核酸分子杂交技术ppt课件.ppt

,第七章 核酸分子杂交技术,第一节 分子杂交的基本原理及主要类型,一、核酸分子杂交的基本原理,一、核酸分子杂交的基本原理,一、核酸分子杂交的基本原理,1.什么是探针？,2.探针要看得见,3.要变性和复性,4.要固定,二、探针(Probe),以特定的靶核酸序列(病原微生物DNA或RNA的特异性片段)为模板，人工合成碱基互补序列，带有放射性或生物素标记的单链DNA片段。(1)DNA探针(2)RNA探针(3)寡核苷酸探针,1.什么是探针？,1)探针标记物1)放射性标记物：32P、3H2)非放射性标记物：地高辛、生物素、荧光特性：I.高度的敏感性；II.标记物与探针结合后，不影响杂交时碱基配对及探针分子的主要理化性质；III.检测方法除有高灵敏性、高特异性、假阳性绿低外，尚需考虑环境污染少，价格低；IV.若用酶促方法标记，应对酶的Km值影响不大，以保证标记反应的效率和标记产物的比活性。,2.探针要看得见,二、探针(Probe),1)变性和复性(1)变性：在一定条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，DNA分子成为单链，形成无规则线团的过程。(2)复性：变性DNA只要消除变性条件，具有碱基互补区域的单链又可以重新结合形成双链的过程。(3)杂交：单链的核酸分子在合适的条件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双链杂交体的过程称核酸分子杂交。,3.变性和复性,二、探针(Probe),4.要固定,二、探针(Probe),1.核酸分子杂交的类型(1)杂交分子类型：DNA与DNA，DNA与RNA等；(2)杂交介质类型：固相杂交、原位杂交、液相杂交。,三、分子杂交的类型和步骤,三、分子杂交的类型和步骤,1.固相杂交1)平板培养；2)使菌落粘附在薄膜上；3)细菌裂解、变性DNA；4)将DNA烘干固定在膜上，与32P标记的探针杂交；5)放射自显影检测杂交信号，并与主板上菌落进行对位，确定阳性克隆。,三、分子杂交的类型和步骤,三、分子杂交的类型和步骤,概述,三、分子杂交的类型和步骤,概述,三、分子杂交的类型和步骤,1.Southern印迹杂交,三、分子杂交的类型和步骤,1.Southern印迹杂交,4.基因芯片,2.主要步骤固相杂交的主要步骤：核酸分子结合在固相支持介质、杂交和杂交后信号检测。1)核酸与固相介质结合：硝酸纤维素莫、尼龙膜等。,三、分子杂交的类型和步骤,2.主要步骤固相杂交的主要步骤：核酸分子结合在固相支持介质、杂交和杂交后信号检测。1)核酸与固相介质结合：硝酸纤维素莫、尼龙膜等。2)杂交：预杂交、杂交和洗脱。,三、分子杂交的类型和步骤,1.探针及标记方法的选择2.探针的浓度3.杂交的最适温度4.杂交的严格性5.杂交反应时间,四、核酸分子杂交条件及优化,第二节 荧光原位杂交技术的临床应用,多种荧光数码片,End,