假单胞菌ZWL73降解4-氯硝基苯的代谢途径研究-生物谷.docx

眉题3假单胞菌ZWL73降解4-氯硝基苯的代谢途径研究镇 达1, 2 陈茂彬1* (1. 湖北工业大学生物工程学院 武汉 430068)(2. 中国科学院武汉病毒研究所 武汉 430071)摘 要: 氯代硝基芳香烃是一类环境中难以降解的有毒污染物。一株高效分解4-氯硝基苯的假单胞菌分离于4-氯硝基苯污染土壤, 可以完全降解4-氯硝基苯, 并以之为C源、N源生长。为阐明其降解4-氯硝基苯的代谢途径, 通过对以底物生长的降解菌的酶学分析, 检测到其还原降解的两个关键酶即初始酶硝基还原酶和苯环开环酶2-氨基-5-氯酚1, 6-双加氧酶的活性; 结合其它检测如培养液中降解产物分析、相关底物生长实验结果, 确定了其降解途径是通过部分还原途径。关键词: 4-氯硝基苯, 生物降解, 部分还原途径, 硝基还原酶, 2-氨基5-氯酚1, 6-双加氧酶Identification of Metabolic Pathways of 4-Chloronitrobenzene Degradation by Pseudomonas Strain ZWL73ZHEN Da1,2 CHEN Mao-Bin1*(1. College of Bioengineering, Hubei University of Technology, Wuhan 430068)(2. Wuhan Institute of Virology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430071)Abstract: Chloro- and nitro- substituted aromatics are toxic and persistent in the environment. Pseudomonas putida ZWL73, isolated from 4-chloronitrobenzene (4CNB) polluted soil, can grow on 4CNB as carbon and nitrogen sources. Enzymatic analyses were carried out in order to illuminate the degradation pathway. Two key enzymatic acivities were found to be invovled in the degradation: the nitroreductase activity that catalyzing the first step and the ring-cleavage dioxygenase activity leading the substrate to be mineralized. The degradation was therefore decided to process through a partial reductive pathway together with the proofs of the results of degradation intermediates test and growth substrate test.Keywords: 4-chloronitrobenzene, Biodegradation, Partial reductive pathway, Nitroreductase, 2-amino 5-chlorophenol 1,6-dioxygenase 镇 达等: 假单胞菌ZWL73降解4-氯硝基苯的代谢途径研究 363氯代及硝基芳香烃是一类环境中难以降解的有毒污染物, 对这类污染物的生物降解研究受到广泛关注, 从20世纪80年代开始有大量关于硝基和氯代芳香烃污染物生物降解的研究, 显示了微生物降解途径的多样性1。由于氯和硝基的同时取代使氯代硝基芳香烃芳环的不易于活化, 导致比单取代芳香烃更难以降解。尽管如此, 近年来国内外陆续分离到降解氯代硝基芳香烃的菌株, 其中分别属于Ralstonia、Comamonas的3株菌的降解机理得到深入研究2-6, 但是有关降解机理和特性的研究仍然很少, 相对于单取代芳香烃, 对这类污染物的生物降解机理的了解还很不全面。这株高效降解菌株由本实验室分离于武汉一个化工厂的氯代硝基苯(4CNB)污染的土壤中。菌体呈杆状, 革兰氏阴性。通过16S rRNA基因分析鉴定为Pseudomonas putida7,8。与前人分离到的菌株相比属于不同的属, 命名为ZWL73。ZWL73菌株可以以4CNB为唯一的C、N源生长, 4CNB培养的菌体能够快速转化加入的4CNB同时释放接近等量的氯离子和铵离子。通过GC-MS对培养液的分析检测到4-氯亚硝基苯的存在(未发表), 这对推测4CNB的降解途径提供了一定的证据。ZWL73菌还利用邻氨基酚(2AP), 2-氨基-5-氯酚(2A5CP) 和硝基苯(NB)为C、N源生长, 而不能利用4-氯苯胺(4-chloroaniline), 苯胺(aniline)等生长7。为了更深入地研究Pseudomonas putida ZWL73菌株利用4CNB生长的降解代谢途径及进一步克隆相关基因, 我们对代谢途径的初始代谢及开环途径进行了详细的酶学分析, 为以后的研究提供了有利 条件。1 材料与方法1.1 菌株及培养方法Pseudomonas putida ZWL73, 4CNB完全降解菌。平板培养：ZWL73菌培养在无机盐培养基上, 30, 培养皿盖子上放置适量可挥发性底物如4CNB粉末。培养好的平板可作短期保存之用, 亦可用于进一步的液体培养。液体培养前, 4CNB溶于无机盐培养液(终浓度1 mmol/L), 经0.22 µm滤膜无菌过滤后接种, 在30、250 r/min下摇动培养。无机盐培养基：每升含Na2HPO4·12H2O 14.3 g, KH2PO4 3 g, MnSO4·H2O 0.28 mg, FeSO4·7H2O 0.3 mg, MgSO4·7H2O 0.06 mg, CaCl2 1 mg, CuSO4 0.05 mg, ZnSO4 0.05 mg和H3BO3 0.05 mg。用NaOH调pH 7.0, 高压蒸汽灭菌(1×105 Pa) 20 min后备用。固体培养需要添加1.5%的琼脂粉。1.2 试剂4-氯硝基苯(4-chloronitrobenzene), 分析纯(上海精化科技研究所); 2-氨基-5-氯酚(2-amino-5- chlorophenol), 分析纯(Aldrich); 还原型辅酶(NADPH) (Sigma)。1.3 降解菌细胞提取物(粗酶)的制备9,10含有4CNB的100 mL液体无机盐培养基接种培养ZWL73菌, 从培养24 h后的菌液(OD600 =0.8)离心8000 r/min、5 min回收菌体, 用等量的冰冷的20 mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH 8.0, 简称PBS)将菌体清洗2次, 再用冰冷5 mL缓冲液悬浮菌体, 超声波破碎(Vibra cell, VC750, 功率270W), 总时间为4 min(每破碎 5 s, 停 9 s), 将所得的破碎液在4、15000 r/min 离心 30 min, 取上清即为粗酶, 放置冰上备用。蛋白浓度测定使用碧云天蛋白浓度测定试剂盒, 采用Bradford的方法11。1.4 硝基还原酶活性测定12用分光光度法检测(双光束紫外可见光分光光度计Lambda 25, Perkin Elmer), 反应在10 mmol/L 磷酸钾缓冲液 (pH7.0), 30下进行。1 mL反应体系中含有0.035 mg粗酶蛋白及200 mmol/L NADPH, 在样品杯中加入0.1 mmol/L 4CNB时反应开始(即对照杯中仅含相同浓度的酶、NADPH、缓冲液); 测定340 nm处辅酶NADPH特征吸收值的减小。NADPH 的摩尔消光系数E340为6220/mol·cm, 一个单位(U)的酶活定义为每分钟1 mmol底物/辅酶消失或产物生成的酶量, 比活力表示为每毫克蛋白的酶活。1.5 2A5CP间位开环酶活性测定13用分光光度法测定, 1 mL的20 mmol/L 磷酸钾缓冲液(pH8.0)体系中含有0.3 mg酶蛋白, 样品杯中加入125 µmol/L 2A5CP, 室温下测定产物2-氨基-5-氯粘康酸半醛的395 nm特征吸收峰的上升, 摩尔消光系数E395:21000/mol·cm。2 结果与分析2.1 ZWL73菌的硝基还原酶活性及其与4CNB代谢的关系在含底物的无机盐培养基上生长的ZWL73菌体, 经破碎后得到粗酶液。根据Park 和 Kim的方法12, 在室温下1 mL 10 mmol/L pH 7.0 的磷酸钾缓冲液体系中, 含有0.035 mg 蛋白和200 mmol/L NADPH, 在样品杯中加入0.1 mmol/L 4CNB时反应开始, 在280 nm-370 nm范围内, 每2 min扫描一次如图1。其中底物4CNB在283 nm的吸收峰26 min后下降到接近0, 而NADPH在340 nm的吸收峰22 min时下降到-1.1左右, 然后开始上升, 这是因为样品杯的NADPH被不断消耗至底物消耗完毕, 随着对照杯中的NADPH的自然氧化, 对照杯与样品杯的NADPH浓度差距减小。根据前2 min 内OD340的变化计算粗酶液活性为0.37 U/mg。当没有底物4CNB加入反应体系时, 则没有NADPH的吸收峰的变化, 可见NADPH的氧化与4CNB的转化是直接相关的。ZWL73菌的硝基还原酶活性的测出, 对于确定4CNB的降解途径具有重要意义。除了根据NADPH与4CNB的转化的直接相关的证据外, 我们从培养液中检测到了大量铵离子生成(见引言), 说明4CNB的降解是通过还原途径。另一个证据是通过GC-MS检测到对氯亚硝基苯存在于培养液中, 这相似于硝基苯的部分还原：硝基还原酶还原硝基苯的第一步反应的产物是亚硝基苯, 亚硝基苯进一步还原为羟氨基苯并通过变位酶作用生成2-氨基酚14。图1 ZWL73菌粗酶液对4CNB的硝基还原酶活性Fig.1 Nitroreductase activity towards 4CNB in cell extract of ZWL73以4CNB为底物生长的ZWL73菌的粗酶液对4CNB的硝基还原酶活性的测定, 283 nm处是底物4CNB的吸收峰, 340 nm 处是NADPH的吸收峰, 随着4CNB被转化, NADPH被不断消耗, 直到底物消耗完毕, NADPH不再减少。当对照杯的NADPH浓度由于自然氧化减少时, 样品杯的NADPH的相对浓度上升, 导致OD340的吸收值开始上升。The cell extracts was prepared from ZWL73 cells grown on 4CNB. The spectra indicated 4CNB absorbance at 283 nm, NADPH at 340 nm.With the transformation of 4CNB, NADPH was consumed until the substrate was used up.When the amount of NADPH decreased in the control for the reason of natural oxidation by oxygen,the relative amount of NADPH in the sample cup increased, causing OD340 to rise.这样可以确定ZWL73菌降解4CNB的初始代谢是经过还原途径; 同时结合降解菌的代谢过程如释放铵离子的特性, 可以排除芳香环加氢还原的可能(以没有硝酸根离子浓度上升为依据)。因此有必要对第一种还原方式进行仔细分析。硝基还原酶为特征的初始还原反应中, 有完全还原和部分还原两种可能。在以硝基苯为代表的部分还原方式中, 硝基苯的部分还原产物经过变位酶作用形成邻氨基酚的中间产物, 然后通过开环进一步降解; 而关于硝基在有氧条件下完全还原的例子还很少, 还不能确定有这样的途径的普遍存在1,15。ZWL73菌不可能是完全还原途径的另一个证据是氯代苯胺(可能的完全还原产物)不能作为经4CNB诱导的ZWL73细胞生长的底物(见前言)。所以推测经过部分还原途径的可能性很大。根据Katsivela 等对LW1菌降解4CNB的推测途径2, 开环底物是否是2-氨基-5-氯酚 (2A5CP)是确定降解途径的关键。2.2 ZWL73菌对2A5CP的活性及与4CNB代谢的关系我们通过检测ZWL73菌对化学合成的2A5CP及其结构类似物邻氨基酚(2AP)的活性为确定2A5CP是ZWL73菌的部分降解途径的开环中间产物提供有利证据。粗酶液在20 mmol/L pH8.0磷酸钾缓冲液, 1 mL体系含0.3 mg蛋白, 样品杯中加入125 mmol/L 2A5CP时反应开始。一个黄色的中间产物很快出现并在数分钟内消失。用紫外可见光分光光度计每分钟扫描一次见图2; 底物吸收峰293 nm在6 min内下降到0, 而395 nm产物吸收峰由低到高上升到1.7, 从2 min后开始下降到0.1左右; 在第1次扫描时, 产物吸收峰已经达到0.8左右, 说明反应速度很快。同时在272 nm处的吸收峰在8 min内一直上升到1.0左右。通过计算第1个1 min内的开环产物生成速度, 得到酶液的比活为0.144 U/mg。已经报道的唯一完全降解4CNB的菌株是丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)LW1菌株。Katsivela 等用4CNB生长的细胞在厌氧条件下转化4CNB, 将获得的中间产物用 1H及 13C NMR和GC-MS分析, 鉴定了开环底物为2-氨基-5-氯酚(2A5CP), 并通过紫外分光光度法测定了LW1细胞及粗酶液对4CNB及2A5CP的活性及发表了催化过程的吸收曲线图2。中间产物的获得是基于开环双加氧酶需要O2的原理, 当严格缺氧时开环双加氧酶的底物积累。对ZWL73菌降解途径来说, 这是一个重要的参考依据。图2 ZWL73菌粗酶液对2A5CP的有氧转化Fig.2 Oxidative transformation of 2A5CP by cell extract of ZWL73以4CNB为底物生长的ZWL73菌粗酶液对2A5CP的有氧转化在室温下进行, 20 mmol/L pH8.0磷酸钾缓冲液中, 在395 nm 有开环产物生成继而减少, 而272 nm处有自发的产物5-氯吡啶甲酸生成, 1-6分别指示0 min-5 min的扫描曲线, 箭头表示特定波长吸收值的变化趋势。Oxidative transformation of 2A5CP was carried out at room temperature with cell extracts of ZWL73 previously grown on 4CNB. In the phosphate buffer of 20 mmol/L (pH8.0), ring-cleavage product (395 nm) increased first and then decreased, spontaneous product appeared at 272 nm. The reaction mixture was canned at the intervals of 1 min(spectra 1 to 6), arrows indicate the direction of spectral changes.相比而言, ZWL73粗酶液对2A5CP的有氧转化过程与LW1菌株的过程完全一致。伴随2A5CP的吸收峰不断下降, 在272 nm处的吸收峰上升, 表示有新的物质生成。272 nm吸收的产物被鉴定为不稳定的开环产物自发形成的5-氯吡啶甲酸2。这也与2AP 1, 6-双加氧酶(2APDO)催化2AP的反应非常相似。Lendenmann 和Spain对2AP的开环产物形成的非酶催化生成的物质进行了仔细分析：通过与标准品比较包括HPLC、UV光谱、GC-MS等分析, 证明由2APDO催化4种2AP结构类似物开环能生成相应的吡啶甲酸化合物。一方面说明以2AP为底物的开环方式是间位开环, 另一方面说明了这个产物是自发生成的, 而不是降解代谢途径中的一个中间产物, 因为吡啶甲酸化合物不被粗酶液继续转化, 也不能被降解菌利用生长13。这也证明了ZWL73菌的2A5CP双加氧酶同样为间位开环方式。2.3 ZWL73菌降解4CNB的部分还原途径通过硝基还原酶活性的检测分析和GC-MS分析检测到4-氯亚硝基苯存在于降解过程中, 可以确定4CNB的降解经过还原途径, 并以4-氯苯胺(即完全还原的中间产物)不能作为降解菌的生长底物的证据, 说明4CNB的降解可能是经过部分还原途径, 即由4-氯亚硝基苯还原为4-氯羟氨基苯, 而后者经变位酶作用生成2A5CP。邻氨基酚化合物是硝基苯部分还原途径的开环中间产物, 在4CNB生长的ZWL73菌的粗酶中检测到2A5CP间位开环双加氧酶活性。因此我们确定4CNB的降解经过了2A5CP作为中间产物。图3 是推测的ZWL73菌降解4CNB的部分还原途径。图3 ZWL73菌降解4CNB推测的部分还原降解途径Fig.3 Proposed partial reductive pathway of 4CNB degradation by ZWL73参考Comamonas菌株LW1的4CNB降解途径2及P. pseudoalcaligenes JS45降解硝基苯的途径13。Referenced by the 4CNB degradation pathway of Comamonas strain LW1 and the nitrobenzene degradation pathway of P.pseudoalcaligenes JS45.3 讨论芳香烃化合物的生物降解取决于两个主要环节即芳香环的活化和开环。根据已有的了解, 有氧条件下, 硝基和氯代芳香烃的芳环的活化主要通过开环前的羟化作用; 对不同的底物羟化作用的类型也有不同, 对低程度取代的芳香烃, 当硝基和氯取代基同时存在时首先作用于硝基3,16。通常芳香环脱硝基有氧化和还原两种方式：氧化方式分为双加氧和单加氧两种, 均需要氧气分子和NAD(P)H, 释放亚硝酸根离子; 而还原方式也分两种：一种是需要NAD(P)H的硝基还原酶的还原, 还原硝基为氨基, 最终以多种方式脱除氨基, 释放铵离子; 另一种是芳香环加氢还原, 硝基以亚硝酸的方式脱落, 这个过程同样需要NADPH作为辅酶, 这个方式通常出现在二硝基或者多硝基芳香烃降解中1。对于Pseudomonas putida ZWL73菌对4CNB的降解, 通过酶学特性和其它证据初步鉴定为部分还原途径, 这也得到其它试验结果的支持, 即没有检测到底物培养的菌体破碎液中存在明显的双加氧酶或单加氧酶活性。根据相关研究文献, 前述两个降解4CNB的菌株Comamonas LW1、CNB-1的4CNB降解途径是通过部分还原途径, 加上Ralstonia eutropha JMP134菌降解2-氯5-硝基酚(2-chloro-5-nitrophenol)也是通过部分还原途径; 目前仅有得到阐明的4个菌株来源于3个不同属, 它们具有相同的降解类型, 可能在土壤环境中基因的水平转移导致了相同降解类型(基因)的传播17。Nishino 和Spain还观察到降解硝基苯的155株菌中, 只有1株是通过氧化脱硝基作用, 而154株都是部分还原途径。可见氯代硝基苯和硝基苯的有氧条件下的生物降解中部分还原途经占明显优势9,18。另外, 我们也检测到ZWL73的粗酶液具有对硝基苯的硝基还原酶活性和对2AP的开环酶活性, 说明4CNB降解途径的两个关键酶对硝基苯及其部分还原降解中间产物也具有活性, 这解释了ZWL73能够利用硝基苯生长的原因。尽管如此, ZWL73菌降解4CNB的降解途径还需通过进一步的基因克隆和功能分析进行验证。致 谢: 本研究是在中国科学院武汉病毒研究所周宁一研究员实验室完成的, 菌株分离及有关背景研究主要由刘虹和王淑君老师等完成, 在此表示衷心感谢!参 考 文 献1 Ye J, Singh A, Ward OP. 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