大环内酯类药物抗菌作用分子机制及其支原体耐药性研究进展.docx

大环内酯类药物抗菌作用分子机制及其支原体耐药性研究进展吴聪明中国农业大学动物医学院 大环内酯（Macrolides）类药物是由链霉菌产生或半合成的一类以一个大环内酯为母体，通过羟基，以苷键和13个糖分子相连而成的弱碱性抗生素。按其内酯环上碳原子数的不同，分为十四、十五和十六元环内酯类抗生素。自1952年Lilly公司将红霉素成功开发上市以来，迄今已开发出大环内酯药物逾百种，用于临床的已有十几种。大环内酯类抗生素除对革兰氏阳性菌有较强的抗菌活性外，对耐青霉素金黄色葡萄球菌、部分革兰氏阴性菌、部分厌氧菌、支原体、衣原体、军团菌、胎儿弯曲杆菌、螺旋体和立克次氏体等均有抗菌活性，比氨基甙类、四环素类和多肽类等抗生素的毒副作用和不良反应低，无青霉素类抗生素的严重过敏反应，因此在临床上获得广泛应用。为了克服红霉素等第一代大环内酯类抗生素对酸不稳定、易产生耐药性、胃肠道刺激强等弱点，各个国家竞相对大环内酯类药物原有结构进行改造，获得了一系列抗菌活性更强、药动学参数更优的第二代大环内酯类药物（包括罗红霉素、地红霉素、氟红霉素、克拉霉素、阿齐霉素等）。第二代大环内酯类抗生素具有：1）对酸稳定，口服生物利用度高；2）血浆药物浓度、组织体液及细胞内药物浓度高；3）血浆半衰期延长；4）胃肠道反应轻等特点。但其抗菌谱、临床适应证与第一代大环内酯类抗生素相似，仍易诱导耐药性。因此以扩展抗菌谱，增强抗菌活性，克服诱导耐药性为方向，开始了第三代大环内酯类药物的研究，至今已开发出了酮内酯（Ketolides）、酰内酯（Acylides ）、氮内酯（Azzilides）等大环内酯药物新亚类，其中酮内酯类的泰利霉素（telithromycin）已被批准用于临床，有效控制了多重耐药肺炎链球菌等感染（1-4）。新型大环内酯类药物研发方兴未艾，但随着大环内酯类药物在人医及兽医临床上的广泛应用，肺炎链球菌、支原体等病原菌对其耐药性逐渐上升，严重影响了该类药物的疗效（5-8）。阐明药物的抗菌作用机制及耐药机制，是指导临床合理用药，设计开发更好药物的先决条件。本文对大环内酯类药物的抗菌作用机制尤其是分子机制文献进行了综述，并跟踪了支原体对大环内酯类药物耐药性的研究进展。大环内酯类药物抗菌作用分子机制一、 大环内酯药物的结合靶位十四元大环内酯类红霉素（Erythromycin）、克拉霉素（Clarithromycin）、地红霉素（Dirithromycin）、罗红霉素（roxithromycin）、十五元大环内酯类阿奇霉素（Azithromycin）以及十六元大环内酯类螺旋霉素（Spiramycin）、交沙霉素（Josamycin）、泰乐菌素（Tylosin）和麦迪霉素（Midecamycin）等在结构上与红霉素相似，与细菌的靶结合位点也与红霉素基本相同。一些不属于大环内酯类的抗生素，如林可胺类（Lincosamide）和链阳性霉素B（Streptogramin B）虽然与大环内酯类的分子结构不同，但因为它们与大环内酯类药物同细菌rRNA的结合位点存在较大的重叠，故称为MLSB药物。 大环内酯类药物对细菌的作用靶位是核糖体，细菌核糖体由30S小亚基和50S大亚基组成，大亚基又由23S rRNA和核糖体蛋白组成，23S rRNA分个域，根据碱基互补配对原则折叠成二级结构，并与核糖体蛋白作用维持其立体构象（见图一）。早前利用生化和遗传学技术绘制了大环内酯类药物在细菌核糖体大亚基上的结合作用部位（9-14）。但有关各种大环内酯类药物与核糖体相互作用的详细分子机制，却在成功获得几种细菌核糖体大亚基及其与抗生素复合体的晶体结构以后，才开始得以阐明（15-18）。核糖体及其抗生素复合体晶体衍射证实了RNA是构成大环内酯类药物结合靶位的主要成分（见图四）。即23S rRNA域内的许多核苷残基与大环内酯类药物分子相互作用，尤其是，十四、十五、十六元内酯环上C5位的单糖或二糖侧链与rRNA之间形成了强烈相互作用。红霉素和其它十四元环药物的脱氧氨基糖（desosamine，德糖胺）侧链与23S rRNA域A2058和A2059（按E.coli核苷酸序列编号）分子上的氮原子形成氢键。23S rRNA域2611-2057位的碱基尤其是2057位的核苷，也可能与十四元内酯环C5位的脱氧氨基糖形成氢键（18），还可直接与内酯环产生疏水作用（16）。此外，脱氧氨基糖侧链还能与G2505的磷酸骨架发生相互作用，十六元内酯环C5位的碳霉胺糖-碳霉糖（mycaminose-mycarose）侧链也能与2058位的腺苷形成氢键，表明该位置核苷是所有大环内酯药物的主要结合部位之一。泰乐菌素、碳霉素A（carbomycin A）和螺旋霉素C5位的碳霉胺糖-碳霉糖还可能与23S rRNA域的其它区域产生疏水作用。内酯环C5位的糖基与2057-2059之间的相互作用可解释为什么该部位的核苷突变或2058位腺苷二甲基化可造成大环内酯类药物耐药性（18）。内酯环与核糖体之间的相互作用可占药物自由结合能的25%（19）。其中内酯环与23S rRNA域2057-2059位碱基形成的疏水作用尤为突出（19）。Haloarcula marismortui的核糖体大亚基与十六元环泰乐菌素、碳霉素A和螺旋霉素形成的复合体结晶结构衍射（16）结果表明，内酯环C6位的乙醛基与23S rRNA域A2062的N6形成了一个可逆性的共价键，从而增强了这些药物的结合能。这种相互作用在十四元环红霉素和十五元环阿齐霉素不存在，因为它们内酯环的C6位是一个羟基或酯基，该结合作用可解释为什么细菌23S rRNA域2062突变可造成十六元环耐药而对十四、十五元环敏感性无影响。酮内酯是最近开发出的新三代大环内酯类药物。它们以内酯环C3位的克拉定糖被酮基取代为特征，多数酮内酯药物还含有烷芳基侧链及一个11，12-氨基甲酸。与结构改造前的大环内酯类药物相比，酮内酯药物与核糖体之间具有更强的结合力（20，21）。最近解析了酮内酯药物ABT-773与D. radiodurans核糖体复合体的结晶，结果未能获得酮内酯亲和力提高的分子线索。红霉素及其它十四元环药物的内酯环上11，12位的羟基能与23S rRNA 的U2609形成氢键。在ABT-773（及其它酮内酯药物）结构上由氨基甲酸取代了羟基，在D. radiodurans 50S 亚单位中也与能与U2609形成氢键。生化证据表明这种相互作用对酮内酯比对红霉素及其它十四元环药物更重要，因为U2609C可造成细菌对酮内酯耐药而对其它药物无影响（19）。但是，这种突变的重要意义未能在晶体结构上获得证据。生化和遗传学证据表明各种大环内酯类药物包括红霉素、酮内酯和泰乐菌素与23S rRNA 域内的35螺旋（helix 35）还存在相互作用（10，14）。细菌23S rRNA 的35螺旋发生突变或转录后修饰可引起大环内酯低水平耐药（14，22）。晶体结构显示十六元环泰乐菌素的粘多糖（mucinose）侧链完全可到达35螺旋并与之结合（19），但却没有发现十四元环红霉素、ABT-773和阿齐霉素与35螺旋的相互作用（18）。目前，除酮内酯11，12-氨基甲酸与23S rRNA 的U2609存在相互作用外，在晶体衍射研究中还未发现酮内酯侧链与核糖体之间存在其它相互作用，因此，酮内酯11，12-氨基甲酸与U2609之间的相互作用可能是该类药物与23S rRNA结合力进一步增强的主要因素。大环内酯药物分子通过其功能基团与核糖体的23S rRNA之间形成的疏水作用和氢键作用（一些十六元环药物还存在共价键作用）限制在作用靶位，这些与rRNA的相互作用占据了 药物分子大部分的结合自由能。此外，一些大环内酯类药物还能与核蛋白的L4和/或L22域相互作用。如泰乐菌素的粘多糖侧链与L22相互作用，螺旋霉素的糖胺（furosamine）残基与L4相互作用（19）。核蛋白与大环内酯分子之间的相互作用可解释为什么核蛋白L22和L4域的编码基因突变可引起大环内酯类药物耐药（23-26）。二、 大环内酯类药物抗菌作用的分子机制大环内酯类药物对蛋白质合成抑制的详细分子机制取决于药物特定的化学结构。因为药物分子结构影响其与核糖体的相互作用及抑制作用方式。大环内酯类药物对蛋白质合成抑制可归纳为四种方式：1）在翻译早期抑制新生肽链的延伸（27，28）；2）促使肽基转移RNA从核糖体上的解离脱落（29）；3）抑制多肽键的形成（27）；4）干扰50S 亚单位的组装（26）。以上大环内酯类药物的作用方式与它们在细菌核糖体上的结合靶位有关。大环内酯类药物的结合靶位在核糖体大亚基内新生肽出口通道的肽基转移酶中心附近。药物分子内酯环C5位的糖基伸至肽基转移酶中心，十六元环泰乐菌素、螺旋霉素和碳霉素A（carbomycin A）C5位的碳霉胺糖-碳霉糖侧链较长，可伸至肽基转移酶的活性部分直接干扰肽键形成的催化过程（16，30）。十四元环红霉素等药物分子由于C5位的脱氧氨基糖残基较短，达不到肽基转移酶位置，从而使得它们缺乏转肽作用的抑制效应（31-33）。大环内酯类药物对蛋白合成抑制的主要机制与它们结合在新生肽出口通道有关。出口通道主要由23S rRNA构成，通道始于肽基转移酶中心，跨越整个亚单位后开口于另一侧表面（见图二、图三）（15，34-36）。早期认为核糖体内新生肽的合成过程中这个通道是惰性的、不活动的，事实上整个通道是一个极其活跃的功能单元（37）。研究表明，核糖体与通道内的新生肽相互作用，影响蛋白合成的延伸过程及核糖体肽基转移酶的催化反应（28，38，39）。通道相对较宽（平均约15埃），但距离肽基转移酶中心不远却有一个由糖蛋白L4和L22域形成的狭窄部（宽约10埃）。大环内酯类药物紧紧接合于这个狭窄部，对正在生长延伸的多肽链起着分子路障（molecular road block）作用（16，18，37）。刚开始几个氨基酸可自如形成新生肽，但当新生肽延生长伸达到通道的狭窄部时，如果有药物结合于该位置，则阻抑多肽的顺畅通过迫使多须的延伸过程停止下来。一旦多肽合成受到抑制，肽基转移RNA也就会从核糖体上解离脱落下来。至今仍未能确定结合有大环内酯药物的核糖体所能催化新生肽生长的长度。在聚腺苷依赖（poly (A)-dependent）无细胞翻译系统中，大环内酯可引起二-赖氨酸的积聚，但抑制了更长肽链的合成；在聚尿苷依赖（poly (U)-dependent）蛋白合成系统中，红霉素引起了二-苯丙氨酸、三-苯丙氨酸的积聚，而抑制了更长肽链的生成（32，33）。最近从人工合成mRNA驱动的体外翻译系统中观察到红霉素可引起携带6-8个氨基酸肽链的肽基转移RNA积聚，这种现象似乎与以上述红霉素对短肽延伸抑制情况相矛盾。此外，酮内酯类药物替利霉素（telithromycin）可使核糖体合成9-12氨基酸的新生肽。模型研究表明肽基转移酶中心至大环内酯结合狭窄部的间距仅仅适合容纳6-8个氨基酸（18）。因此，红霉素为什么会影响二肽的延伸？替利霉素为什么又会让12氨基酸的新生肽合成？是否新生肽以特定方式在核糖体内折叠？是否在大环内酯类药物抑制作用下新生肽生长长度取决于肽内氨基酸的构成及序列？目前仍不得而知。可能长肽链在生长过程中比短肽链更易受到抑制。此外，由于大环内酯类药物分子和新生肽竞争同一出口通道，如果特定肽链同大环内酯类药物分子一样与出口通道壁之间存在亲和力，则有可能通过竞争将药物分子从结合部位挤出，如果是这样，不同蛋白合成受大环内酯类药物分子抑制的程度就会存在差异，差异性取决于药物结构、新生肽结构、药物分子和新生肽与核糖体之间的相互作用。大环内酯类药物干扰核糖体组装可能进一步增强了它们对蛋白合成的抑制作用（40，41）。50S大亚基是由23SrRNA、5SrRNA和20多种蛋白组装而成的,组装过程中先后有32S、42S中间产物产生。当细菌生长环境中存在大环内酯药物分子时，中间产物可能会和药物分子结合上，从而影响了特定分子构象重排，阻止了具完整功能50S大亚基的组装，无功能的50S大亚基中间产物因不能进一步形成有功能的核糖体而最终被核糖核酸酶降解掉（42）。目前仍未完全阐明大环内酯类药物对核糖体组装抑制的详细过程，由于组装抑制发生在整个蛋白合成抑制的背景下，目前仍不明白是否组装抑制造成的核糖体减少会加剧蛋白合成抑制程度。图一 大肠杆菌23SrRNA二级结构II域35发夹（Hairpin 35）和V域中心环框内放大示意；圆圈中的核苷酸为大环内酯类药物主要结合靶位图二 核糖体新生肽出口通道内的红霉素作用部位（正向观）23S rRNA为亮紫色； 5S rRNA为绿色； 核蛋白为暗紫色； 红霉素为红色图三 新生肽通道内红霉素作用部位（侧面观）rRNA和核蛋白分别以亮灰色和深灰色表示；P-site-bound tRNA以蓝色表示；新生肽以金黄色表示；红霉素分子以红色表示图四 细菌（D. radiodurans）核糖体50S亚基内红霉素的结合靶位（立体观）抗生素为绿色；核蛋白L4和L22为黄色；与红霉素分子相互作用的核苷酸序号对应大肠杆菌23S rRNA核苷酸序号三、 深入研究大环内酯类药物的抗菌作用机制大环内酯类药物是人医和兽医防治感染性疾病的重要药物，人们这类药物的研究开发方兴未艾。阐明大环内酯类药物的抗菌作用机制尤其是药物分子与细菌核糖体之间相互作用的分子机制，是改造该类抗菌药物避免细菌耐药性的理论基础。对大环内酯类药物的抗菌作用机制研究已经取得了很大的进展，但还有许多细节问题尚未阐明。如在大环内酯类药物抑制核糖体的翻译过程中大环内酯类药物抑制合成的新生肽长度以及延伸抑制与新生肽序列的关系，在大环内酯类药物抑制50S大亚基组装的过程中药物分子究竟与50S大亚基什么样的中间产物结合以及它们的结合靶位等问题，大环内酯类药物分子诱导肽基转移RNA解离动力学的详细过程，是否所有蛋白翻译都被抑制到同一程度，一些蛋白翻译被大环内酯类抑制比其它被抑制更有效？等等问题。 相信随着更多核糖体及其药物复合体晶体结构的获得及解析，会获得更多的证据解答上述未明问题，全面阐明大环内酯类药物抗菌作用机制及细菌耐药机制，指导新药研制，指导临床合理用药，控制细菌耐药性，保护人类健康。支原体对大环内酯类药物耐药性的研究进展一、 支原体的固有耐药性各种支原体（Mycoplasmas）对大环内酯类药物呈现不同的固有耐药表型。人源支原体中，肺炎支原体（M. pneumoniae）（43）对所有MLSKs均敏感；人型支原体（M. hominis）（44）对十四、十五元环内酯、酮内酯 (telithromycin)、奎奴普丁（Quirupristin）耐药而对十六元环内酯（螺旋霉素、泰乐菌素除外）和林可胺类药物敏感；发酵支原体（M. fermentans）（44）对十四、十五元环内酯耐药而对十六元环内酯和林可胺类药物敏感。动物源支原体中，肺支原体(M. pulmonis)（45）对十四、十五元环内酯耐药而对十六元环内酯(对螺旋霉素和麦迪霉素MIC稍高)和林可胺类药物敏感；猪肺炎支原体（M. hyopneumoniae）（46）对十四元环内酯耐药而对十六元环内酯和林可胺类药物敏感；鸡毒支原体（M.gallisepticum）和衣阿华支原体(M.iowae) （47）对十四、十六元环内酯和林可胺类药物敏感均敏感；滑液支原体(M.synoviae) （47）对红霉素耐药而对泰乐菌素敏感。此外，絮状支原体（M. flocculare）(48)对十四元环内酯耐药而对十六元环内酯和林可胺类药物敏感。支原体固有的大环内酯类药物耐药表型多样化吸引人们对其耐药机理进行深入研究。Furneri等（49）对3株人型支原体（PG21、CT-PAF、CT-Mh1）进行研究。克隆测定菌株的23S rRNA基因域的DNA序列，并将测序结果与大肠杆菌及其它菌株进行比较，结果发现3株人型支原体23S rRNA 域中间环的2057位（对应大肠杆菌序号）为腺嘌呤（A）。红霉素敏感肺炎支原体23S rRNA 域的2057位（对应大肠杆菌序号）为鸟嘌呤（G）（43），已观察到大肠杆菌的23S rRNA 2057位发生GA 替换突变可造成红霉素耐药但仍对十六元环内酯和林可胺类药物敏感(35)。因此推测3株菌支原体的红霉素固有耐药表型与该突变有关。S.Pereyre 等（44）比较研究了人型支原体对十四、十五元环内酯类药物的固有耐药性和肺炎支原体对大环内酯类药物的天然敏感性的遗传基础。在确定人型支原体存在两个核糖体操纵子后，克隆测定两个核糖体操纵子上的23S rRNA基因核苷酸序列，以及核糖体蛋白L4和L22编码基因，并与大肠杆菌及其它肺炎支原体的对应序列进行比较，结果人型支原体和发酵支原体在两个操纵子上的23S rRNA 域核甘酸序列的2057位是腺嘌呤（A）而肺炎支原本是鸟嘌呤（G），人型支原体在2610位是尿嘧啶（U）而肺炎支原本是胞嘧啶（C）；人型支原体和发酵支原体在两个操纵子上的23S rRNA 域核甘酸序列752位是腺嘌呤（A）而肺炎支原体是胞嘧啶（C）；核糖体蛋白L4和L22基因序列测定没有找到其它菌种描述的与大环内酯类耐药性相关的氨基酸替换。放射标记红霉素开展积聚试验和结合试验，结果显示，肺炎支原体细胞比人型支原体细胞有更高水平的红霉素积蓄能力，人型支原体、发酵支原体的核糖体与红霉素的亲合力显著低于肺炎支原本的核糖体，因此推测人型支原体和发酵支原体的固有耐药表型可能由23S rRNA域的G2057A突变造成胞内靶位药物结合力降低所引起。人型支原体对十四、十五元环内酯类、林可霉素及替利霉素具有比发酵支原体更高的耐药性可能与其23S rRNA域的C2610U替换有关。23S rRNA 域没有23S rRNA 域保守，因此，尽管人型支原体和发酵支原体在752位是腺嘌呤（A）而肺炎支原体是胞嘧啶（C），但却难以将人型支原体、发酵支原体固有的大环内酯类耐药性与752位核苷联系起来。此外，积聚试验中加ATP水解抑制剂正钒酸盐（orthovanadate）可显著增加胞内14C红霉素浓度，提示人型支原体可能存在内源性的ABC转运子。因此也不排除细菌主动外排药物造成胞内药物水平降低而耐药的情况。对肺支原体、猪肺炎支原体、絮状支原本的23S rRNA基因核苷酸序列进行比较，发现它们也存在G2057A替换，因此认为这些菌株对十四元环内酯固有耐药、对十六元环内酯和林可胺类药物敏感的表型特征也是由于该G2057A替换的关系（44）。二、 支原体的诱导耐药性1995年之前还没有支原体对大环内酯类耐药的分子机制研究报道。Lucier等（50）首次研究报道了肺炎支原本对红霉素耐药性的分子机制。他们以红霉素诱导肺炎支原体M129模式株的耐药性，结果获得M129-ER1和M129-ER2两个突变子，对大环内酯-林可霉素-B型链阳性菌素（MLSB）表现高水平耐药，其中M129-ER1对十四元环内酯（红霉素和竹桃霉素）、林可胺类（林可霉素和克林霉素）表现出比M129-ER2更高耐药水平，而M129-ER2对十六元环内酯(麦迪霉素、螺旋霉素和泰乐菌素)表现出比M129-ER1更高耐药水平。测定23S rRNA基因域核苷酸序列，结果发现M129ER1株在中央环的2063位（大肠杆菌序号应为2058）发生了AG替换，M129-ER2株在2064位（大肠杆菌序号应为2058）发生了AG替换。与其它大环内酯类耐药菌株的23S rRNA基因域核苷酸序列进行对比分析，确定A2063G和A2064G两处点突变与菌株的耐药表型密切相关。突变子分离得到的核糖体与14C标记红霉素的亲和力显著降低于原M129株分离的核糖体也证实了这一点。同时分析得出，A2064G点突变可引起比A2063G点突变对十六元环内酯药物更高水平的耐药性。Pereyre等（43）进一步研究肺炎支原体M129株对多种大环内酯类药物及其它相关药物的诱导耐药性并探讨其耐药分子机理。在亚抑菌浓度（subinhibitory concentrations）下经过2350次传代诱导获得耐药突变子。除奎奴普丁(quinupristin)外，突变子对其它选择药物的MIC均有提高。克隆测定突变子23S rRNA基因II域和V域以及核蛋白 L4、L22 编码基因核苷酸序列并与原菌株M129比较，结果在红霉素A(Erythromycin A)、阿齐霉素（azithromycin）、交沙霉素(josamycin)、奎奴普丁-达福普丁(quinupristin-dalfopristin)和替利霉素（telithromycin）突变子中， 23S rRNA II 域没有发生突变，而V域发生了C2611A和A2062G（大肠杆菌序号）点突变；克林霉素(clindamycin)、替利霉素突变子在核蛋白L4中分别发生了H70R和H70L（肺炎支原体序号）单氨基酸突变；奎奴普丁-达福普丁和原始霉素（pristinamycin）突变子在核蛋白L4的60位(肺炎支原体序号)插入了1个、2个或3个相连甘氨酸；替利霉素突变子在核蛋白L22发生了P112R和A114T(肺炎支原体序号)替换以及111IPRA114（肺炎支原体序号）缺失。红霉素A和阿齐霉素经50次传代培养后，虽然在23S rRNA V域发生了C2611A突变，但突变子仍对各种大环内酯类及其它相关药物保持敏感性。Okazaki等（51）将从临床分离的141株肺炎支原体敏感株在含红霉素的培养基中传代培养。结果筛选出11株红霉素耐药肺炎支原体，其中3株在23S rRNA基因发生了A2063G（大肠杆菌应为2058位）点突变，对十四元环内酯类（红霉素和竹桃霉素）表现高水平耐药而对十六元环不明显；5株发生了A2064G（大肠杆菌应为2059位）点突变，对十四元环内酯类和十六元环均表现出高水平耐药；3株发生了A2064C点突变，耐药表型与A2064G点突变株相似。有趣的是，1株对红霉素、罗红霉素和克拉霉素低水平耐药的肺炎支原体不存在2063位和2064位点突变，可能存在其它耐药机制。Okazaki等（51）还从克林霉素和克拉霉素治疗无效的肺炎病人分离出1株肺炎支原体，克隆测序23S rRNA基因发现其存在A2063G点突变。Matsuoka等（52）检测了日本2000 - 2003年临床分离的13株大环内酯耐药肺炎支原体（12株高水平耐药M，1株低水平耐药）23S rRNA V域和 II 域，以及核蛋白L4 和 L22编码基因的耐药突变，结果10株在2063位发生了AG 替换突变（对应大肠杆菌2058位），1株发生了AC突变；1株在2064位（对应大肠杆菌2059位）发生了AG替换突变；低水平耐药株在2617 位（对应大肠杆菌2611位）发生了CG 颠换；23S rRNA II 域，以及核蛋白L4 和 L22编码基因核苷酸中未发生突变。说明肺炎支原体临床株大环内酯耐药主要由23S rRNA 中的2063位或 2064位点突变造成。Furneri等（53）在体外用交沙霉素诱导人型支原体PG21株的耐药性，并研究其耐药分子机理。获得PG-21/JR 和PG-21/JR2两个突变子，对十六元内酯类药物（交沙霉素和Miocamycin）耐药，但林可胺类药物（克林霉素和林可霉素）敏感。23S rRNA基因克隆测序表明，两个突变子的2062位（大肠杆菌序号）分别发生了A2062G和A2062T点突变，推测两个点突变与菌株的耐药表型有关。Pereyre等（44）从临床分离到两株交沙霉素耐药人型支原体MHb1和MHb2。MHb1对十六元环内酯类（交沙霉素、螺旋霉素、麦迪霉素、泰乐菌素）、替利霉素、林可胺类药物（林可霉素和克林霉素）均高水平耐药， MHb2对十六元环内酯类和替利霉素高水平耐药而对林可胺类药物仅中度耐药，两菌株对奎奴普丁-达福普丁和原始霉素仍敏感。克隆测定各菌株两个rRNA操纵子（rrnA和rrnB）上23S rRNA V域的核苷酸序列，发现MHb1一个操纵子（rrnB）发生了A2059G和C2611U（大肠杆菌序号）替换突变，而DNA MHb2相同操纵子（rrnB）仅发生了A2059G替换突变；两临床菌株与PG21模式株的23S rRNA II域35发夹（hairpin 35）的核苷酸序列相同；检测核蛋白L4和L22编码基因核苷酸序列，同样与PG21模式株一致。推测两株临床分离的人型支原体虽然仅一个操纵子等位基因发生突变，但杂合型等位基因也足以带来菌株的大环内酯类耐药表型，其中23S rRNA V域A2059G替换突变可造成菌株的十六元环内酯类药物耐药表型，而C2611U突变可能与菌株的林可胺类耐药性显著提高有关。红霉素、螺旋霉素、泰乐菌素等大环内酯类药物广泛用于防治畜禽支原体感染引起耐药性不断上升，但对动物源支原体大环内酯类耐药性的研究仍十分有限，现有文献多集中于耐药性调查及体外耐药性诱导方面。Kiser 等（54）最早开展大环内酯类抗生素体外诱导鸡毒支原体耐药性研究，发现鸡毒支原体极易对红霉素产生耐药性。Zanella等（55）在体外诱导鸡毒支原体对红霉素、螺旋霉素、泰乐菌素等大环内酯类抗生素的耐药性。结果不同药物之间的诱导耐药性的难易程度存在较大差异。红霉素和螺旋霉素耐药性只需5-8代诱导即可出现；而泰乐菌素耐药性则需9-11代诱导才出现。诱导耐药株对多种大环内酯类抗生素存在不完全交叉耐药性，泰乐菌素诱导耐药株对红霉素、螺旋霉素交叉耐药，而红霉素及螺旋霉素诱导耐药株对泰乐菌素仅敏感性有所降低，不存在交叉耐药性。Gautier-Bouchardon等（47）体外诱导鸡毒支原体，滑液支原体和衣阿华支原体对红霉素、泰乐菌素等药物的耐药性。结果3种支原体在红霉素及泰乐菌素作用下经2-6代后即可诱导出高水平耐药性。交叉耐药试验表明，泰乐菌素诱导的耐药株对红霉素也产生耐药，而红霉素诱导耐药株却不一定耐受泰乐菌素。衣阿华支原体比鸡毒支原体及滑液支原体更易诱导出大环内酯类耐药性，提示大环内酯类抗生素耐药性的诱导速度快慢受支原体种类及药物性质的影响。因此等推测衣阿华支原体比鸡毒支原体及滑液支原体有更高的突变率。Takahashi等（56）体外诱导鸡毒支原体对泰乐菌素的耐药性，经10次传代诱导获得的菌株对泰乐菌素的最小抑菌浓度仅比原始菌株提高8倍，与Zanella等和Gautier-Bouchardon等的研究结果存在差异。至今仍缺乏动物源支原体大环内酯类药物耐药性分子机制的研究报道。三、 支原体大环内酯类耐药性尚需深入研究的问题已有研究表明，细菌可通过药物主动外排、药物修饰失活、）药物靶位改变、产生抗性肽等四种途径对大环内酯类药物耐药（57）。综述可见，23SrRNA和核糖体蛋白突变是支原体对大环内酯类耐药的主要机制。至今未发现支原体内存在甲基转移酶编码基因（43，58）。已获得了由ABC型外排泵介导人型支原体对大环内酯类耐药的生理生化证据，在生殖道支原体、肺炎支原体（59）和猪肺炎支原体（60）内还发现了大量的ABC转运子及其编码基因。红霉素、螺旋霉素、泰乐菌素、吉他霉素等大环内酯类药物大量广泛用于防治食品动物支原体感染（如猪气喘病、鸡慢性呼吸道病等）而引起动物源支原体耐药性，造成药物疗效下降甚至失效，严重影响了支原体感染的有效防治，但至今对动物源支原体大环内酯类耐药性的机制研究仍十分有限。因此，今后应从以几个方面加强支原体大环内酯类耐药性研究：1） 加强动物源致病性支原体尤其是猪肺炎支原体和鸡毒支原体的大环内酯类耐药性机制研究。2） 深入开展支原体临床株的大环内酯类耐药性研究，获得支原体临床株核糖体RNA及核蛋白的耐药突变位点及突变发生频率，确定突变与耐药表型的关系。3） 进一步研究由ABC型外排泵介导支原体对大环内酯类耐药的分子机制。4） 建立快速检测方法监控人和动物致病性支原体大环内酯类耐药性的发生和发展。 参考文献1. 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