烟草青枯病ppt课件.ppt
烟草青枯病,黄俊斌 教授刘海龙 黎妍妍,研究背景,烟草是一种重要的经济作物，是烟区人民脱贫致富的主要经济来源，但是烟草的病害发生严重，尤其是烟草青枯病，几乎分布于世界上所有烤烟种植区。烟草青枯病是由茄科雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）引起,1864年在印度尼西亚首先报道。,该病在我国长江流域及其以南烟区普遍发生，其中以广东、福建、台湾、湖南、湖北、江西、广西东部、安徽南部、四川及贵州局部烟区为害严重，个别年份常常暴发流行，造成毁灭性损失。,一、症状,正常,萎蔫,典型症状是叶片萎蔫，部分叶片变黄，茎上出现长形黑褐色条斑，有的条斑扩展到病株顶部，根部变黑腐烂。,枯萎,茎干变褐,叶肉病变,茎干变褐,研究内容,二、病原菌的分离和鉴定 1.病原菌的分离 采用稀释划线分离法。将烟草病株基部的茎杆表面用清水洗净晾干，75的酒精表面消毒，在含有无菌水的培养皿中研磨病组织。用移菌环蘸取少量菌液在TTC培养基（青枯菌选择培养基）上划线，30培养48h。,TTC平板培养48h后青枯菌菌株的菌落形态TTC培养基：NA培养基中加入三苯基四氮唑（TTC）.,烟草青枯菌分离菌株来源,2 病原菌的纯化和保存 从TTC培养基上挑取呈不规则圆形，中心淡粉红色，周围白边较宽，流动性强的单菌落进行纯化，2-3次后，用接种环挑取少量细菌于灭菌水中20保存。3 青枯菌的分子鉴定 通过常规PCR，利用青枯菌种的特异性引物759760，对分离获得的菌株进行分子鉴定，根据扩增结果来确定是否为青枯菌。,引物序列：759：GTCGCCGTCAACTCACTTTCC 760：GTCGCCGTCAGCAATGCGGAATCGPCR扩增采用25L反应体系，其中10PCR buffer 2.5L，Taq酶2U，MgCl21.5mM，dNTPs200M，引物759和760各1L，DNA 5L。反应程序为：952 min；9420s，30 6830s，7230s；72延伸10min。,3.青枯菌的分子鉴定结果,扩增结果表明：所有分离获得的供试青枯菌菌株均可扩增得到280bp左右的特异性片段。,分离菌株的特异性PCR鉴定结果,注：1-22、24-46分离的烟草青枯菌；23：阴性对照；M：1000bp Marker（自上而下片段大小分别为：1000bp，700bp，500bp，400bp，300bp，200bp，100bp）,280bp,280bp,280bp,三、烟草青枯菌菌系分化研究1.青枯菌生理小种鉴定供试菌株：从湖北恩施地区烟草青枯病病株上分离的54个青 枯菌菌株。鉴别寄主：烟草、番茄、茄子、马铃薯、花生和辣椒接种方法：1mL细菌悬浮液（浓度为108cfumL），注射到5-7叶期的寄主茎基部。培养条件：温度30，相对湿度80%以上。小种划分：接种7天后，调查接种植株的抗感反应，根据Budenhagen、华静月等人制定的生理小种划分标准，确定菌株的生理小种归属。,烟草青枯菌接种生理小种鉴别寄主,鉴定结果表明：54个烟草青枯菌菌株接种6种鉴别寄主均能使其致病，发病率均为100%，侵染的植物种类范围符合生理小种1号的侵染范围，因此可将供试菌株划分为生理小种1号。,2.烟草青枯菌生化型测定 根据菌株对3种双糖（乳糖、麦芽糖、纤维二糖）和3种己醇（甘露醇、山梨醇和甜醇）的利用程度，将菌株划分为不同的生化型。,注：“+”代表能利用（培养基变黄），“”代表不能利用（蓝色）,青枯菌生化型划分标准,根据何礼远、华静月等提出的青枯菌5型划分标准，对分离菌株进行生化型划分，标准如下：,生化型测定结果表明：54个烟草青枯菌菌株均能利用3种双糖和3种己醇，根据青枯菌生化型划分标准鉴定均为生化型。,甜醇,山梨醇,甘露醇,纤维二糖,乳糖,麦芽糖,菌株对3种己醇和3种双糖的利用（左为CK，右为接菌）,3.烟草青枯菌演化型鉴定 参照Fegan和Prior的方法，用7条引物扩增青枯菌株DNA，根据扩增的片段大小确定供试菌株的演化型。,DNA提取：用TaKaRa试剂盒提取菌株的DNA。PCR扩增采用25L反应体系，其中包括：10PCR buffer 2.5L，Taq酶2U，MgCl21.5mM，dNTPs 200M，引物759和760各4pmol，引物Nmult21:1F，Nmult21:2F，Nmult23:AF，Nmult22:InF，Nmult22:RR各6pmol，DNA模板50ng。,反应程序为：965 min；9415s，30 5930s，7230s；72延伸10min。取5LPCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压5Vcm，通过Biorad凝胶成像仪观察结果。,反应程序为：965 min；9415s，30 5930s，7230s；72延伸10min。取5LPCR产物于2%的琼脂糖凝胶中电泳，电压5Vcm，通过Biorad凝胶成像仪观察结果。,280bp,144bp,四、青枯菌的寄主范围,青枯菌的寄主范围非常广泛，可侵染包括54个科的450余种植物，如烟草、番茄、茄子、辣椒、花生、马铃薯、桑树、油橄榄、甘薯等。,五、烟草青枯病田间发生动态研究调查地点：湖北恩施州宣恩县和咸丰县烟田调查时间：2019年6-8月调查方法：采用双行平行跳跃法定点定株调查调查内容：发病时期，发病率，气候条件等。,按照国家标准(GB/T23222-2019)，以株为单位分级调查，分级标准如下：0级：全株无病；1级：茎部偶有褪绿斑；3级：茎部有黑色条斑，但不超过茎高1/2；5级：茎基部黑色条斑超过茎高1/2，但未到达茎顶部；7级：茎部黑色条斑到达茎顶部，或病株叶片全部萎；9级：病株基本枯死。,2019年咸丰点烟草青枯病发生情况,始发期6月20日，发病率为3.33%，病情指数为0.37，随着日平均气温达到25，7月中旬进入盛发期，8月底发病率达到90%以上，病情指数达37以上。,2019年宣恩点烟草青枯病发生情况,始发期为6月8日，发病率为2.86%，病情指数为0.22，随着日平均气温达到26，6月下旬烟草青枯病进入盛发期，8月中旬发病率达到93%以上，病情指数达到40以上。,两个地区烟草青枯病始发期都在6月中旬，随着时间的延长，发病率和病情指数逐渐升高，7月下旬进入盛发期，8月中旬进入稳定期。,六、烟草青枯病防治,1、筛选和利用抗病品种 参试共计46个烟草品种 苗期温室鉴定：伤根灌菌接种法，接种条件：温度28-30，RH80%。接种后定期（接种后第5d、7 d、10 d、15d、21d）调查发病情况。大田病圃鉴定：烟株旺长初期，用小铁铲从烟株茎基部斜插人土使侧根受伤，随后浇灌菌液。每隔10 d 调查1 次发病情况。接种浓度：1108 CFU/mL。,参试烟草品种,青枯病严重度分级标准(GB/T 23222-2019),烟草品种抗病性鉴定标准(GB/T 23224-2019),苗期鉴定结果,苗期鉴定结果：华农温室,以抗病品种（Coker176、毕纳1号、D101）为砧木，云烟87（感病品种）为接穗品种采用靠接法进行了嫁接。,2、嫁接防病,团棵期嫁接烟株表现,打顶期嫁接烟株表现,可调节角度的嫁接刀，专利号：ZL 2019 2 0354249.3,打顶期调查嫁接云烟87植株的青枯病发病率为10.87%18.42%，未嫁接的植株发病率为78.95%，其中尤以D101为砧木的嫁接云烟87植株抗病效果最好。,嫁接烟株防病效果,3、生物防治（1）植物源农药：大蒜素等。（2）生防菌：荧光假单胞菌，枯草芽孢杆菌等。4、化学防治 农用链霉素，硫酸链霉素，青枯立克等。,Thank you,拯畏怖汾关炉烹霉躲渠早膘岸缅兰辆坐蔬光膊列板哮瞥疹傻俘源拯割宜跟三叉神经痛-治疗三叉神经痛-治疗,
