(翻译(独家首发一种生物抗氧化剂-α-硫辛酸.docx

一种生物抗氧化剂 -硫辛酸Lester Packer,* Eric H. Witt,* Hans Jurgen Tritschler* 美国加利福尼亚州伯克利市加利福尼亚大学，分子和细胞生物学系，膜生物能研究组 德国法兰克福市，ASTA医学院（1994年10月24日收稿，1994年12月16日修回，1994年12月20日接收）Lester Packer博士是伯克利市加利福尼亚大学分子和细胞生物学系教授。1956年他获得耶鲁大学微生物学和生物化学博士学位。在伯克利，自1961年开始担任生理学教授，伯克利加州大学膜生物能课题组负责人，自1972年成为劳伦斯伯克利实验室高级科学家。在生物氧化反应和生物能量学领域，他的研究重点是氧化剂和抗氧化剂在生物系统中的作用。他是世界上从事维生素E和生物抗氧化剂研究的杰出的研究者之一。他最近的研究工作阐明了维生素E生物化学研究的新领域维生素E循环。其内容主要与维生素E新的酶学反应，维生素E自由基以及维生素E作用后带来的生物学后果等几个方面有关。近年来的工作关注的是抗氧化剂在生物系统中对氧化损伤的预防，以及维生素E和硫辛酸等抗氧化剂是如何影响基因表达和细胞调控的。这些研究有助于对生物学抗氧化防御机制形成新的更宽泛的理解。Packer博士编写了50多册书籍，撰写了500多篇论文，是科学期刊的8名专业学会会员之一以及3名编委之一，在他从事的研究领域组织了大量的学术会议。目前，他担任加利福尼亚氧气俱乐部主席，国际自由基研究协会主席以及UNESCO分子和细胞生物学全球网络副主席。通讯作者及地址：Lester Packer，美国，加利福尼亚州94720，伯克利市，加利福尼亚大学，Life Sciences Addition 251号摘要 -硫辛酸在线粒体脱氢酶反应中发挥重要作用，近来它作为一种抗氧化剂，受到人们极大关注。脂酸或其还原型产物二氢脂酸可与过氧化物自由基，羟自由基，次氯酸，过氧化氢以及单线态氧等反应氧簇发生反应。脂酸也可与维生素C以及谷胱甘肽产生相互作用，继而使维生素E再循环利用，从而保护细胞膜。除了具有抗氧化活性外，二氢脂酸也可通过还原铁离子发挥氧化强化剂的作用。在许多氧化应激模型中，给予-硫辛酸进行治疗已被证实有益，此类模型包括缺血再灌注损伤，糖尿病（硫辛酸和二氢硫辛酸与蛋白均呈疏水性结合，例如与白蛋白结合，可阻止糖基化反应），白内障的形成，HIV激活，神经退行性病变，以及自由基损伤。而且，脂酸还可用作一些蛋白氧化还原反应的调节剂，如肌球蛋白，泌乳素，硫氧还蛋白以及NF-B转录因子等。我们从如下几个方面对脂酸的特性进行了综述：（1）与反应氧簇发生的反应；（2）与其他抗氧化剂的相互作用；（3）在氧化应激模型或临床状况中发挥的有益效应。关键词 抗氧化剂，二氢脂酸，二氢硫辛酸，-脂酸，-硫辛酸，氧化应激，氧化还原反应调节，综述，硫辛酸，自由基介绍-硫辛酸的新陈代谢作用为人们所认识已有数十年。它最初是作为一种醋酸取代因子由Reed及其同事分离得到1，2，溶于水，但也溶于有机溶剂。它有多个名字，包括硫辛酸；1，2-二硫戊环基-3-戊酸；1，2-二硫戊环基-3-戊酸以及6，8-二巯基辛酸。-硫辛酸为硫辛酰胺，它在多酶复合物中的作用为一种辅助因子，可催化-酮酸类发生氧化脱羧反应，这些酮酸类物质包括丙酮酸，-酮戊二酸以及支链-酮酸3。-硫辛酸分离得到后曾暂时被归为维生素类物质1，4，但后来发现它是由动物和人体合成的5；但是，目前尚未阐明可进行重新合成的完全酶学途径。多项研究表明，辛酸是八碳脂肪酸链的中间体，半胱氨酸可能提供了硫基的来源6。最近，-硫辛酸及其还原型二氢硫辛酸（DHLA，图1）可能具有抗氧化功能引起了人们极大地关注。在本综述中，我们重点论述了这些化合物的抗氧化特性，以及基于对这一老的辅酶的新鲜认识可能带来的预防和治疗应用前景。抗氧化剂的标准评价一种化合物的抗氧化能力时必须考虑多项标准。其中一些标准涉及化合物的化学性质和生物化学性质： -硫辛酸 二氢硫辛酸图1. -硫辛酸和二氢硫辛酸的结构，分别为化学结构（上图），球-棒模型（中图），空间填充模型（下图）。图中也显示了天然存在的R-对映体。合成的-硫辛酸是R-和S-对映体的外消旋混合物。l 抑制自由基的特性l 螯合金属的活性l 与其他抗氧化剂的相互作用l 对基因表达的影响考虑到疾病预防或治疗用途时，其他标准也非常重要：l 吸收情况及生物利用度l 在组织，细胞和细胞外液中的浓度l 分布（在水相中还是膜结构中，还是两者兼而有之？）一种物质无需满足上述所有的标准才可认定为一种良好的抗氧化剂。例如，维生素E只在膜上或脂质结构域中才发挥作用，其突出的作用是抑制脂质过氧化自由基，对于水相中的自由基的作用微乎其微或根本没有活性，然而，维生素E依然被认为是机体重要的抗氧化剂之一。流行病学研究证实维生素E可以预防许多氧化相关的疾病，例如心脏病7，8。一种“理想的”抗氧化剂应满足上述所有标准。-硫辛酸/二氢硫辛酸氧化还原对比较接近这种理想状况；它一直被称为“万能抗氧化剂”9。-硫辛酸易于从食物中吸收。在很多组织中，它迅速转化成DHLA，近来在分析技术方面取得的进展已清楚地证实了这一点10，11。该氧化还原对中的一个组分或两者皆可有效地抑制脂质和水相中的大量自由基。DHLA21，32，33和-硫辛酸13，19，23，24均具有螯合金属的活性。DHLA可与其他抗氧化剂发生协同作用，说明它能够使其他抗氧化剂从基态或失活态中再生。最后，有证据显示，该氧化还原对调节性蛋白以及参与机体正常生长代谢的基因可能有作用。考虑到这些抗氧化剂的作用，目前开展了大量的实验研究和临床研究，这些研究表明，-硫辛酸作为一种治疗药物对于下述疾病非常有用或具有潜在应用价值，如糖尿病，缺血-再灌注损伤，重金属中毒，辐射损伤，神经退行性病变以及HIV感染等。抗氧化剂的作用早在1959年，Rosenberg和Culik就发现了-硫辛酸的抗氧化作用4，他们观察到给予-硫辛酸能够预防维生素C缺乏型豚鼠的坏血病症状，也能够预防大鼠的维生素E缺乏症状，这些大鼠的饲料中不含-生育酚。然而，直到最近才开始研究-硫辛酸和DHLA在自由基淬灭，金属螯合，抗氧化剂再循环以及基因表达等方面的特定作用。反应氧簇淬灭及金属螯合作用硫辛酸 人们对于-硫辛酸的抗氧化作用基本有共识。它能够清除羟自由基，次氯酸和单线态氧。但它不能清除过氧化氢或超氧自由基，可能也不能清除过氧基（表1）。-硫辛酸可以螯合过渡态金属。两项研究表明-硫辛酸是一种有效的羟自由基清除剂。在其中一项研究中12，羟自由基由2 mM H2O2 + 0.2 mM FeSO4反应生成。利用自旋捕获剂5，5-二甲基喹啉-N-氧化物（DMPO），通过电子自旋共振（ESR）对自由基进行检测。1 mM -硫辛酸可完全消除DMPO-OH的加和物信号。在另外一项研究中13，使用相似的羟自由基生成体系（2.8 mM H2O2，0.05 mM FeCl3，0.1 mM EDTA，以及0.1 mM 抗坏血酸），但采用了不同的自由基分析方法（脱氧核糖降解法），结果也发现-硫辛酸是一种羟自由基清除剂。在该研究中，计算得出速率常数为4.7 × 1010 M-1s-1；这基本上是扩散限制的反应速率。因此，-硫辛酸是一种非常有效的羟自由基清除剂。关于-硫辛酸清除次氯酸的能力也有类似的共识。Haenen和Bast14以及Scott等13均发现50 M -硫辛酸几乎可完全消除50 M 次氯酸所致的1-抗蛋白酶的失活。这种表现与谷胱甘肽的作用大不相同，谷胱甘肽的还原型是非常有力的次氯酸清除剂，作用与-硫辛酸相当，但是其氧化型几乎完全无效14。该研究的作者推测，-硫辛酸相比氧化型谷胱甘肽的表现出更高的反应性可能与其分子内二硫化物结构中五元环略显紧张的构象有关系；在谷胱甘肽的分子内二硫化物结构中没有这样的张力，这一点或可解释在该系统中谷胱甘肽反应性不足的问题。目前发现，-硫辛酸至少在四个不同系统中可以清除单线态氧。两项早期的研究表明，-硫辛酸可与红荧烯自动氧化15或亚甲基感光氧化16生成的单线态氧发生反应；这些实验在有机溶剂中开展。后来在更接近生理条件下进行的研究也证实-硫辛酸是一种有效的单线态氧清除剂。Kaiser等17通过内过氧化物散热作用产生单线态氧，并通过化学发光法进行检测。在该系统中，-硫辛酸与单线态氧发生反应，速率常数为1.38 × 108 M-1s-1。还有一些实验利用内过氧化物散热作用产生单线态氧，并通过单链DNA断裂进行检测，在这些系统中也证实-硫辛酸是一种单线态氧清除剂18，19。早期的化学研究也表明-硫辛酸能够与过氧化氢发生反应20。只是在这些研究中使用的是高浓度的过氧化氢（30%）以及在非生理条件下进行（例如在丙酮中进行一天反应）。当-硫辛酸与过氧化氢在水溶性环境中进行测试时13，没有发生反应，实验采用基于过氧化物酶的分析系统检测过氧化氢，-硫辛酸的测试浓度最高达6 mM。两项独立的研究均未证实-硫辛酸可以清除超氧自由基。两项研究均利用黄嘌呤或次黄嘌呤以及黄嘌呤氧化酶产生超氧自由基。其中一项研究利用自旋捕获剂DMPO，通过电子自旋共振（ESR）对超氧自由基进行检测12，未见反应（图2）。无独有偶，Scott等人利用细胞色素c还原反应检测超氧化物，同样也发现-硫辛酸没有作用。表1 -硫辛酸的抗氧化作用氧化剂能否被-硫辛酸清除？试验系统参考文献超氧自由基不能不能通过黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生超氧阴离子，利用自旋捕获剂以电子自旋共振法进行检测通过次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生超氧阴离子，通过超氧阴离子依赖的细胞色素c还原法进行检测1213过氧化氢不能直接加入过氧化氢并通过过氧化物酶分析系统进行检测13羟自由基可以可以利用H2O2 + FeSO4反应生成羟自由基，利用自旋捕获剂通过电子自旋共振对自由基进行检测，或利用氨基苯二酰肼通过化学发光法进行检测利用H2O2 + FeCl3+抗坏血酸生成羟自由基，通过脱氧核糖降解法进行检测。反应速率常数 = 4.71 × 1010 M-1s-11213次氯酸自由基可以可以直接加入次氯酸并通过影响1抗蛋白酶活性进行检测同上1413过氧基不能可以利用2，2偶氮（2-甲基丙基脒）-二盐酸盐（AAPH）在水溶性介质中生成过氧基，通过藻红蛋白荧光淬灭法进行检测。在脂质（脂质体或大鼠肝脏微粒体）中，通过2，2偶氮（二异庚腈）（AMVN）的热解反应生成过氧基。通过线性加速器生成CCl3O2-并利用分光光度法进行检测。反应速率常数为1.8 × 108 M-1s-1913单线态氧可以可以可以可以在空气饱和苯中，于546 nm处激发，由红荧烯自动氧化生成单线态氧，根据随后红荧烯光谱消失进行检测。反应速率常数 = 1 × 108 M-1s-1，未对DHLA进行试验。在氯仿或甲醇中由亚甲基感光氧化生成单线态氧；通过分析硫辛酸甲酯的氧化产物检测反应情况。未对DHLA进行试验。通过内过氧化物散热作用产生单线态氧，并通过化学发光法进行检测。在该系统中，-硫辛酸与单线态氧发生反应的速率常数 = 1.38 × 108 M-1s-1。利用内过氧化物散热作用产生单线态氧，并通过单链DNA断裂进行检测15161718，19过渡金属螯合剂螯合剂可能为螯合剂没有螯合作用螯合剂螯合剂在水溶液中-硫辛酸能够与Mn2+，Cu2+，Zn2+形成稳定的复合物。Bisnorlipoate和tetralipoate可与离子形成更加稳定的复合物与测试单线态氧的系统相同。当向系统中加入EDTA时，-硫辛酸的保护作用降低，说明其保护效应至少部分是通过金属螯合作用达到的。-硫辛酸在肝细胞中能够降低Cd2+诱导的毒性，但效能远不及DHLA。作者推测硫辛酸被摄取并转化为DHLA，后者才是发挥保护效应的化合物在大鼠肝脏微粒体 + 硫酸亚铁 + 抗坏血酸中，硫辛酸对于TBARS的蓄积没有作用-硫辛酸能够抑制铁离子诱导的脱氧核糖的位点特异性降解，说明硫辛酸能够螯合铁离子。降低铜离子催化的抗坏血酸氧化反应，增加铜离子由水相转入正辛醇中的比例，抑制铜离子诱导的脂质过氧化反应231621221324-硫辛酸是否具有清除过氧基的能力尚不十分明确。一个研究小组报道9，-硫辛酸在水溶性或脂溶性环境中均不会与过氧基发生反应。过氧基利用不耐热的偶氮引发剂生成，利用2，2偶氮（2-甲基丙基脒）-二盐酸盐（AAPH）在水溶性介质中生成过氧基，或者利用2，2偶氮（二异庚腈）（AMVN）在脂溶性介质中生成过氧基。通过藻红蛋白荧光衰退法检测水溶性环境中的过氧基，在脂质（脂质体或大鼠肝脏微粒体）中，通过TBARS或共轭二烯分析法检测过氧基。与此相反，另外一个研究小组13只采用了水溶性系统，通过四氯化碳和异丙醇辐射分解反应生成过氧基（CCl3O2-），他们发现-硫辛酸可以与该自由基发生反应，速率常数为1.8 × 108 M-1s-1，利用分光光度计测量跟踪反应情况。对这种差异作出的解释可能是两个研究小组采用的方法学不同，但仍需进一步的工作以澄清这一问题。-硫辛酸也有可能通过过渡金属螯合作用在生物系统中发挥抗氧化作用。曾发现-硫辛酸在分离的肝细胞中能够降低Cd2+诱导的毒性，然而，作者推测这一作用是由于-硫辛酸转化为DHLA所产生，DHLA是真正的螯合剂21。有两项研究表明-硫辛酸可以螯合铁离子，但还有一项研究表明它没有该作用。Devasagayam等发现19，当向系统中加入EDTA时-硫辛酸的效力较低，说明其部分效应是由于铁离子螯合所致，该研究小组曾经发现-硫辛酸可有效抑制单线态氧诱导的DNA单链断裂。Scott等13发现，-硫辛酸通过氯化铁/过氧化氢/抗坏血酸抑制脱氧核糖的位点特异性降解，说明-硫辛酸能够清除结合到脱氧核糖的铁离子。与此相反，在大鼠肝脏微粒体系统中，通过硫酸亚铁诱导脂质过氧化反应22，研究发现-硫辛酸不能抑制过氧化。因此，在这一领域同样也需要进行深入的研究。-硫辛酸能够与Mn2+，Cu2+，Zn2+形成稳定的复合物，这些复合物几乎全都有羧基23。这些研究者还考察了离子与bisnorlipoate和tetralipoate形成的复合物，两者分别是-硫辛酸少两个碳和四个碳的同系物。研究发现这些复合物比与-硫辛酸形成的复合物更加稳定，可能是因为更短的碳链允许二硫戊环也参与了螯合反应。近来已将-硫辛酸对铜的作用延伸到氧化作用。-硫辛酸能够有效阻止铜离子催化的抗坏血酸氧化反应，增加铜离子由水相转入正辛醇中的比例，抑制铜离子催化的脂质过氧化反应24。上述观察结果表明-硫辛酸是一种铜离子螯合剂。总之，-硫辛酸可以清除羟自由基，次氯酸，以及单线态氧，但对过氧化氢和超氧自由基无效。它能够螯合铁，铜及其他过渡金属。仍需进一步的研究以证实-硫辛酸是否可清除过氧基。图2. 电子自旋共振法研究-硫辛酸和二氢硫辛酸对黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生的超氧阴离子的作用。DMPO电子自旋加和物生成方法：5 mM 黄嘌呤（X）+ 100 g 黄嘌呤氧化酶（XO）于150 mM KH2PO4-KOH（pH 7.4）中，在存在40 M DETAPAC环境中生成，总体积：1 ml DHPO=45 mM ；SOD = 200 U；-硫辛酸 (TA) = 5 mM；二氢硫辛酸 (DHLA) = 5 mM.。黄嘌呤氧化酶反应启动后，记录ESR信号3分钟。二氢硫辛酸 二氢硫辛酸/-硫辛酸氧化还原对的氧化还原电位为-0.32 V（参考25），因此二氢硫辛酸是一种有效的还原剂；作为比较，还原型谷胱甘肽/氧化型谷胱甘肽的氧化还原电位为-0.24 V（参考26），二氢硫辛酸能够将GSSG还原为GSH，但GSH不能将-硫辛酸还原为二氢硫辛酸27。就像-硫辛酸一样，二氢硫辛酸也是一种有效的抗氧化剂，但是关于它的效应有更多不确定性（表2）。目前一致的看法是，DHLA能够清除次氯酸，过氧基，并有可能清除羟自由基。它不能与过氧化氢或单线态氧反应。但是，关于DHLA是否也能清除超氧自由基以及在其与铁离子的相互作用中DHLA到底是抗氧化剂还是促氧化剂等问题上，研究结论尚不一致。在检测-硫辛酸与次氯酸离子反应的系统中，发现DHLA也有效，且清除自由基能力大致相同14。在多个不同的系统中，DHLA均被证明是一种有效的过氧基清除剂。如在-硫辛酸实验中所述，Kagan等9利用AAPH或AMVN分别在水相或脂质中产生过氧基，但是，与-硫辛酸不同，在这些系统中发现二氢硫辛酸能够清除过氧基。研究还发现，DHLA能够清除脂质中由AMVN产生的过氧基，并可通过十八碳四烯酸的荧光衰退检测到28，也能够清除如-硫辛酸测试时所述的在水溶液中产生的CCl3O2-，在后面这一系统中，计算二氢硫辛酸与自由基发生反应的速率常数为2.7 × 107 M-1s-1。在生成羟自由基的系统中，DHLA既有抗氧化作用12，又有促氧化作用13；但是，如果情形确实如此，促氧化作用则可能与DHLA对铁离子的作用有关（参见后文）。两组都用铁盐和过氧化氢产生羟自由基。Suzuki等12利用DMPO生产自旋加和物，通过电子自旋共振法检测羟自由基，结果发现DHLA能够消除DMPO-OH信号；Scott等13通过脱氧核糖降解法检测羟自由基，结果发现加入DHLA后能够增强上述反应过程。研究结果之所以有差异，可能是因为Scott等使用抗坏血酸还原三价铁离子，而Suzuki等使用二价铁盐，而并未使用抗坏血酸；DHLA使抗坏血酸再循环（见后文），因此在该系统中促进了抗坏血酸作为还原剂的功效。Scott等推测这种三价铁离子直接还原的机制是导致DHLA促氧化效应的原因。然而，如果DHLA是通过高铁离子的直接还原反应发挥作用，则Suzuki等应当也能观察到促氧化效应，但是他们并未观察到。无论如何，DHLA可清除羟自由基，在某些产生羟自由基的系统中也有可能观察到促氧化效应。表2 二氢硫辛酸的抗氧化作用氧化剂能否被-硫辛酸清除？试验系统参考文献超氧自由基可以不能通过黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生超氧阴离子，利用自旋捕获剂以电子自旋共振法进行检测。反应中DHLA的巯基含量下降，而过氧化氢浓度升高。反应速率常数 = 3.3 × 105 M-1s-1通过次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生超氧阴离子，通过肾上腺素氧化反应进行检测。反应速率常数 = 7.3 × 105 M-1s-1通过次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生超氧阴离子，通过超氧阴离子依赖的四唑蓝还原法进行检测122813过氧化氢不能不能直接加入过氧化氢，并通过铁离子-硫氰酸盐进行检测直接加入过氧化氢，通过测量DHLA中的巯基含量监测反应2913羟自由基可以不能（促进氧化反应）利用H2O2 + FeSO4反应生成羟自由基，利用自旋捕获剂通过电子自旋共振对自由基进行检测利用H2O2 + FeCl3+抗坏血酸生成羟自由基，通过脱氧核糖降解法进行检测。推测促氧化效应是由于亚铁离子还原以及/或者DHLA使抗坏血酸再循环所致1213次氯酸自由基可以可以直接加入次氯酸并通过影响1抗蛋白酶活性进行检测同上1413过氧基可以可以可以利用2，2偶氮（2-甲基丙基脒）-二盐酸盐（AAPH）在水溶性介质中生成过氧基，通过藻红蛋白荧光淬灭法进行检测。在脂质（脂质体或大鼠肝脏微粒体）中，通过2，2偶氮（二异庚腈）（AMVN）的热解反应生成过氧基。计量方法：每摩尔DHLA淬灭1.5 mol 过氧基与Kagan等于1992年的研究方法相同。此外，在脂质体中利用AMVN生成过氧基，通过姜饼树酸的荧光衰退法进行检测。通过线性加速器生成CCl3O2-并利用分光光度法进行检测。反应速率常数为2.7 × 107 M-1s-192813单线态氧不能可以（？）通过内过氧化物散热作用产生单线态氧，并通过化学发光法进行检测。利用内过氧化物散热作用产生单线态氧，并通过单链DNA断裂进行检测。DHLA的保护效应可能并非是由于直接消除单线态氧。1718，19过渡金属螯合作用螯合作用促氧化剂促氧化剂没有促氧化作用部分促氧化作用促氧化剂二氢硫辛酸在离体肝细胞中能够降低Cd2+诱导的毒性。也可降低暴露于Cd2+的肝细胞中的TBARS含量，研究表明，没有添加铁离子时，DHLA的活性全都是对抗过氧化反应的抗氧化活性（与Bast和Haenen，Scott等人的研究不同）。DHLA可以结合来自亚铁和高铁状态的铁蛋白中的铁离子在氯化铁-EDTA +过氧化氢系统中，可加速脱氧核糖降解。系统中不含EDTA时，反应也加速，说明DHLA的铁离子结合作用不像其铁离子还原作用那样有效。但是，当DHLA单独用于三价铁-博莱霉素-DNA系统时未见促氧化作用在大鼠肝脏微粒体 + 硫酸亚铁 + 抗坏血酸中，通过TBARS检测，发现DHLA可促进氧化反应通过Fe2+-邻二氮菲复合物测量发现，从DHLA向三价铁离子没有发生电子转移。另外，在硫酸亚铁-过氧化氢体系中，通过电子自旋共振（DMPO电子捕获剂）检测发现，DHLA也不会促进羟自由基的形成。在脂质体有AMVN诱导的脂质过氧化反应中，没有铁离子的情况下（铁离子被去铁胺螯合），DHLA能够降低50%的过氧化反应（通过TBARS测量到）。有铁离子的情况下，DHLA不会降低过氧化反应（但是，并没有促氧化效应，即，在该系统中DHLA的抗氧化作用和促氧化作用保持平衡）。在该系统中，有铁离子存在时，Tetranor-DHLA能够极大地促进过氧化反应（5倍）。存在铜离子时，微摩尔DHLA可导致pSP64质粒DNA单链断裂。在相同的检测体系中也检验了其他的金属离子，没有任何作用：包括Co2+，Cr2+，Fe3+，Fe2+，Ni2+，Mn2+以及Zn2+。在该体系中，存在铜离子时，发现其他的巯基化合物也能导致DNA断裂。2132，331322122834在与测定-硫辛酸与过氧化氢反应相似的体系中13，29，未发现DHLA有反应。此外，Kaiser等17利用红外化学发光法检测单线态氧时，没有检测到DHLA对单线态氧的清除作用。与此相反，DHLA的确能够阻止单线态氧诱发的单链DNA断裂（与促进DNA断裂的谷胱甘肽不同），但是，这种作用不一定是由于清除单线态氧，因为在这一过程中DHLA还可能在多个步骤发挥这一作用18，19。既然红外化学发光这种更加直接检测单线态氧的方法并未检测到单线态氧浓度的下降，说明DHLA可能不直接清除单线态氧。关于DHLA对超氧自由基的作用，目前有许多，但尚未弄清楚的、不一致的看法。在一项研究中，通过黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶产生超氧阴离子，利用自旋捕获剂以电子自旋共振法对其进行检测12，研究发现DHLA可与超氧自由基反应，反应速率常数为3.3 × 105 M-1s-1（图2）。分析发现，反应介质中DHLA中的巯基含量降低，而合理的产物过氧化氢含量升高，由此证实了上述反应的发生。该研究小组后来开展的一项研究也证实了这些结果28。后来的研究使用相同的体系生成超氧自由基，通过与肾上腺素氧化反应竞争，评价DHLA的清除能力。在该研究中，反应速率常数为7.3 × 105M-1s-1，与之前的研究结果取得良好一致。与这些研究不同的是，在另外一组研究中，使用相同的超氧化物生成系统（次黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶），通过超氧阴离子依赖的四唑蓝还原法检测超氧化物，结果发现DHLA没有清除超氧化物的作用。目前很难对两组实验结果的差异进行解释，无疑需要开展更深入的研究。或许围绕DHLA最为关键的问题是在特定条件下它是否是一种促氧化剂。至少有两种情形可能会发生这种情况。其一，DHLA可能是过渡金属的还原剂，尤其对于铁离子；其二，DHLA可能使抗坏血酸再循环，而已知抗坏血酸能够还原铁离子。DHLA既可与亚铁离子Fe2+结合，也可与高铁离子Fe3+结合，并可能将结合的Fe3+还原为Fe2+ 30，31。DHLA也能够从处于亚铁和高铁状态的贮存铁蛋白中清除铁离子32，33，但是它不能清除亚铁血红素中的铁离子13。如果DHLA确实能够去除铁离子，并且铁离子可以发生反应，则在生物系统中必须对DHLA的促氧化效应引起认真的关注。实际上，在大鼠肝脏微粒体的过氧化反应22中以及在羟自由基的生成过程中13，DHLA发挥了促氧化作用。在另外一项研究中，由AMVN启动微粒体中的过氧化反应28，当系统中含有去铁胺时，DHLA，可使过氧化反应降低50%，但是当没有去铁胺时，DHLA不能降低系统中的过氧化反应，这表明有铁离子存在时，DHLA的促氧化效应平衡了其抗氧化作用。在该研究体系中，一种比DHLA短四个碳的同系物tetranor-DHLA表现出更强的抗氧化效应，在有铁离子存在时，它可使脂质过氧化反应升高5倍。此外，DHLA以及许多其他的巯基化合物和二巯基化合物在有铜离子存在时能够诱导质粒DNA单链断裂，但在有Fe2+或Fe3+存在时不会诱导DNA单链断裂。这与-硫辛酸的抗氧化铜离子螯合作用相反24。另一方面，在另外一个检测体系中，使用铁离子产生羟自由基，DHLA的作用明确为抗氧化作用12，在该研究中，根据Fe2+-邻二氮杂菲复合物的形成进行测量，未观察到从DHLA到Fe3+有电子转移。在Cd2+诱导的离体肝细胞毒性实验中，加入DHLA能够降低TBARS的量21，因此，至少在该系统中，DHLA对抗脂质过氧化的抗氧化效应高于任何的促氧化效应。因此，DHLA在生物系统中是否为促氧化剂这一问题目前仍未解决。在体外实验中，当系统中含有三价铁离子时，DHLA可能促进羟自由基的形成，但是还未知其生理学意义。抗坏血酸在体外也能将高铁离子还原为亚铁离子；实际上，在体外系统中，抗坏血酸+ Fe3+是脂质过氧化的标准启动剂，但是在体内正常条件下，铁离子结合非常牢固，抗坏血酸的这种效应可能并不重要。DHLA的情况可能也是如此，但是DHLA可能从铁蛋白中去除结合型铁离子的情况应引起注意。更进一步，在生理系统中，DHLA与其他抗氧化剂的相互作用可能消除促氧化效应。例如，在Bast和Haenen进行的研究中23，DHLA能够促进亚铁离子诱导的脂质过氧化，抗坏血酸也可以。然而，与不含DHLA的相同系统相比，当系统中存在抗坏血酸，谷胱甘肽，亚铁离子时，DHLA 就会表现出抗氧化效应。-硫辛酸和二氢硫辛酸的这些研究结果明确了将来开展研究的几个重要领域：（1）-硫辛酸针对过氧基的抗氧化作用；（2）DHLA对超氧自由基的作用；（3）DHLA对铁离子和其他过渡金属的作用。此外，由于-硫辛酸和二氢硫辛酸具有不同的抗氧化作用，因此必须阐明-硫辛酸在不同组织的摄取和还原作用。与其他抗氧化剂的相互作用DHLA能够使其他抗氧化剂例如抗坏血酸，维生素E(间接地)等以自由基形式再循环。维生素E是主要的链断裂抗氧化剂，可保护膜免于脂质过氧化35。在生物膜中，维生素E与不饱和磷脂之间的摩尔比很低，通常每毫克膜蛋白含有不到0.1 nmol 维生素E，或者换句话说，每1000到2000个膜磷脂分子才有一个维生素E分子，磷脂是膜内主要的氧化靶点。在生物膜中，脂质过氧化自由基的生成速率为每分钟每毫克膜蛋白产生1-5 nmol，而膜磷脂通常不会发生破坏性的氧化反应，维生素E也不会迅速耗竭。而且，在成年动物中，维生素E缺乏状态非常难以诱导。这些看似自相矛盾的结论可以用“维生素E再循环利用”进行解释，在其再循环过程中，维生素E的抗氧化能力继续被其他的抗氧化剂所贮存。那些可以使维生素E再循环的抗氧化剂有维生素C ，还原型泛醌以及巯基化合物（图3）36，37。许多研究提供了DHLA使维生素E再循环的证据。DHLA能够保护微粒体免于脂质过氧化，但是只有存在维生素E时才如此38；在正常微粒体中而非维生素E缺乏型微粒体中，在低水平化学发光开始，维生素E减少以及硫代巴比妥酸迅速累积之前，DHLA可以延长保护时相。-硫辛酸在上述任一系统中均无效。在该系统中，DHLA可能通过直接减少酚氧自由基或通过减少其他抗氧化剂（如抗坏血酸）而发挥作用，进而使维生素E再循环。DHLA与酚氧自由基之间可能存在微弱的直接相互作用；我们发现，在暴露与紫外光下的脂质体中，DHLA的存在能够降低酚氧自由基的电子自旋共振信号（数据未发表）。用紫外光线可直接产生酚氧自由基，消除DHLA螯合铁离子的可能性或DHLA其他的抗氧化效应，使用脂质体则消除了DHLA通过其他抗氧剂发挥作用的可能性。因此，在该系统中，主要分布于水相中的DHLA似乎在膜/水临界处直接减少酚氧自由基。然而这种效应很微弱，在生物系统中由DHLA引起的维生素E的大多数再生循环可能是通过其他的抗氧化剂实现的。Basthe 和Haenen39提出DHLA通过还原谷胱甘肽阻止脂质过氧化，然后使维生素E再循环利用。这种提议依据如下观察结果，DHLA与氧化型谷胱甘肽联合作用时可以预防Fe2+/抗坏血酸诱导的脂质过氧化，而DHLA单独无此作用22。另一方面，Kagan等9提出，DHLA通过使抗坏血酸再循环进而使维生素E再循环，保护脂膜免于氧化。他们的电子自旋共振研究证实了DHLA介导的维他命C自由基的减少，维他命C自由基是在抗坏血酸氧化过程中由生育酚氧（维生素E或短链维生素E同系物）自由基在DOPC脂质体中生成，另外研究也证实DHLA可与NADPH-或NADH依赖的电子传递链相互作用，促使维生素E再循环。在人类低密度脂蛋白40和红细胞膜中41也曾观察到DHLA介导的依赖抗坏血酸的维生素E再循环。此外，有证据显示，面对氧化应激反应，体内给予-硫辛酸时能够升高还原型泛醌的水平41a，已知泛醌可使维生素E再循环41b。总之，现有证据指出，DHLA可以通过谷胱甘肽，维他命C，泛醌，NADPH或NADH使维生素E再循环，但是不同途径对于维生素E再循环的相对贡献尚不明确。实际上，早在1959年Rosenberg和Culik等就已经提出-硫辛酸对其他抗氧化剂的保护作用4，他们以令人吃惊的预见性指出，“-硫辛酸以及它进入细胞代谢后转化成的二氢衍生物（作用较-硫辛酸更甚），可能是针对抗坏血酸和生育酚的一种抗氧化剂。”在Rosenberg和Culik进行研究中，发现-硫辛酸既可预防维生素E缺乏症状也可预防维他命C缺乏症状。最近，我们观察到在生育酚缺乏的裸鼠中给予-硫辛酸后可表现出类似的保护效应42（图4）。这样的结果与-硫辛酸诱导的生育酚和/或抗坏血酸再循环表现相符，但是，这种表现也可以用-硫辛酸通过其各别的但又重叠的自由基清除效应使抗坏血酸和维生素E富余的能力进行解释。图3. 维生素E的再循环。在-生育酚氧化过程（在膜内所示）中形成的酚氧自由基可以被很多化合物再还原回到-生育酚，这些化合物包括泛醌，细胞色素c以及抗坏血酸。抗坏血酸可以通过与谷胱甘肽或硫辛酸等巯基化合物反应再生。依赖NADPH或NADH的还原能力，这些物质都可以通过不同的机制返回到它们的还原型。改编引自科学美国人。-硫辛酸也可导致细胞内谷胱甘肽含量升高。Busse等43向小鼠神经母细胞和黑色素瘤细胞系中加入-硫辛酸，观察到谷胱甘肽含量呈现剂量依赖性升高，相比未加-硫辛酸的对照组升高了30-70%。这些研究者还发现，小鼠每天腹腔注射4，8，16 mg/kg -硫辛酸一次，连续注射11天，在小鼠的肺、肝脏、肾脏细胞中，谷胱甘肽含量也出现类似的升高。这些结果在人Jurkat细胞系研究中也得到证实，向Jurkat细胞系的培养基中加入-硫辛酸，5小时后胞内谷胱甘肽的浓度升高了大约50%（D. Han，G. Handelmann，个人通讯）。GSH含量如此升高不能用GSSG的还原解释，因为通常存在的GSSG浓度比GSH的浓度低10%44。这些有趣的观察结果仍需作出解释。因此，-硫辛酸和二氢硫辛酸作为抗氧化剂，不仅仅是直接通过自由基淬灭和金属螯合发挥作用，也间接地通过其他抗氧化剂的再循环、以及可能通过诱导细胞内谷胱甘肽浓度升高而发挥作用。蛋白质氧化还原反应调节以及对蛋白质折叠的影响已报道蛋白质的硫醇化作用是对抗氧化应激的一种保护性机制，这种作用也会影响某些含巯基的蛋白质的功能44a。在哺乳动物细胞中，谷胱甘肽是含量最丰富的巯基化合物44，在正常条件下，它可能是参与蛋白质巯基氧化还原反应调节的主要因素。在正常生理条件下，-硫辛酸和二氢硫辛酸不会以非结合型存在，但是经过食物补充后，两者均以非结合型出现在不同的组织中42。DHLA还有比GSH更低的氧化还原电位，此外，它还具有较低的分子量。这些因素可导致如下的可能性：外源性给予-硫辛酸后，不仅可以通过抗氧化作用，还可以通过影响含巯基蛋白的氧化还原状态影响细胞内的功能，含巯基的蛋白例如有硫氧还蛋白，酶和运输蛋白等。二氢硫辛酸和二氢硫辛酰胺能够还原硫氧还蛋白47，48，它是一种小分子遍在蛋白，功能是在不同的生化过程中转移电子49。Spector等提出，硫氧还蛋白可能是一种由硫辛酰胺处得到电子的生理学电子受体。在许多系统中，DHLA能够增强葡萄糖转运76-78，而且认为这种刺激可能是由于巯基的还原反应所致，而巯基参与胰岛素激发的葡萄糖转运调节过程81。另外还发现DHLA通过二硫化物还原之外的机制影响生理意义重要的蛋白质。DHLA可将正铁肌红蛋白和铁肌红蛋白还原为氧合肌红蛋白45。DHLA还能够引起腺体激肽释放酶诱导的催乳素水解，DHLA作用于催乳素，使分子重新折叠为可作为腺体激肽释放酶的构象46。因此，DHLA可能通过抗氧化以外的方式对胞内代谢产生影响，但是，这种作用所具备的生理学意义仍需阐明。图4. 成年12周龄裸鼠，分别饲以如下饲料6周：（a）正常对照饲料，（b）缺乏维生素E的饲料，（c）缺乏维生素E，补充-硫辛酸的饲料。用缺乏维生素E的饲料饲养的动物表现出肌营养不良、体重减轻等维生素E缺乏症状。对基因表达的影响近来关于氧化剂和抗氧化剂在正常和异常条件下对信号转导和基因表达的影响引起人们极大的关注。考虑到此，我们研究了-硫辛酸和DHLA对转录因子NF-B的影响51，NF-B能够调节基因的表达，例如人免疫缺陷1型病毒基因及参与炎症反应调节的那些基因52。另外也考察了-硫辛酸和DHLA对c-fos基因表达的影响。NF-B通过氧化还原反应机制进行调节53，54，在调节过程中，