的提取分离方法（6学时）第三节 中药有效成分化学结构的研究方法（3学时）第二章 中药化学成分的一般研究方法第一节 中药化学成分及生物合成简介一、 中药化学成分类型简介 (一) 糖类分为单糖类、低聚糖和多聚糖类及其衍生物。低聚糖通常是由29个分子的单糖脱水缩合而成的化合物。多糖通常是由10个以上至上千个单糖脱水而形成的高聚物，水解后能生成相应数目的单糖。 (二) 苷类是糖或糖的衍生物与非糖物质(称为苷元或配基)通过糖的端基碳原子连接而成的化合物。 (三)醌类化合物是一类分子中具有醌式结构的化合物。包括苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌类化合物。(四) 苯丙素类化合物是一类分子中以苯丙基为基本骨架单位(C6-C3)构成的化合物。其中香豆素和木脂素为其典型化合物。 (五) 黄酮类化合物最早发现的黄酮为2苯基色原酮。泛指具有两个苯环通过中间三碳链相互联结而成的一类化合物。 (六) 萜类和挥发油凡由甲戊二羟酸衍生、且其基本母核的分子式符合(C5H8)n通式的衍生物为萜类化合物。单萜和倍半萜类多为具有特殊香气的油状液体，在常温下可以挥发称挥发油或精油。(七) 生物碱 是一类存在于生物体内的含氮有机化合物，氮原子多结合在环内，具有碱的性质，能与酸结合成盐，具有显著的生理活性。 (八) 甾体类化合物 是一类结构中具有环戊烷骈多氢菲甾核的化合物。 (九) 三萜类化合物 是一类基本骨架由30个碳原子组成的萜类化合物。 (十) 鞣质 又称单宁或鞣酸，是一类复杂的多元酚类化合物的总称，可与蛋白质结合形成致密、柔韧、不易腐败又难透水的化合物。二、 各类中药化学成分的主要生物合成途径许多化合物在分子结构中都包含着某些基本组成单位。如苯丙素类化合物具有C6-C3单位，萜类化合物具有重复的C5单位，脂肪酸、酚类、醌及聚酮类化合物具有C2单位，生物碱类化合物具有氨基酸单位，黄酮类化合物具有C6-C3-C6单位等等。按成分的生物合成途径可分为一次代谢产物和二次代谢产物。一次代谢产物是每种植物中普遍存在的维持有机体正常生存的必需物质，如叶绿素、糖类、蛋白质、脂类和核酸等。二次代谢是在特定的条件下，一些重要的一次代谢产物，如乙酰辅酶A、丙二酸单酰辅酶A、莽草酸及一些氨基酸等作为前体或原料，进一步经历不同的代谢过程，生成生物碱、黄酮、萜类、皂苷等。因二次代谢产物具有特殊、显著的生理活性。因此成为中药化学的主要研究对象。中药二次代谢产物的主要生物合成途径如下。 （一） 乙酸-丙二酸途径 (AA-MA途径) 通过这一途径能生成脂肪酸类、酚类、醌类等化合物。1. 脂肪酸类 乙酰辅酶A为这一生合成过程的起始物质，丙二酸单酰辅酶A起延伸碳链的作用。 乙酰辅酶A 丙二酸单酰辅酶A 缩合 乙酰乙酸 (acertoacetic acid) 还原 缩合 (Cn+2，n为偶数)图2-1 饱和脂肪酸的生物合成途径2酚类乙酰辅酶A直线聚合后再进行环合生成各种酚类化合物。 CH3-CO-S-CoA + 3 bCH3-CO-CH2-CO-CH2-CO-CH2-CO-Enz a c a b c 苔色酸 乙酰间苯三酚 四乙酸内酯 (间苯二酚型) (间苯三酚型) (内酯型)图2-2 酚类的生物合成途径3醌类 多酮环合生成各种醌类化合物或聚酮类化合物。如中药决明子中部分有效成分的生物合成。 红镰刀菌素 决明内酯 Torachrysono大黄素甲醚图2-3 决明子部分成分的生物合成(二) 甲戊二羟酸途径（MVA途径） 这一途径生成萜类、甾类化合物。 甲戊二羟酸单酰辅酶A 乙酰乙酸辅酶A 甲戊二羟酸 MVA焦磷酸二甲烯丙酯（DMAPP） 焦磷酸异戊烯酯 （IPP） 甲戊二羟酸5焦磷酸 磷酸香叶酯 单萜 三萜类 甾体 焦磷酸金合欢内酯倍半萜类 反式角鲨烯 六氢番茄烃 焦磷酸香叶基香叶酯 类胡萝卜素二萜类 图2-4 甲戊二羟酸途径(三)莽草酸途径又称桂皮酸途径这一途径衍化生成具有C6-C3及C6-C1基本结构的化合物。 去氢奎宁酸 去氢莽草酸赤藓糖4-磷酸 莽草酸 莽草酸3磷酸 分枝酸 苯丙氨酸 予苯酸 丝氨酸邻氨基苯甲酸 色氨酸 酪氨酸图2-5 莽草酸途径 -Oxidation 桂皮酸 对羟基桂皮酸 对羟基苯甲酸 香豆素 咖啡酸 原儿茶酸 阿魏酸 香草酸 木脂素 (C6-C3)×2 芥子酸 丁香酸 图2-6 C6-C3，C6-C1 类天然产物生物合成途径(四) 氨基酸途径 大多数生物碱类成分由此途径生成。 多巴胺 Mannich反应 多巴 3,4-dihydroxyphenyl pyruvic acid ()网状番茄枝碱 ()网状番茄枝碱 全去甲劳丹诺苏林 (+)-salutaridrine 小檗碱 罂粟碱Salutaridinol 蒂巴因 可待因 吗啡 莨菪碱 石榴皮碱 麦角酸鸟氨酸 赖氨酸 色氨酸图2-7 氨基酸途径(五)复合途径由不同的生物合成途径产生分子中的各个部分，即复合途径。如查耳酮类、二氢黄酮类化合物的A环和B环分别由乙酸-丙二酸途径和莽草酸途径生成。一些萜类生物碱分别来自甲戊二羟酸途径及莽草酸途径或乙酸-丙二酸途径。图2-8 查耳酮、二氢黄酮生成的复合途径第二节 中药有效成分的提取分离方法中药有效成分的提取分离是研究中药化学成分的基础。这一过程一般应在生物活性或药理学指标跟踪下进行。 一、 中药有效成分的提取方法(一) 溶剂提取法溶剂提取法是根据被提取成分的溶解性能，选用合适的溶剂和方法来提取。 作用原理是溶剂穿透入药材粉末的细胞膜，溶解溶质，形成细胞内外溶质浓度差，将溶质渗出细胞膜，达到提取目的。1溶剂的选择常用于中药成分提取的溶剂按极性由弱到强的顺序如下：石油醚<四氯化碳<苯<二氯甲烷<三氯甲烷<乙醚<乙酸乙酯<正丁醇<丙酮<乙醇<甲醇<水。 如石油醚可提出油脂、蜡、挥发油、游离的甾体及萜类；三氯甲烷或乙酸乙酯可提出游离生物碱、有机酸、黄酮及香豆素等；丙酮或甲醇(乙醇)可提出苷类、生物碱或有机酸盐类；水可提出糖类、氨基酸、蛋白质、无机盐类等水溶性成分。2提取方法 用溶剂提取中药有效成分，常选用如下方法。(1) 浸渍法 将中药粗粉装在适当容器中，加入水或稀醇浸渍药材一定时间，反复数次，合并浸渍液，减压浓缩即可。 (2) 渗漉法 将药材粗粉装入渗漉筒中，用水或醇作溶剂，首先浸渍数小时，然后由下口开始流出渗漉液，渗漉筒上口不断添加新溶剂，进行渗漉提取。 (3) 煎煮法 将中药粗粉加水加热煮沸提取。此法简便。 (4) 回流提取法 此法以有机溶剂为提取溶剂，在回流装置中加热进行。 (5) 连续回流提取法 具有溶剂消耗量小，操作不繁琐，提取效率高的特点。 影响溶剂提取法的因素较多，最主要的是提取溶剂和提取方法，其次是药材的粉碎度、提取温度及时间。(二)水蒸汽蒸馏法 水蒸汽蒸馏法用于提取能随水蒸汽蒸馏，而不被破坏的难溶于水的成分。(三) 超临界流体萃取法(SFE) 超临界萃取法是一种集提取和分离于一体，又基本上不用有机溶剂的新技术。超临界流体是处于临界温度(Tc)和临界压力(Pc)以上，介于气体和液体之间的流体。这种流体同时具有液体和气体的双重特性，它的密度与液体相似、粘度与气体相近，扩散系数虽不及气体大，但比液体大100倍。物质的溶解过程包括分子间的相互作用和扩散作用，物质的溶解与溶剂的密度、扩散系数成正比，与粘度成反比，因此超临界流体对许多物质有很强的溶解能力。 可以作为超临界流体的物质很多，如CO2、NH3、C2H6、 CCl2F2、C7H16等，实际应用CO2较多。CO2的临界温度(Tc=31.4)接近室温，临界压力(Pc=7.37MPa)也不太高，易操作，且本身呈惰性，价格便宜，是中药超临界流体萃取中最常用的溶剂。CO2超临界流体对物质溶解作用有一定选择性，主要与物质的极性、沸点、分子量关系密切。极性较低的化合物，如酯、醚、内酯和含氧化合物易萃取，化合物极性基团多，如羟基、羧基增加，萃取较难。对此，近年来用在超临界流体萃取中加入挟带剂的方法予以解决。挟带剂是在被萃取溶质和超临界流体组成的二元系统中加入的第三组份，它可以改善原来溶质的溶解度。常用甲醇、乙醇、丙酮等。挟带剂的用量一般不超过15。例如在2×l04kPa和70条件下，棕榈酸在SF-CO2中溶解度是0.25(W/W)。在同样条件下，于体系中加人10乙醇，棕榈酸的溶解度可提高到5.0以上。超临界流体萃取中药成分的主要优点：在接近室温下进行工作，防止某些对热不稳定的成分被破坏或逸散；萃取过程中几乎不用有机溶剂，萃取物中无有机溶剂残留，对环境无公害；提取效率高，节约能耗等。(四) 其他方法可用升华法直接从中药中提取具有升华性质的中药化学成分；某些可溶于水但对热不稳定成分，可用组织破碎提取法；新鲜原料中含量较高的成分或肉质类新鲜原料可用压榨法；超声波提取法；微波提取法。二、 中药有效成分的分离精制方法(一) 溶剂法l酸碱溶剂法 利用混合物中各组分酸碱性的不同而进行分离。生物碱类与无机酸成盐溶于水；羧基或酚羟基与碱成盐溶于水；2溶剂分配法 利用各组分的分配系数不同而达到分离的方法。 系统溶剂萃取法：混合物的水溶液，依次以正己烷(或石油醚)、三氯甲烷(或乙醚)、乙酸乙酯、正丁醇萃取，则得到相应极性的中药成分；水层减压浓缩至干，又可得到甲醇(或乙醇)可溶部分及不溶部分。试验装置为分液漏斗、连续液-液萃取装置或液滴逆流层析装置。（二）沉淀法 1专属试剂沉淀法 某些试剂能选择性地沉淀某类成分。雷氏铵盐与生物碱生成沉淀；甾体皂苷与胆甾醇生成稳定的沉淀；明胶与鞣质形成沉淀。2分级沉淀法 改变加入溶剂的极性或数量而使沉淀逐步析出称为分级沉淀。水醇法使蛋白质、多糖、多肽沉淀；醇水法使脂肪、叶绿素、蜡质沉淀；乙醇 / 乙醚（丙酮）使皂苷沉淀。3盐析法 加入无机盐（是氯化钠），使某些中药成分在水中溶解度降低而析出。（三）分馏法利用沸点的不同而进行分离的方法。分常压分馏、减压分馏、分子蒸馏等。(四) 膜分离法 以外加压力或化学位差为推动力。反渗透、超滤、微滤、电渗析为已开发应用的膜分离技术。其中反渗透、超滤、微滤相当于过滤技术。(五) 升华法 固体物质加热直接变成气体，遇冷又凝结为固体的现象为升华。(六) 结晶法 化合物由非晶形经过结晶操作形成有晶形的过程称为结晶。不纯的结晶进行再次结晶的过程称为重结晶。 对溶剂的要求：对被结晶成分的溶解度随温度不同有显著差别；与被结晶成分不产生化学反应；沸点适中等；对杂质的溶解度冷热都溶或都不溶。(七) 色谱分离法色谱分离法可用于分离和精制，亦可用于化合物的鉴定。1吸附色谱 吸附色谱是利用吸附剂对被分离化合物分子的吸附能力的差异，而实现分离的一类色谱。常用的吸附剂包括硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺等。硅胶吸附色谱的应用较广泛，中药各类化学成分大多可用其进行分离；氧化铝吸附色谱主要用于碱性或中性亲脂性成分的分离，如生物碱、甾、萜类等成分；活性炭主要用于分离水溶性物质如氨基酸、糖类及某些苷类；聚酰胺色谱以氢键作用为主，主要用于酚类、醌类，如黄酮类、蒽醌类等成分的分离。2凝胶过滤色谱(排阻色谱、分子筛色谱) 凝胶过滤色谱原理主要是分子筛作用，根据凝胶的孔径和被分离化合物分子的大小而达到分离目的。图2-9 凝胶过滤色谱示意图 葡聚糖凝胶(Sephadex G)是由葡聚糖(右旋糖酐)和甘油基通过醚桥(-O-CH2-CHOH-CH2O-) 相交联而成的多孔性网状结构，亲水性，在水中溶胀。商品型号即按交联度大小分类并以吸水量(干凝胶每1g吸水量× l0)表示， Sephadex G 只适于水中应用，不同规格适合分离不同分子量的物质。表2-1 Sephadex G的性质型号吸水量(ml/g)床体积(ml/g)分离范围(分子量)最少溶胀时间(小时)蛋白质多糖室温沸水浴G-101.0±0.12370070031G-151.5±0.22.53.51500150031G-252.5±0.24610001500100500062G-505.0±0.39111500300005001000062G-757.5±0.51215300070000100050000243G-10010.0±1.0152040001500001000100000485G-15015.0±1.5203050004000001000150000725G-20020.0±2.0304050008000001000200000725亲水性凝胶尚有聚丙烯酰胺凝胶(Sephacrylose，商品名Bio-gel P)、琼脂糖凝胶(Sepharose，商品名Bio-gel A)等，都适用于分离水溶性大分子化合物。羟丙基葡聚糖凝胶(Sephadex LH-20)它是在Sephadex G-25的羟基上引入羟丙基而成醚状结合态。既有亲水性又有亲脂性，因此不仅可在水中应用，也可在极性有机溶剂或它们与水组成的混合溶剂中膨胀使用，扩大了使用范围。3离子交换色谱 离子交换色谱是基于混合物中各成分解离度差异进行分离。离子交换剂有离子交换树脂、离子交换纤维素和离子交换凝胶三种。离子交换树脂对交换化合物的能力强弱，主要取决于化合物解离度的大小，带电荷的多少等因素。化合物解离度大(酸性、碱性强)易交换在树脂上，相对来说难洗脱。因此，当两种不同解离度的化合物被交换在树脂上，解离度小的化合物先于解离度大的化合物洗脱，由此实现分离。离子交换纤维素和离子交换凝胶是在纤维素或葡聚糖等大分子的羟基上，通过化学反应引入能释放离子的基团所形成。它们既有离子交换性质，又有分子筛的作用，对水溶性成分的分离十分有效。主要用于分离纯化如蛋白质、多糖、生物碱和其它水溶性成分等。如二乙基氨乙基纤维素(DEAE-cellulose)、羧甲基纤维素(CM-cellulose)、二乙基氨乙基葡聚糖凝胶(DEAE-sephadex)、羧甲基葡聚糖凝胶(CM-sephadex)等。4大孔树脂色谱 大孔树脂是一类没有可解离基团，具有多孔结构，不溶于水的固体高分子物质。可以通过物理吸附有选择地吸附有机物质而达到分离的目的。具有选择性好、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快等特点。根据骨架材料是否带功能基团，大孔吸附树脂可分为非极性、中等极性与极性三类。由于大孔吸附树脂的孔度、孔径、比表面积及构成类型不同而具有许多型号，其性质各异。常用的大孔吸附树脂有Amberlite系列(美国)；Diaion系列(日本)；GDX系列(天津试剂二厂)；SIP系列(上海医药工业研究所)南开大学化工厂生产的多种型号的产品如AB-8、X-5、NKA-9等。一般来说，大孔树脂的色谱行为具有反相的性质。被分离物质的极性越大，其Rf值越大，反之Rf值越小。对洗脱剂而言，极性大的溶剂洗脱能力弱，而极性小的溶剂则洗脱能力强，故大孔树脂在水中的吸附性强。5分配色谱 利用被分离成分在固定相和流动相之间的分配系数的不同而达到分离。按照固定相与流动相的极性差别，分配色谱法有正相与反相色谱法之分。在正相分配色谱法中，流动相的极性小于固定相极性。常用的固定相有氰基与氨基键合相，主要用于分离极性及中等极性的分子型物质；在反相分配色谱法中，流动相的极性大于固定相极性。常用的固定相有十八烷基硅烷(ODS，octadecane silica)或C8键合相。流动相常用甲醇-水或乙腈-水。主要用于分离非极性及中等极性的各类分子型化合物。由它派生的反相离子对色谱法和离子抑制色谱法，可以分离有机酸、碱、盐等离子型化合物。 色谱分离技术快速发展。如制备型薄层色谱技术和制备型加压液相柱色谱技术。加压液相色谱多用反相色谱柱，所用载体是颗粒直径小、机械强度及比表面积均大的球形硅胶微粒，有薄壳型、表面多孔型硅球及全多孔硅胶微球，其上并键合不同极性的有机化合物以适应不同类型分离工作，因而柱效大大提高。如Zorbax系列高效液相填充柱的型号及分离方式(见表2-2)。表2-2 HPLC用Zorbax系列柱柱子名称键合和固定相组成适用分离方式Zorbax ODS十八烷基组，-C18H37反相Zorbax C8辛基组、C8H17反相Zorbax NH2氨基组，NH2正相、反相、离子交换Zorbax CN氰基丙基组，C3H7CN正相、反相Zorbax TMS三甲基硅组，Si(CH3)3反相Zorbax SAX季铵组，NR3阴离子交换Zorbax SiL氧化硅，SiOH吸附Zorbax SCX-300磺酸基组，SO3H阳离子交换其它系列填充柱也有类似型号，如Lichrosob RP-18，-Bondapak C18等均为键合-C18H37的填充剂。加压液相色谱根据所用压力大小不同分类：高效液相色谱(HPLC，>20个大气压)；中压液相色谱(MPLC，520个大气压)；低压液相色谱(LPLC，<5个大气压)快速色谱(flash chromatography，约2个大气压)等。 第三节 中药有效成分化学结构的研究方法意义：为探讨有效成分的生物活性、构效关系、体内代谢以及进行结构改造、人工合成等研究提供必要的依据。前提：必须是单体化学成分，这是鉴定化学结构的前提。纯度检验：平面色谱或柱色谱用两种以上溶剂系统或色谱条件进行检测，显示单一的斑点或谱峰，结晶样品的熔距为小于2，液体样品的沸程在5以内。一、中药有效成分的理化鉴定1物理常数的测定物理常数的测定包括熔点、沸点、比旋度、折光率和比重等的测定。2分子式的确定目前最常用的是质谱法（MS）。高分辨质谱法（HR-MS）可给出化合物的精确分子量，查表得到化合物的几个可能分子式。也可通过质谱中出现的同位素峰的强度推定化合物的分子式。分子离子峰不稳定的化合物，难以用HR-MS测出，可用自动元素分析仪进行定性定量分析，得到一个化合物的实验式后，用场解吸质谱、快原子轰击质谱或制备衍生物再测定其质谱等方法测定它的分子量，以求得化合物的分子式。3化合物的结构骨架与官能团的确定化合物不饱和度的计算，了解可能含有的双键数或环数。用化学法推定分子结构骨架主要依靠各类中药化学成分的呈色反应：如羟基蒽醌类化合物通过碱液显色反应（Bornträger反应）检识；黄酮类化合物可用盐酸镁粉反应、四氢硼钠还原反应等鉴定；强心苷类化合物可利用甾体母核、，-五元不饱和内酯环和-去氧糖的呈色反应结合化合物的理化性质，提取分离时的表现，综合考虑加以判断。二、中药有效成分的波谱测定1IR光谱化合物用量：510g；测定范围：在波数4000500cm-1间，其中1600cm-1以上为化合物的特征基团区，1000500cm-1为指纹区。如果被测物结构基本已知，可能某一局部构型不同，在指纹区就会有差别，如25R与25S型螺甾烷型皂苷元，在980860cm-1附近有显著区别，很容易鉴别。2UV光谱 一般来说，UV光谱主要可提供分子中的共轭体系的结构信息，可据此判断共轭体系中取代基的位置、种类和数目。对某些具有共轭体系类型的中药有效成分，如蒽醌类、黄酮类以及强心苷类等成分的结构确定具有重要的应用价值。3NMR谱NMR谱是化合物分子在磁场中受电磁波的辐射，有磁距的原子核吸收一定的能量产生能级的跃迁，即发生核磁共振，以吸收峰的频率对吸收强度作图所得之图谱。NMR谱能提供分子中有关氢及碳原子的类型、数目、互相连接方式、周围化学环境、以及构型、构象的结构信息。随着超导核磁的普及，各种同核（如1H-1H、13C-13C）及异核（如1H-13C）二维相关谱的测试与解析技术等的开发应用日新月异，显示其重要性。（1）1H-NMR谱1H-NMR谱的化学位移()范围在020ppm。正常1H-NMR谱技术，能提供的结构信息参数，主要是化学位移()、偶合常数(J)及质子数。1H核因周围化学环境不同，其外围电子云密度及绕核旋转产生的磁屏蔽效应不同，不同类型的1H核共振信号出现在不同区域，据此可以识别。偶合常数是磁不等同的两个或两组氢核，在一定距离内因相互自旋偶合干扰使信号发生裂分，其形状有二重峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)及多重峰(m)等。裂分间的距离为偶合常数(J)。各种不同环境下1H核相邻结构具有一定的偶合常数值。除了正常1H-NMR谱技术外，还有一些帮助结构分析的辅助技术，如选择性去偶、重氢交换、加入反应试剂、各种双照射等。应用较多的双照射技术是核增益效应 (NOE)。NOE是在核磁共振中选择地照射一种质子使其饱和，则与该质子在立体空间位置上接近的另一个或数个质子的信号强度增高的现象。它不但可以找出互相偶合的两个核的关系，还可以反映出不互相偶合，但空间距离较近的两个核间关系。如五味子酯甲的联苯双酯部分有二个芳氢，1H-NMR示二个单峰,值分别为6.76、6.43，这两个单峰的归属可用双照射的NOE技术予以确定。照射3.64的甲氧基，发现位于6.76的芳氢峰增益l9%，照射另外三个甲氧基，均未见到NOE现象，故推测位于甲氧基邻位的芳氢值为6.76，位于亚甲二氧基邻位芳氢的值为6.43。 五味子酯甲（2） 13C-NMR谱 13C-NMR谱的化学位移范围为0250ppm，比1H-NMR谱大得多，是中药化学有效成分结构测定中最重要手段之一。13C-NMR谱提供的结构信息是分子中各种不同类型及化学环境的碳核化学位移，异核偶合常数(JCH)及驰豫时间(T1)，其中利用度最高的是化学位移(c)。常见的13C-NMR测定技术如下。 质子宽带去偶： 也称质子噪音去偶或全氢去偶。此时H的偶合影响全部被消除，从而简化了图谱。在分子中没有对称因素和不含F、P等元素时，每个碳原子都会给出一个单峰，互不重叠。因照射H后产生NOE现象，连有H的C信号强度增加。季碳信号因不连有H，表现为较弱的峰。 偏共振去偶： 在偏共振去偶谱中，每个连接质子的碳有残余裂分，故在所得图谱中次甲基(-CH)碳核呈双峰，亚甲基(-CH2)呈三重峰，甲基(-CH3)呈四重峰，季碳为单峰强度最低。由此可获得碳所连接的质子数、偶合情况等信息。 INEPT（低灵敏核极化转移增强法）：用调节弛豫时间()来调节CH、CH2、CH3信号的强度，从而有效地识别CH、CH2、CH3。当1/4（JCH）时, CH、CH2、CH3皆为正峰；当2/4（JCH）时, 只有正的CH峰；当3/4（JCH）时, CH、CH3为正峰, CH2为负峰。由此可以区分CH、CH2和CH3信号。再与质子宽带去偶谱对照，还可以确定季碳信号。季碳因为没有极化转移条件，所以在INEPT谱中无信号。 DEPT（无畸变极化转移增强法）：是INEPT的一种改进方法。在DEPT法中，通过改变照射1H的脉冲宽度()，使为45o、90o、和135o变化并测定13C-NMR谱。所得结果与INEPT谱类似。当=45o时，所有的CH、CH2、CH3均显正信号；当=90o时，仅显示CH正信号；当=135o时，CH和CH3为正信号，而CH2为负信号。季碳同样无信号出现。图2-10、2-11、2-12分别为-紫罗兰酮质子宽带去偶谱，偏共振去偶谱及DEPT谱。图2-10-紫罗兰酮质子宽带去偶谱图2-11-紫罗兰酮偏共振去偶谱图2-12-紫罗兰酮DEPT谱(3) 二维核磁共振谱（2D-NMR谱） 二维化学位移相关谱(相关谱，简写为COSY)是2D-COSY谱中最重要、也是最常用的一种测试技术。2D-COSY谱又分为同核和异核相关谱两种。相关谱的二维坐标Fl和F2都表示化学位移。在中药有效成分结构研究中常用的相关谱类型如下。 同核化学位移相关谱 lH-1H COSY也称氢-氢化学位移相关谱，是同一个偶合体系中质子之间的偶合相关谱。可以确定质子化学位移以及质子之间的偶合关系和连接顺序。图谱多以等高线图表示。对角线上的峰为一维谱，对角线两边相应的交叉峰与对角线上的峰连成正方形，该正方形对角线上的两峰即表示有偶合相关关系。例如，在化合物3,4-二羟基苯乙醇-8-O-D-葡萄糖苷的1H-1H COSY（图2-13）谱中可见苷元苯乙醇的7-H(2.65) 与8-H(3.90，3.65)有交叉峰。此外，在1H-1H COSY谱能找到葡萄糖基上氢与氢的偶合关系。 1H检测的异核化学位移相关谱 异核化学位移相关谱特别是13C-lH COSY谱，对于鉴定化合物的结构是十分重要的方法，常用的有HMQC谱和HMBC谱。HMQC谱是通过lH核检测的异核多量子相关谱(简称HMQC), 此谱能反映 lH核和与其直接相连的13C的关联关系，以确定C-H偶合关系（1JCH）。在HMQC谱中，Fl域为13C化学位移，F2域为lH化学位移。直接相连的13C与lH将在对应的13C和lH化学位移