喜树替代紫茎泽兰过程中根际微生物群落特征.docx

喜树替代紫茎泽兰过程中根际微生物群落特征收稿日期: 2006* 基金项目:国家林业局林业有害植物调查专项资助，教育部重点项目（104191）,资助* 联系人: Tel: 0451-82191517祖元刚1, 高崇洋1, 王文杰1, 杨逢建1，刘英1, 王敏1 , 赵阳国2(1东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040; 2 哈尔滨工业大学市政环境工程学院，哈尔滨 150090)摘要：为研究我国重要经济树种喜树根际分泌物对根际微生物群落的影响，以及喜树在控制林业有害植物紫茎泽兰生物入侵的可行性，采用传统培养技术和分子生物学技术PCR-单链构象多态性(SSCP)、末端限制性片段长度多态性(TRFLP)-16S rDNA文库相结合对喜树(Ca)、紫茎泽兰(Ea)和二者混栽体系(CE)根际土壤中的真核微生物和真细菌微生物群落结构进行了比较。计数结果表明喜树、二者混栽以及紫茎泽兰根际中的真细菌数量依次减少而真核微生物数量依次增多。PCR-SSCP分析显示，紫茎泽兰根际土壤中真核微生物条带数量(多样性)远高于喜树和混栽根际，对部分条带克隆测序表明喜树根际中Meristolohmannia spp.为主要优势种群；TRFLP对真细菌结构分析表明，三种根际中真细菌群落多样性丰富，但没有差别，对喜树根际真细菌16S rDNA文库测序比较分析，共包含了10个已分类的门，其中Proteobacteria 门为优势菌群，占24.71%(其中-Proteobacteria 占17.65%)，Acidobacteria 门占16.47%，Bacteroidetes 门占10.59%。另外，色谱分析发现喜树和混栽根际土壤中分别含有较低浓度喜树碱和羟基喜树碱，而紫茎泽兰根际二者均检测不到。由此可见，紫茎泽兰的扩散和蔓延依赖于特有的真核微生物群落结构模式，并不改变真细菌群落的结构，喜树能够通过根系分泌物改变紫茎泽兰根际真核微生物群落结构模式，进而制约其外延。本研究将为喜树在紫茎泽兰生物替代中提供理论基础。关键词：喜树，根际微生物，紫茎泽兰，PCR-单链构象多态性技术(SSCP)，末端限制性片段长度多态性(TRFLP)，16S rDNA文库Characteristics of Microbial Community in Rhizosphere of Camptotheca Acuminata Mix-Cultured with Exotic Invasive Plant Eupatorium adenophorumZU Yuan-gang1, GAO Chong-yang1, WANG Wen-jie1, Yang Fengjian1, Liu Ying1, Wang Min1, ZHAO Yang-guo2(1Key Laboratory of Forest Plant Ecology, Ministry of Education, Northeast Forestry University, Harbin 150040; 2 School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090)Abstract: In order to investigate the impacts of secretion from Camptotheca acuminate (Ca) roots on the quantities and structure of Fungi and Bacteria in the rhizosphere, and the possibility that Ca controls exotic invasive plant Eupatorium adenophorum (Ea), traditional culture-dependent counting method and culture-independent small-subunit-ribosomal RNA gene-targeted molecular techniques, PCR-Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP), terminal Restraion Fragement Length Polymorphism(TRFLP) combined with 16S rDNA library, were adopted to compare the composition and structure of Fungi and Bacteria in rhizospheres of Ca, Ea and Ca-Ea mixed plantation(CE). Counting results indicated the numbers of Bacteria increased in turns in rhizospheres of Ea, Ca-Ea and Ca, while that of Fungi decreased in turns. PCR-SSCP profiles showed eucaryotic microbial bands (corresponding to biodiveristy) in rhizosphere of Ea were more complex than that of Ca and CE. It was Meristolohmannia spp. that became the sole predominant group in the rhizosphere of Ca demonstrated by cloning and sequencing a part of main SSCP bands. TRFLP analysis on Bacteria showed no difference among 3 rhizospheres, and the sequences of 16S rDNA clone library from Ca rhizospheres distributed in 10 known phyla, in which phylum Proteobacteria was the absolute dominant group and accounted for 24.71% of cloned sequences (-Proteobacteria accounted for up to 17.65%), and phyla Acidobacteria and Bacteroidetes accounted for 16.47% and 10.59% of cloned sequences respectively. In addition, high performance liquid chromatography checked out a trace amount of camptothecin and hydroxycamptothecin in the rhizospheric soil of Ca and CE, but examined no either camptothecin or hydroxycamptothecin in rhizospheric soil of Ea. Therefore, invasion and diffusion of Ea evidently depended on distinctive eukaryotic community structure mode, but not on the bacterial mode. And Ca was able to alter the invasive eukaryotic community structure mode of Ea by secreting camptothecin and hydroxycamptothecin into rhizospheres, and further inhitibited overspread of Ea. This study provided rhizospheric theoretic evidence for substituting Ca for Ea.Key words: Camptotheca acuminate, rhizospheric microbe, Eupatorium adenophorum, PCR-Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP), terminal Restraion Fragement Length Polymorphism (TRFLP), 16S rDNA library 喜树(Camptotheca acuminata Decaisne, Ca)是多年生亚热带落叶阔叶树，因其能够合成显著抗肿瘤活性的次生代谢产物喜树碱(camptothecin)和羟基喜树碱(hydroxycamptothecin)而倍受人们的关注。文献表明，喜树碱能够与人的拓扑异构酶I-DNA (TopI-DNA )共价复合物结合，抑制酶在超螺旋双链DNA上形成缺刻，从而阻止DNA的解旋，进而起到抑制肿瘤细胞复制的抗癌作用1。喜树碱在嫩叶中的含量为种子中的1.5倍，树皮中的2.5倍2,有研究表明喜树根际也能够分泌喜树碱3，由于喜树碱几乎对所有真核生物均具有抑制作用，所以喜树可能对根际土壤中的真核微生物群落结构产生很大的影响。紫茎泽兰(Eupatorium adenophorum, Ea)作为重要的外来入侵植物越来越受到人们的重视，而对入侵植物的生物防治是最具应用潜力的策略之一。研究表明，紫茎泽兰等许多外来植物的入侵是通过改变根际中微生物群落的功能来实现的4-8，通过改变土壤中原有微生物群落模式来达到成功扩散的目的。而喜树根际能够分泌抑制真核微生物生长的物质从而极有可能改变整个微生物群落的结构，进而破坏紫茎泽兰根际周围极具扩散性的微生物群落模式，从而实现对这种入侵植物的成功替代。根际中的微生物由于与宿主植物之间的相互依赖，相互制约的关系，致使不同植物根际的微生物群落具有很高的特异性9,10，喜树作为重要经济树种，其根际微生物的群落结构也应存在其特异之处，而以培养技术进行分析是无法满足对精确，客观，快速的要求。末端限制性片段长度多态性(terminal Restraion Fragement Length Polymorphism,TRFLP)11和PCR-单链构象多态性(PCR-Single-Strand Conformation Polymorphism PCR-SSCP) 12技术作为重要的基因指纹技术，在揭示微生物群落结构与动态特征中应用越来越广泛。而真细菌16S rDNA文库技术能更全面的揭示了真细菌微生物多样性，Giovannoni等13首先采用该技术分析马尾藻海海面上浮游微生物的多样性，发现了一个新的且在该环境中占优势的微生物类群。目前，该技术已经广泛运用于土壤、海洋、湖泊、动物肠道等多种生态系统中微生物多样性的调查，揭示了环境当中前所未知的微生物的多样性。本研究采用传统培养技术对紫茎泽兰、紫茎泽兰-喜树、喜树三种根际中微生物数量进行了调查，并采用SSCP和TRFLP-16S rDNA文库技术对三种根际中的真核微生物和真细菌的多样性、相似性进行了比较，对喜树控制紫茎泽兰入侵和扩散的可行性进行了分析。1 材料与方法1.1 实验设计选择9个体积为0.6m×0.5m×0.22m栽培箱，装满菜园土后分别种植喜树(Ca)、紫茎泽兰(Ea)和喜树-紫茎泽兰(CE)各3箱，所有植株的株行距均为0.1m，植株与箱边距0.05m，每箱植株总量为6行×5株=30株，在喜树-紫茎泽兰混栽体系中，两种植物间行种植。在水、光、气等外界环境一致的条件下，温室栽培20个月。1.2 生物量和根际土壤中喜树碱类衍生物测定1.2.1 实验植物生物量的测定分别测量喜树和紫茎泽兰的株高、基茎和植物干重，以Origin软件(Origin Lab Corporation, MA USA)中两样本独立性T检验分析喜树和紫茎泽兰各生物量在混栽及单独栽培时是否存在显著差别(0.05)。1.2.2 土壤中喜树碱类衍生物测定分别于三种栽培体系不同重复栽培样的行间取5cm以下根际土壤20g，将相同体系土壤充分混匀后，取100g用于喜树碱-羟基喜树碱检测，其余根际土样直接用于平板菌落计数、挥发性悬浮固体/悬浮固体(VSS/SS)14检测和总DNA的提取。将100g根际土壤样本完全悬浮于100 mL无水乙醇中，于室温下浸提60 min后采用Whatman 3M 滤纸过滤，用50 mL无水乙醇洗涤土壤，合并两次滤液。旋转蒸发滤液至3 mL，取1 mL转至1.5 mL Eppendorf管中，以10000×g离心 8 min，将上清移至一新管中待用。取600l于高效液相色谱(日本Jasco公司)中按文献15中的条件和方法检测喜树碱和羟基喜树碱。1.3 常规方法统计三种根际微生物数量将10g土壤溶解于200mL无菌水(加5g玻璃株)中，充分振荡，静置10min后，取上清液1mL，按10倍梯度依次稀释至10-10。取3样品的10-310-10稀释样，各0.2mL分别涂布于细菌用LB培养基、真菌用查氏培养基16平板上，每样重复3次。细菌置于37培养1d后计数，真菌置于28培养3d计数。取菌落(Colony-Forming Unit，CFU)数在20200个的梯度进行计数和比较分析。1.4 分子生物学技术分析三种根际中微生物群落的结构及组成1.4.1 土壤总DNA的提取取每种根际土样0.25g，以土壤DNA提取试剂盒PowerSoil (TM) DNA Isolation kit (Mobio CA USA)提取土样总DNA，最终溶解于100l ddH2O中，采用紫外分光光度仪(DU800, Beckman Coulter CA USA)检测DNA浓度，并计算DNA产率(WDNA/W土样)，各取3l，以/HindIII(宝生物，大连)为marker进行电泳检测DNA纯度。1.4.2 SSCP分析三种根际土壤中真核微生物多样性与相似性为研究真核微生物多样性，采用真菌类18S rDNA通用引物NS7( 5-ATAACAGGTCTGTGATGC-3)和NS8(5-GCAGGTTCACCTACGGA-3')17以三种根际土壤总DNA为模板，扩增真核微生物18S rDNA的V8V9区，约340bp。其中反向引物NS8的5端采用磷酸标记，用于核酸外切酶识别及切除。引物合成及标记由Invotrigen(上海)合成标记。PCR扩增采用4管平行，反应体系25l包括：10×buffer 2.5L(plus Mg2+)，引物各 0.75 L(0.6M)，dNTP 2 L(200M)，ExTaq DNA聚合酶 0.8 U(宝生物)，模板1050 ng。反应于GeneAmp PCR system 2700 PCR仪(Applied Biosystems, CA USA)进行，程序为：95预变性5 min，接以30个循环包括：95变性30s，50退火30s，72延伸1 min，最后72延伸10 min。4管混合后以纯化试剂盒(NucleoSpin® Extract II，Macherey-Nagel, Germany)纯化，并最终溶解于40 l ddH2O中。取3 L PCR产物与DL2000 marker (宝生物，大连)于1%的琼脂糖凝胶电泳检测浓度。核酸外切酶能够专一降解双链DNA中5-磷酸标记的链，从而使非标记的单链释放出来18，这样既减少了SSCP图谱中非特异性带，又提高了精确度。100L反应体系中包括核酸外切酶(NEB，MA USA) 30 U，纯化的PCR产物15 g，37温浴2 h。为减少蛋白质和核苷酸等杂质对SSCP图谱质量的影响，采用酚/氯仿法纯化酶切产物，并最终溶于20L ddH2O中。SSCP分析采用0.6×MDE Matrix(Cambrex, Rockland, ME USA)于室温下进行。酶解产物5 g与5 L变性液混合，95变性10 min上样，250V电泳 (PowerPac 1000, Bio-Rad, CA USA)12h。电泳结束后，按Bassam19的方法进行银染。获得的SSCP图谱采用UMAX Powerlook 1000(TX USA)扫描。将三种根际真核微生物SSCP图谱数字化，在同一迁移率下，有条带计为1，无则为0，然后对图谱各泳道进行主成分分析(Principal component analyses, PCA)20。将各泳道中浓度较高的条带回收后，采用相同的引物进行PCR扩增及核酸外切酶处理，以验证与原来条带是否具有相同的迁移率，然后克隆进T载体(pMD19-T，宝生物，大连)进行测序。采用序列分析软件Sequencher 4.5(Gene Codes, Ann Arbor, MI)去掉两侧载体序列，并通过Blast21在GenBank中检索最相似序列。1.4.3 TRFLP-16S rDNA文库相结合分析三根际真细菌多样性和相似性在构建16S rDNA文库和TRFLP分析时采用相同的真细菌16S rDNA序列保守引物：Eub-8F 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3和Eub-926R 5-CCGTCAATTCCTTTRAGTTT-3 11，分别对应于E.coli 16S rRNA22的827 bp和926907 bp。在TRFLP分析时，引物Eub-8F的5端采用6-FAM进行荧光标记，引物均由Invitrogen(上海)合成并标记。PCR体系及程序同SSCP分析，每样品平行做4管，PCR产物混合后用于后续分析。(1) 喜树根际真细菌16S rDNA文库构建及测序将喜树根际真细菌微生物的PCR产物混合后，采用胶回收试剂盒(上海华舜)纯化回收，连接于pMD19-T载体（宝生物，大连）中，转化后采用菌落PCR法23快速检测转化子中是否已经插入目的片段，当插入频率>80%时，随机选取100个克隆用于测序。测序采用M13通用引物在ABI3730上进行，正反向各测一个反应，以保证序列测通。采用Sequencher 4.5对序列进行拼接并去掉两侧载体序列，应用Clustal W软件24将所有的序列与真细菌界框架序列对齐后，以Phylip软件包25中NJ法绘制进化树，并分析序列在不同类群中比例。(2) TRFLP图谱的产生以纯化试剂盒(NucleoSpin® Extract II，Macherey-Nagel, Germany)纯化PCR产物，并最终溶解于40 l ddH2O中。按说明书，分别采用内切酶MspI，HhaI和RsaI(Fermentas Inc.，MD USA)消化纯化的PCR产物，取12 l烘干后，加1 l含有内标ROX1000(Applied Biosystems, CA USA)的loading buffer，于95变性后上样。采用4.5%的聚丙烯酰胺凝胶，1×TBE缓冲液，于基因测序仪3700(Applied Biosystems, CA USA)中以3 kV收集3 h，片段的长度和浓度采用GenScan软件进行分析，同时采用内切酶软件模拟酶切16S rDNA文库序列，将序列的长度与GenScan分析结果进行对比，找出TRF所对应的微生物类群。采用SPSS 12软件(SPSS Inc., IL USA)对MspI产生的TRF图谱进行主成分分析20。2 结果与讨论2.1 植株生物量特征喜树和紫茎泽兰单独栽培植株枝繁叶茂，而在混栽体系中，喜树和紫茎泽兰植株均受到不同程度的影响，在此状态下紫茎泽兰较短小，叶片稀疏；而喜树植株相对较矮。对不同生物量进行显著性统计分析表明，在单独栽培与混合栽培中喜树和紫茎泽兰的基茎均没有显著差别，p值分别为0.069和0.088，自由度(df)=105；紫茎泽兰株高在单独栽培和混合栽培下差别非常显著(p=1.123E-5，df=105)，而喜树株高差别也较小(p= 0.033，df=110)；另外，紫茎泽兰植株干重在混栽和单独栽培下差别显著(p=0.028，df=7)，喜树植株干重未获得。由此可见，在混栽体系中，紫茎泽兰的生长，尤其是株高受到了喜树的严重制约。喜树制约紫茎泽兰等外来入侵植物的蔓延可能是通过多种不同因素共同作用实现的，如对营养物的竞争、对土壤理化性质的改变或分泌某些抑制物等，然而多数研究均显示，外来入侵种在营养物吸收、改变周围生境等能力方面远远强于本地生物26-28，这也是多数外来种入侵成功的重要原因。基于此，进而考虑到喜树自身的特性及近年来对外来种入侵过程中改变根际微生物群落等方面的成果4-8,26-29，认为喜树对紫茎泽兰的抑制极有可能是通过分泌喜树碱等物质影响根际中真核微生物结构来实现的。2.2 土壤中喜树碱类衍生物的检测及平板菌落计数三种根际土壤的VSS/SS均为0.065±0.001，表明土壤中生物量较低。高效液相色谱分析表明喜树根际土壤中分别含有浓度为0.0414 g/g的喜树碱和0.00886 g/g的羟基喜树碱，混栽根际土壤中含有浓度为0.0413 g/g的喜树碱和0.00759 g/g的羟基喜树碱，而紫茎泽兰根际土壤中二者均检测不到。这说明喜树根系的确能够分泌喜树碱类衍生物，并扩散到根际土壤中。图 1 菌落计数法对喜树(Ca)、紫茎泽兰(Ea)和喜树-紫茎泽兰混栽(CE)根际土壤微生物计数结果Number of microbes (CFU)×106·g-1分别计数10-310-5稀释度的微生物菌落，取三稀释度CFU平均数结果见图1，误差线标明了不同稀释度的最大和最小的CFU数量。分析表明，喜树根际的真菌数量3.28×105 CFU/g，明显低于紫茎泽兰根际真菌数量18.24×105 CFU/g，混栽根际真菌数量9.30×105 CFU/g，喜树的根际表现出了对真菌强烈的抑制作用。分析其原因，是喜树根际分泌的喜树碱类衍生物干扰了真核生物DNA的正常复制行为1，从而抑制了真菌的增殖，极大的降低了土壤中真菌的数量；在混栽根际中真菌的数量虽然明显增加，但与紫茎泽兰根际比较表明，在此环境下真菌的增殖也受到了喜树碱的抑制，其数量水平低于紫茎泽兰正常生长扩散时真菌数量。有研究表明，紫茎泽兰等外来植物在生物入侵过程中能与根际中微生物相互作用，相互促进，形成独特而丰富的根际真菌群，从而抑制其它植物的生长，达到入侵的目的4,5,8，根据本研究的结果，在喜树和紫茎泽兰混栽体系中根际真菌的数量水平明显降低，喜树可能通过根际分泌物破坏了紫茎泽兰正常入侵扩散的根际微生物群落模式，从而制约了混栽体系中紫茎泽兰植株的过度蔓延。喜树、紫茎泽兰以及二者混栽根际中真细菌数量分别为16.24×106 CFU/g，3.15×106 CFU/g和3.53×106 CFU/g，喜树根际真细菌数量明显高于紫茎泽兰和混栽根际，与根际真菌数量呈相反的趋势，而紫茎泽兰和混栽体系中真细菌数量水平相差不大。为排除紫茎泽兰的扩散能够通过改变真细菌群落结构来实现的可能性，本文又采用TRFLP技术对三种根际中真细菌群落结构进行了分析(见下文)。2.3 总DNA提取及三种根际真核微生物相似性分析试剂盒提取的土壤总DNA无色透明，产率为50200 g/g土样，OD280/OD260=1.62.0，浓度6591549 g/mL，片段约为23 kb，无降解，无RNA污染。对三种根际中真核微生物群落的SSCP分析图谱见图2。结合图1和图2表明在单独栽培的紫茎泽兰根际中真核微生物的多样性和数量均高于混栽和喜树根际，进而也说明喜树碱类衍生物对绝大多数真核微生物均具有抑制作用，体现了其广谱性的特征，然而根据对喜树SSCP图谱中优势条带分析表明，仍有部分真核微生物种类，如Meristolohmannia spp.(图2中)对喜树碱类衍生物不敏感。值得注意的是，Termitomyces spp. (图2中)类真菌不但对喜树碱有抗性，而且在三种根际中均是优势类群；紫茎泽兰根际中多种类群的真核微生物均处于优势状态.(图2中)。PCA分析也说明紫茎泽兰根际中真核微生物类群同喜树及混栽相距较远(图未给出)。多数研究均表明，外来入侵种能够显著改变根际真核微生物的多样性和功能4,28，并且通过对土壤微生物功能的影响达到成功入侵的目的。比较图2中单独栽培紫茎泽兰群落泳道(Ea)和混栽泳道(CE)，并结合紫茎泽兰在2种栽培体系中生物量的差别，可见喜树改变了紫茎泽兰正常入侵时根际土壤真核微生物群落模式，从而制约了紫茎泽兰的进一步扩散和蔓延的势头。图 2喜树(Ca)、紫茎泽兰(Ea)和二者混栽(CE)中真核微生物的SSCP图谱示Ea中独特的真核微生物条带及多样性;示Ca中独特的真核微生物条带: Meristolohmannia spp.;示三种根际中都存在的类群: Termitomyces spp.Ea Ca CE2.4 三种根际土壤真细菌群落结构相似性及多样性分析三种根际土壤真细菌群落进行TRFLP分析的部分图谱见图3。对图谱的主成分分析表明除了喜树根际真细菌图谱有少许差别外，其余基本相同(图未给出)。结合计数结果，说明经过20个月的栽培过程中，3种栽培体系并没有形成各自独特的真细菌类群，紫茎泽兰没有改变真细菌微生物群落的多样性，而喜树中真细菌数量升高仅仅在于缺少真核微生物对营养物竞争或分泌物为其提供了更多的食物来源。研究表明外来种入侵过程中，真细菌的多样性一般会提高26，而本研究表明紫茎泽兰的蔓延并没有改变真细菌微生物群落的多样性。于兴军等8研究表明了紫茎泽兰的成功入侵可能是通过改变微生物群落的功能来实现的，而土壤微生物的功能是多种微生物，包括真核类和原核类微生物共同作用实现的，本研究表明这种功能的改变可能来源于真核类微生物群落结构的变化，而非真细菌多样性的变化。图 3对喜树(Ca)、紫茎泽兰(Ea)和二者混栽(CE)根际真细菌进行TRFLP分析图谱(只显示前200bp)图内方框中为峰值对应的克隆序列细菌种属，部分峰无对应序列通过对文库序列与TRFLP片段的比较，找出了部分TRF对应的序列及相应的种属(图3)，从中可见土壤中真细菌群落的多样性及复杂性。TRFLP图谱表明三种根际中的真细菌微生物群落多样性并无太大差异，以喜树根际为代表，采用16S rDNA克隆文库技术对根际中的真细菌群落组成进行普查。对文库进行随机测序，拼接整理得到84个全长序列(约900bp)，GenBank登录号：DQ093877DQ093959，采用相邻法与GenBank中部分序列构建系统进化树见图4。根据进化树，克隆序列在各门中的分配比例分别为：Proteobacteria为喜树根际中绝对优势真细菌类群，占文库操作分类单元(Operational Taxonomic Unit, OTU)总数的24.71%，其中-Proteobacteria即占了17.65%，该类微生物主要为硫酸盐还原菌，能够以各种化合物和简单挥发酸为电子供体还原硫酸盐30；其次为Acidobacteria门，占16.47%，是一类分布广、代谢类型丰富的土壤细菌31；Bacteroidetes门占10.59%，该类微生物是有机碳循环的重要贡献者32，有研究也表明这类细菌中的某些类群还具有降解有机聚合物的功能33，Chloroflexi也占到群落比例的9.41%，证明了光合作用在土壤中的广泛存在，除此以外，还有12.94%的未分类菌。微生物群落的多样性受各种环境生态因子的影响，因此不同地域不同生境中的群落结构显著不同，如苗圃中健康的黑云杉幼苗根际的微生物群落组成是以Acidobacteria, -Proteobacteria和Homobasidiomycetes占优势34，而太湖沉积物可培养的优势细菌群落分别属于-Proteobacteria(35.1%)，其次为Actinobacteria (24.5%)和Firmicutes (22.3%)等类群35，这些差别是由外界的物理、化学以及生物因素共同长期作用形成的。图 4喜树根际真细菌16S rDNA文库序列的系统进化分析框架序列以斜体显示；克隆序列以登录GenBank号表示DQ093877DQ0939593 结论采用常规的培养计数方法和分子生物技术对喜树、紫茎泽兰和二者混栽根际中微生物群落的特征进行了研究，结果表明：1) 在三种根际中，喜树根际土壤中真核微生物数量3.28×105 CFU/g，以Meristolohmannia spp.为单一优势种群，明显低于紫茎泽兰根际真核微生物数量18.24×105CFU/g和种群多样性，也较混栽根际真菌数量9.3×105 CFU/g和种群多样性略低，喜树及混栽体系中由于含有喜树碱和羟基喜树碱而表现出了对真核微生物强烈的抑制作用；2) 在三种根际中，喜树根际土壤中真细菌数量为16.24×106 CFU/g，高于紫茎泽兰和混栽体系中的3.15×106 CFU/g和3.53×106 CFU/g，而TRFLP分析表明在三根际中真细菌的多样性没有差别；3) 对喜树根际真细菌16S rDNA文库测序比较分析，包含了10个已分类的门，其中Proteobacteria门为优势菌群，占24.71%(其中-Proteobacteria占17.65%)，Acidobacteria门占16.47%，Bacteroidetes门占10.59%，另外还有12.94%未分类菌，喜树根际微生物群落表现出了较为丰富的多样性；4) 紫茎泽兰的扩散和蔓延依赖于特有的真核微生物群落结构模式，并不改变真细菌群落的结构，喜树能够通过根系分泌物改变紫茎泽兰入侵性的真核微生物群落结构模式，进而制约其外延。参考文献1 Staker B L, Feese M D, Cushman M, et al. 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