食用菌制种技术ppt课件.ppt

1,食用菌菌种的生产,2,食用菌的栽培一般包含几个步骤：首先是制作菌种，即通过孢子或菇体组织分离出菌丝体，并加以扩大繁殖形成生产菌种；其次是将制好的菌种接于培养基质，生产出食用菌子实体。,孢子,菇体组织,菌丝体,菌 种,培养基质,子实体,萌发,分离,3,一、菌种的制作,食用菌菌种有特定的制作程序，只有掌握了制种技术，才能生产出优良菌种，使食用菌栽培获得成功。,1、菌种类型及制种程序,（1）菌种类型,使用目的的不同,保藏用菌种,实验用菌种,生产用菌种,4,一、菌种的制作,1、菌种类型及制种程序,（1）菌种类型,物理性状,固化菌种,固体菌种,液体菌种,外观形态,颗粒状菌种,片状菌种,砖状菌种,培养容器,袋装菌种,瓶装菌种,5,一、菌种的制作,1、菌种类型及制种程序,（1）菌种类型,培养基的主料,粪草菌种,谷粒菌种,木块菌种,木屑菌种,6,一、菌种的制作,1、菌种类型及制种程序,（1）菌种类型,菌种按生产程序,一级种(母种）,二级种（原种）,三级种(栽培种）,7,一、菌种的制作,1、菌种类型及制种程序,（1）菌种类型,一级种,一级种又称母种、试管种。,将经孢子分离法或组织分离法得到的纯培养物，移接到试管斜面培养基上培养而得到的纯种。,采用分离法获得的母种数量有限，一般可将菌丝再次转接到新的斜面培养基上进行转管繁殖，能得到更多的母种，称为再生母种，即可用于生产，也适用于纯种的保藏。,一支长满菌丝体的试管母种可分移成10多支新试管。试管种若不马上使用，可置于4的冰箱中保存。,8,一、菌种的制作,1、菌种类型及制种程序,（1）菌种类型,二级种,二级种又称原种，这是由母种转接到装有麦粒等固体培养基质的专有菌种瓶中经过培养后形成。原种可采用750mL菌种瓶或500mL罐头瓶作为培养容器。一般一支母种可扩大繁殖6-8瓶原种。,若原种直接用于生产，则成本太高，因此，原种还必须进一步扩大繁殖成三级种，使菌种数量增多，才能用于栽培。由于原种的培养基质接近栽培所用的基质，因此原种也可用于小规模的栽培。,9,一、菌种的制作,1、菌种类型及制种程序,（1）菌种类型,三级种,三级种又称栽培种，它是由二级种进一步扩大繁殖而得。,栽培种的培养基质与二级种相似，更接近于栽培基质。三级种数量多、成本低。,栽培种一般采用固体培养基，用聚乙烯塑料袋或玻璃瓶作培养容器。通 常一瓶原种可繁殖30-50袋栽培种。,10,一、菌种的制作,1、菌种类型及制种程序,（2）制种程序,菌种生产是指通过无菌操作，大量培养繁殖菌种的过程。,11,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（l）配料设备,切片机是将木材切成规格木片的专用机械，是食用菌培养基质粉碎处理的预前工序设备。,切 片 机,12,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（l）配料设备,粉碎机是将木片、秸秆等原料粉碎成一定粗细度碎屑的专用机械。,粉 碎 机,13,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（l）配料设备,搅拌机是将培养料通过搅拌使其分布充分均匀的专业机械。其配套动力为3KW，每次拌料量为100KG湿重。,搅 拌 机,14,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（l）配料设备,装袋机是将搅拌混合均匀后的培养料装入塑料薄膜筒内的机械。,装 袋 机,15,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（l）配料设备,将培养料装入料瓶的机械。生产上采用的均匀螺旋挤入式装瓶机。,装 瓶 机,16,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（2）灭菌设备,高压灭菌锅是密闭耐压的金属灭菌容器。其工作原理是在驱尽锅内空气的前提下，通过加热把密闭锅内的水蒸气压力升高，从而使蒸汽温度相应提高到100以上。压力在98KPa时，蒸汽温度可达121。常见的高压灭菌锅有手提式、立式与卧式，也有自制的高压灭菌锅。手提式主要用于一级种制作，立式和卧式主要用于二级种、三级种和栽培瓶、袋的制作。,17,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（2）灭菌设备,手提式高压灭菌锅的容积小，适用于试管培养基、三角瓶或平皿、无菌水、少量菌种瓶及一些器皿的灭菌。,手提式高压灭菌锅,18,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（2）灭菌设备,立式高压灭菌锅容量大，可用于菌种瓶、罐头瓶及塑料袋装培养基的灭菌。,立式高压灭菌锅,19,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（2）灭菌设备,卧式高压灭菌锅容量大、盛物多，灭菌彻底，效果好。,卧式高压灭菌锅,20,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（2）灭菌设备,常压灭菌灶是在自然压力下产生100蒸汽进行灭菌的炉灶，如土蒸锅。常压灶制作简单，造价低，很受菇农欢迎。,常压灭菌灶,21,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（3）接种设备,无菌室是食用菌生产中无菌操作的环境。无菌室要求严密、清洁。,无菌室一般有内外两间，外间较小，作为缓冲间。缓冲间可放置工作服、拖鞋、口罩、消毒用药品等。无菌室门应采用推拉门，内外两间的门应呈对角线安装，以提高隔离缓冲效果。必 要时可安装一个双层小型玻璃推拉窗，以便于内外物品传递，减少进出无菌室的次数。,22,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（3）接种设备,为了在使用之后能排湿、通风，应在室内顶部设置小型排风扇，在室内的侧面底部设置玻 璃纤维过滤进气口。,无菌室(包括缓冲间)除照明用光源外，还应安装紫外线杀菌灯，吊装在接种操作台的正上 方。,23,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（3）接种设备,超净工作台：是一种局部层流(平行或垂直流)装置，它能在局部造成高洁净度的工作空间；使小房间内的空气经预过滤器和高效过滤器除尘、洁净后，以垂直或水平层流状态通过操作区，因此，可使操作区保持既无尘又无菌的环境。,超净工作台,24,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（3）接种设备,接种箱：是用木材与玻璃制成密闭箱。有单人式或双人对接式。接种箱前后斜面为玻璃窗，便于操作时观察，可开启，以便取放物品。玻璃窗下的木板有一对椭圆形开孔，操作孔装有白布袖套，一端固定在圆孔上，另一端套口用松紧带箍住操作者的手腕，以防杂菌进入。箱内可安装20W日光灯和30W紫外线灯管。,25,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（3）接种设备,A、接种针,B、接种钩,C、接种环,D、接种铲,E、接种锄,F、接种耙,G、接种刀,H、接种勺,I、接种镊,26,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（4）培养设备,在制作一级种和少量二级种时，可采用电热恒温箱或隔水式电热恒温箱，目的是控制温度，适温培养,恒 温 箱,27,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（4）培养设备,培养室：是专门用于培养菌种的场所。各级菌种在接种完毕之后，即移人培养室。冬季培养室应有专用加温设备。无论采用何种方法加温，都要注意培养室内空气的相对湿度，一般维持在6570，否则菌瓶失水过多。菌种培养架可用木制，也可用钢材或铝合金材料制成，宽度11.5m，有4-6层，层间距0.4-1m.培养室内还需温、湿度计，用于培养室温度、湿度的测量。,28,一、菌种的制作,2、菌种生产的主要设备,（5）菌种保藏设备,多数菌种要在低温、干燥、隔绝空气等环境中保藏。常用的主要设备是电冰箱、干燥器、真空抽气机等。高温型菌类的菌种需继代保藏，由于要越过寒冷的冬季，常用电热恒温箱.,电 冰 箱,29,一、菌种的制作,3、制种用品及材料,(1)药品,基物药品,制作母种时常用的药品有,琼脂、葡萄糖、蔗糖、磷酸二氢钾、硫酸镁、蛋白胨、麦芽汁、酵母膏和维生素B1等。,原种和栽培种常用药品有,石膏粉、碳酸钙、过磷酸钙、蔗糖、红糖、尿素、硫酸铵等。,30,一、菌种的制作,3、制种用品及材料,(1)药品,消毒及杀菌药品,5甲醛,5石碳酸,0.l高锰酸钾,75酒精,25漂白粉,0.1升汞,12煤酚皂溶液(又称来苏尔),0.25新洁而灭,31,一、菌种的制作,3、制种用品及材料,(2)配料用具,常见的配料用具有,搅拌机,天平,杆秤,水泥地,水桶,铁铲、铝锅、铁锅、搪瓷杯、大烧杯、筐、木箱、塑料箱,脸盆,废油桶,32,一、菌种的制作,3、制种用品及材料,(3)分装及检测用具,分装用具有,铁架台,漏斗,试管筐,菌种袋(17cmX 33cm、14cmX 28cm等的聚乙烯或聚丙烯插角、平底袋),试管(18mmXl80mm、20mmX200mm),量杯(100、250、500mL),菌种瓶(750mL、500mL盐水瓶或罐头瓶),培养皿(d9cm),三角瓶250mL,33,一、菌种的制作,3、制种用品及材料,(3)分装及检测用具,检测用具有,生物显微镜,温度计,干湿球温度计,pH试纸,卡尺,34,一、菌种的制作,3、制种用品及材料,(4)分离及其用具,常用分离用具,钟罩,棉花,纱布,记录本、标签纸、笔,尖头镊子,酒精灯,广口瓶,手术剪,95酒精,其他用具及材料有：纱布、工作衣、托鞋、口罩、无菌水、颈圈、绳线、回形针、钉书机等。,35,一、菌种的制作,4、菌种培养基的制备,（1）培养基(料)的配制原则,选择适宜的营养物质,食用菌所需的营养物质，碳源、氮源和矿质元素等，对每一种营养物质的种类和数量要求又有所不同。,从母种，原种到栽培种各个阶段的目的和要求不同，所选用的培养基营养成分也应有不同。,母种的初生菌丝比较嫩弱，分解养分能力差，因此要求营养丰富、完全，氮源和维生素的比例要高，需选用容易被菌丝吸收利用的物质，如葡萄糖、蔗糖、马铃薯、玉米粉、麦芽汁、酵母膏、蛋白胨、无机盐类和生长素等为原料。,原种、栽培种所需培养基数量较多，而且菌丝分解物质能力强，可利用大量农作物秸秆、粪草，锯木屑、棉籽壳、麸皮和米糠等原料作为培养基。,36,一、菌种的制作,4、菌种培养基的制备,（1）培养基(料)的配制原则,注意各种营养成分的比例,培养基(料)中各种营养物质的比例是影响菌丝生长的重要因素。营养物质比例适当，菌丝生长发育就好，否则就差。,应根据不同培养对象的需要，配以适当比例。菌丝生长要求培养基(料)有一定的碳氮比，一般碳氮比(C：N)以20:1为好。,如培养基(料)中碳源供应不足时，容易引起菌丝的过早衰老和自溶，如氮源过多或过少时，会引起菌丝的过于旺盛生长或生长缓慢，对菌丝生长造成不良影响。,37,一、菌种的制作,4、菌种培养基的制备,（1）培养基(料)的配制原则,调节适宜的酸碱度(pH),培养基(料)需要保持菌丝生长发育所需要的酸碱度，因此配制培养基(料)时，要用氢氧化钠、石灰或过磷酸钙等调节pH值。,各种食用菌所需要的pH值不同，培养基(料)的酸碱度也应不同。,如猴头菌丝喜欢酸性环境，需调节pH值为45;又如草菇菌丝喜碱性环境，需将pH值调为758。,38,一、菌种的制作,4、菌种培养基的制备,（1）培养基(料)的配制原则,选择经济实用的原料,制做培养基(料)的原料，有些价格比较贵、成本高，可用一些价格低廉的代用原料。,可用一些农副产品代替化学药品，常用的有马铃薯、麦芽，玉米面、麦麸等。,在食用菌制种中，原种和栽培种因原料用量较大，选择合适的代用原料，其经济意义就更大。,过去多用麦粒和玉米，现在可用锯木屑和棉籽壳等来代替。但是选用代用料时，必须就地取材，来源丰富、价格便宜的原则，而且原料没有毒性。,39,一、菌种的制作,4、菌种培养基的制备,（2）培养基的类型,培养基的类型,营养来源,物理状态,表面形式,用途,天然培养基,合成培养基,半合成培养基,固体培养基,液体培养基,半固体培养基,斜面培养基,平面培养基,高层培养基,母种培养基,原种培养基,栽培种培养基,40,一、菌种的制作,4、菌种培养基的制备,（2）培养基的类型,营养来源,天然培养基,天然的有机物质配制而成。如农副产品麦麸，米糠，豆饼及许多农作物秸秆等，也有动植物浸出液，如牛肉膏、麦芽汁、豆芽汁及马铃薯汁等。,培养基的优点是营养丰富、经济方便，但它的化学成分不能定量，每批成分也不稳定，不宜用作精确的实验。常用的天然培养基有马铃薯培养基、麦芽汁培养基等。,41,一、菌种的制作,4、菌种培养基的制备,（2）培养基的类型,营养来源,合成培养基,用已知成分的化学药品配制而成。,培养基的优点：是各种成分简单而清楚，容易控制，适于进行某些定性、定量测定。,常用的合成培养基有（高氏一号培养基）、察氏培养基等。,42,一、菌种的制作,4、菌种培养基的制备,（2）培养基的类型,营养来源,半合成培养基,在天然培养基中适当添加一些无机盐类，或者在合成培养基中添加少数天然有机物质配制而成。,培养基的优点：是营养全面丰富、宜于控制。常用的有综合马铃薯培养基等。,43,一、菌种的制作,4、菌种培养基的制备,（2）培养基的类型,物理状态,液体培养基,培养基呈液体状态。它含有食用菌菌丝生长发育所需要的各种营养物质。,食用菌孢子或菌丝在这种培养基中能够更好地接触和吸收养料，因而菌丝体生长迅速而粗壮，同时这种液体菌种便于接种工作的机械化、自动化，有利于提高生产效率。,缺点是要发酵设备，成本较高，也较复杂。液体培养基常用来观察菌种的培养特征以及检查菌种的污染情况。,44,一、菌种的制作,4、菌种培养基的制备,（2）培养基的类型,物理状态,固体培养基,在液体培养基中加入凝固剂即成为固体培养基。常用的凝固剂是琼脂。,根据季节和用途的不同，凝固剂的添加量一般在182之间。固体培养基可制成试管斜面，也可制成平皿平面（平板），试管斜面用来培养和保存菌种，平皿平面可用来分离和纯化菌种。,除了加凝固剂的固体培养基外，天然的固体基质做成的培养基也称固体培养基。在菌种制作中，用麦粒、玉米粒、木屑、棉籽壳、甘蔗渣等农副产品制成的培养基也属固体培养基。,45,一、菌种的制作,4、菌种培养基的制备,（2）培养基的类型,物理状态,半固体培养基,在1000毫升液体培养基中，将加入的琼脂量减少为810克，即成为半固体培养基。它主要用来培养一些特殊菌类。,46,一、菌种的制作,4、菌种培养基的制备,（2）培养基的类型,培养基的表面形状,斜面培养基,将琼脂培养基装入试管灭菌后，乘热放置成斜面，凝固后即成。它用于菌种扩大转管及菌种的保藏。,平面培养基,高层培养基,将琼脂培养基装入三角瓶中灭菌后，冷至50左右，乘热倒入灭菌平皿(或不倒入平皿)凝固后即成。它用于菌种分离和研究菌类的某些特征。,将琼脂培养基装入试管内灭菌后，不摆成斜面，即成高层培养基。接入高层培养基的菌种，发育的面积虽然小，但这种培养基厚度大，营养丰富，存放时间长，也不易干燥开裂。常用于保存菌种。,47,一、菌种的制作,4、菌种培养基的制备,（2）培养基的类型,培养基的用途,母种培养基,也称一级培养基。它是分离母种或试管种扩大繁殖用的培养基。因母种培养基装在试管内，并摆成斜面，因此也叫斜面培养基。,原种培养基,栽培种培养基,也称二级培养基通常装在罐头瓶或者750毫升容积的菌种瓶内，也可装在1000毫升容积的白色聚丙烯塑料瓶内。,也称三级培养基，它是供食用菌栽培用的菌种培养基。通常装在罐头瓶或750毫升容积的菌种瓶内，也可装在17X 33厘米或l7X28厘米大小的聚丙烯塑料袋内。,48,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,母种（一级种）培养基的配制,种菇或种木的选择和处理,孢子、组织、种木分离,马铃薯、琼脂、葡萄糖等原料,装入试管的培养基,排成斜面的培养基,母 种,接种,配制,灭菌,培养,49,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(1)母种（一级种）培养基的配制,母种培养基种类很多，常用的有以下几种：,马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基(PDA培养基)马铃薯(去皮)200克，葡萄糖20克，琼脂1820克，水1000毫升。,马铃薯、蔗糖、琼脂培养基(PSA培养基)马铃薯(去皮)200克，蔗糖20克，琼脂1820克，水1000毫升。,蛋白胨、葡萄糖、琼脂培养基 蛋白胨2克，葡萄糖20克，磷酸氢二钾1克，磷酸二氢钾05克，维生素B1005毫克，硫酸镁05克，琼脂18-20克，水1000毫升。,50,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(2)母种（一级种）培养基的配制方法,工艺流程,计算 配方各物用量,按比例称量各物质,配制,调pH,分装试管,塞棉塞,灭菌及摆斜面,无菌检查,51,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(2)母种（一级种）培养基的配制方法,工 艺 流 程,52,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(2)母种（一级种）培养基的配制方法,首先要选择合适的浸煮容器，一般选用铝锅、搪瓷缸或玻璃烧杯等，而不能用铜，铁器皿，以免铜锈或铁锈混进培养基中。,母种培养基的制作，按以下顺序操作,计算 先选好培养基配方，按照培养基需要的数量计算各种成分的用量，然后称量。,53,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(2)母种（一级种）培养基的配制方法,称量 用架盘天平称取培养基各种成分的用量，对一些不易称量的成分，需采用特殊方式称量，如牛肉膏比较粘稠，可先称好一根玻棒和烧杯，再用玻棒取牛肉膏放在烧杯中一起称。微量元素与生长因子等，需要量很少，难以称准，可先配成较浓的原液，再从中取出需要的量。,配制 为避免发生沉淀，加入的顺序一般是先加缓冲化合物，溶解后加入主要元素，然后是微量元素，再加入维生素等。最好是每种成分溶解后，再加入第二种营养成分。若各种成分均不发生沉淀，也可以一起加入。,54,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(2)母种（一级种）培养基的配制方法,配制,若用马铃薯、玉米粉、苹果、米粉、木屑等原料时，应先制取这些原料的煮汁，然后再把煮汁与其它成分混合,以马铃薯葡糖琼脂培养基为例，说明其配制方法。,把选好的马铃薯洗净，去皮挖去芽眼，切成薄片或1厘米大小的方块，称取200克放在容器中，加水1000毫升，加热煮沸2030分钟，至软而不烂的程度，用四层纱布过滤；取其滤液。,55,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(2)母种（一级种）培养基的配制方法,配制,在滤液中加入琼脂，小火加热，用玻璃棒不断搅拌，以防溢出或焦底，至琼脂全部溶化，再加入葡萄糖和其它营养物质使其溶化，最后加水至1000毫升即成。,调pH 一般用10盐酸(HCl)或10氢氧化钠(NaOH)调pH，用pH试纸进行测试。调时要小心，要几滴几滴地加碱或加酸，调至所需要的pH值。,56,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(2)母种（一级种）培养基的配制方法,分装 培养基配制好后，趁热倒入大的玻璃漏斗中，打开弹簧夹，按需要分装于试管或三角瓶内。装入试管的培养基量，以试管总长的1/41/5为好(装入的培养基切勿沾附管口壁)。装入三角瓶培养基量，一般不要超过瓶容量的13每装完一支试管或一个三角瓶随即关闭弹簧夹，并把试管放进小铁丝筐内。,57,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(2)母种（一级种）培养基的配制方法,塞棉塞 培养基分装到试管或三角瓶后，管口或瓶口要塞上棉塞。棉塞用普通棉花，不要用脱脂棉，因脱脂棉易吸水变潮，导致杂菌生长。棉塞的作用是过滤空气，避免杂菌污染培养基。,棉塞的制作是取适量棉花作成均匀片状，将一边向里折叠再将对面的另一边向里折叠，然后从一毛边开始将棉花卷紧。使之成为两边齐的一柱形，末端的棉絮自然地平贴在棉柱上。棉塞长度一般为4、5CM左右；最后将棉塞塞入试管内，塞入管内长度约为棉塞总长度的23。,58,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(2)母种（一级种）培养基的配制方法,塞棉塞,棉塞制作过程,59,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(2)母种（一级种）培养基的配制方法,塞棉塞,棉塞塞入试管后要紧贴管壁，不留缝隙，大小、松紧均要合适，既便于通气，又能防止杂菌侵入。检查松紧的方法是，将棉塞提起，试管跟着被提起而不滑下，表明棉塞不 松，将棉塞拔出，可听到有轻微的声音但不明显，这表明棉塞不紧。,60,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(2)母种（一级种）培养基的配制方法,塞棉塞,棉塞塞好后，每71O支包扎成捆，并在试管上部包上一层牛皮纸，用线绳扎紧。包纸的作用是避免灭菌时冷凝水淋湿棉塞，并能防止接种前培养基水分散失或杂菌污染。,61,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(2)母种（一级种）培养基的配制方法,灭菌及摆斜面 将包扎好的试管竖直放入手提高压灭菌锅内，105千克厘米2（0.11MPa），120灭菌30分钟，冷却到70左右，从锅内取出，趁热摆成斜面。一般斜面长度达试管长度的1/2为宜，待冷却后即成斜面培养基。灭菌的三角瓶中的培养基，倒入无菌培养皿中(每皿倒入1520毫升)，凝固后即成平板培养基。,62,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(2)母种（一级种）培养基的配制方法,灭菌后的培养基要进行无菌检查，取数支斜面培养基放人25左右的恒温箱中培养23天，若无杂菌生长便可使用。若暂时用不完，用纸包好放人4冰箱保存。,无菌检查,63,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(3)二级种、三级种培养基的配制方法,工艺流程,设计培养基质配方,按比例称量各物质,天然材料如棉籽壳、木屑等主料的预处理,混合,调节含水量,装瓶装袋,灭菌,冷却使用,64,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(3)二级种、三级种培养基的配制方法,常用培养料配方,阔叶树木屑78，,木屑麸皮培养料,米糠或麸皮20，,石膏1，,糖1。,65,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(3)二级种、三级种培养基的配制方法,常用培养料配方,棉籽壳68，,棉籽壳木屑培养料,木屑10，,麸皮或米糠20，,碳酸钙1，5，,石灰0.5。,66,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(3)二级种、三级种培养基的配制方法,常用培养料配方,玉米芯90，,玉米培养料,麦麸5，,玉米粉2，,葡萄糖1，,过磷酸钙1，,石膏1。,67,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(3)二级种、三级种培养基的配制方法,原种、栽培种培养基配制时应注意的问题,除针叶树松、杉、柏和具芳香、异味和有毒的樟、楠木等树种外，一般阔叶树的木屑均可利用。木屑需晒干保存。陈木屑比新鲜木屑好。松、杉木屑经陈放或加石灰堆制处理后可与杂木屑搭配用，用量占总量的13为宜。麻栎树等鞣酸高的木屑对香菇生长有利，但对其他食用菌菌丝生长有一定的抑制作用。使用时应加以选择。,麸皮、米糠要求新鲜，凡久存、变质、结块的麸糠，不再采用；麸糠的用量一般不低于15，不高于30；天冷可多些，天热宜少些；平菇、凤尾菇可少加些，金针菇应稍多些。香菇培养基中加米糠更好，而木耳以麸皮为好。,68,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,(3)二级种、三级种培养基的配制方法,原种、栽培种培养基配制时应注意的问题,碳酸钙应采用轻质碳酸钙，它与石膏可通用，熟石膏与生石膏有效成分相同。,白糖、饴糖、砂糖、甘薯糖等均可用，红糖更好。糖精不是糖，不可代替。,水应清洁无油污，每天首次使用的自来水，应先排放掉前面含铁锈高的一段水，而后再用于拌料。,配方中各种成分必须正确称取，不可随意增减。,加水拌制，就意味着杂菌开始生长、繁殖。因此，拌 料、分装至灭菌时间越短越好，特别是夏季，时间拖长，易引起培养基酸败、变质。,69,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,配制方法,(3)二级种、三级种培养基的配制方法,以棉籽壳、木屑为主的干培养料，应将其加水120-130，充分拌和：使其充分吸进水，使混合培养料含水量在55-65。其含水量可用手握法简单测定，抓一把培养料在手掌心，用力握捏，手指缝间有水迹渗出，但不成滴。,以小麦、玉米；稻谷为主料的，则应先将主料加水浸泡4-6h，然后加热煮沸1520分钟，麦粒、玉米不能煮得过软，以粒心尚有干白部分为度，然后捞出备用。对于辅料，则加少量水溶解后，与培养料混合即成。,70,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,装瓶灭菌,(3)二级种、三级种培养基的配制方法,为便于观察和接种，原种容器一般采用透明的专用菌种瓶；瓶口内径为3225MM，瓶径高度为40MM，容量为750ML。也可采用500ML罐头瓶；但因其瓶径大，易造成污染和干燥，且瓶颈过短，棉塞塞不牢固，易脱落。,71,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,装瓶灭菌,(3)二级种、三级种培养基的配制方法,栽培种容器采用瓶子外，也可用聚丙烯塑料袋，其规格长15CM、宽28CM、厚度0.06CM，过薄易破裂，感染杂菌。袋口套上塑料环，其高为2-3CM，直径4CM、采用塑料袋制种可节省掏瓶人工，减少麻烦.,除谷粒(玉米、麦粒等)料直接装至瓶肩处外，木屑、粪草等料都要松紧适度，过紧则接种后透气不良，菌丝生长缓慢；过松则菌丝生长虽快，但稀疏无力。装料时要压实，装料量以袋子的2/3为宜，使上部留有一定空间，有利于菌丝生长。,72,一、菌种的制作,5、菌种培养基的制备,装瓶灭菌,(3)二级种、三级种培养基的配制方法,装好料后，在料面中央从表面用木棒往下打一洞直至瓶(袋)底或接近瓶底。擦拭瓶(袋)，用棉塞塞好，然后用防水纸或牛皮纸将瓶口棉花塞包好，及时送入高压锅，在147KPa压力下灭菌1.5-2小时。,73,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(1)消毒与灭菌的概念,物品上存在着的微生物，为培养出食用菌的纯菌体，必须对食用菌栽培的各环节进行杀菌，这是生产中的一项基本技术。,消毒具有杀死致病微生物的作用或方法，称为消毒。就食用菌菌种生产而言，消毒是指用物理或化学方法杀灭或消除对食用菌生长发育有害的微生物，通常只能消灭物体表面或环境中的一部分微生物，但不能达到消灭所有微生物。,灭菌指彻底杀菌，用物理或化学等方法，杀死物体上的一切微生物，以及它们的芽孢和孢子，使物体成为无菌状态。,防腐 指防止或抑制微生物的生长繁殖，是一种抑菌作用，不能杀死微生物群体。,74,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,干热灭菌,烘烤灭菌法,焚烧灭菌法,湿热灭菌,高压蒸汽灭菌法,常压蒸汽灭菌法,间歇灭菌法,煮沸消毒法,巴氏消毒法,辐射灭菌,紫外线辐射,电离辐射,75,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,热力灭菌 是指利用高温杀死微生物的方法。高温可引起微生物蛋白质和核酸不可逆变性，细胞原生质凝固，酶被破坏，代谢停止，最后引起微生物细胞死亡，这种灭菌方法简便易行、经济有效，是食用菌生产中最普遍采用的消毒灭菌方法。,76,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,采用灼烧或干热空气进行的灭菌，称为干热灭菌。,焚烧灭菌法,通过火焰高温进行的灭菌。适用于耐热的接种工具如接种环、接种针、接种铲、接种匙等，以及试管口、玻璃瓶口的灭菌等，通过酒精灯几次火焰灼烧，一切微生物和芽孢可全部杀死。,干热灭菌,77,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,采用灼烧或干热空气进行的灭菌，称为干热灭菌。,焚烧灭菌法,干热灭菌,78,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,采用灼烧或干热空气进行的灭菌，称为干热灭菌。,干热灭菌,烘烤灭菌法,通过加热的高温空气进行灭菌的方法。电热干燥箱是干热灭菌的常用仪器，它是通过电热丝进行加温，既可灭菌，也可用于器皿的烘干。适用于固体材料的灭菌如培养皿、三角瓶、试管等，通常采用160灭菌2h，待温度下降到45以下，方可取出灭菌物品，否则玻璃物品会因温度骤然下降而破裂。,79,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,通过蒸汽杀死微生物的方法，称为湿热灭菌。在同一温度下，湿热 灭菌比干热灭菌效果好，因为湿热灭菌的穿透力比干热灭菌大，杀伤力强。蛋白质、原生质胶体在湿热条件下容易变性凝固，酶系统容易被破坏，而且蒸汽进入细胞内凝结成水，放出潜在热量而提高了环境温度，使杀菌力增强。,湿热灭菌,80,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,湿热灭菌,高压蒸汽灭菌法,利用高温高压蒸汽锅进行灭菌的方法。可以杀死一切微生物，包括细菌芽孢、真菌休眠体或孢子等耐高温个体。,在密闭系统中，蒸汽压力增高，温度也增高，从而提高了杀菌效力。它是一种有效的使用普遍的灭菌方法。,一般母种培养基及液体培养基灭菌采用1034kPa的压力，温度121.2，灭菌时间30分钟。如原种及栽培种等采用150kpa的压力，温度为128，灭菌时间为1-2小时。,81,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,湿热灭菌,高压蒸汽灭菌法,82,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,湿热灭菌,高压蒸汽灭菌法,在使用高压锅时，需注意要将锅内的冷空气全部排尽。如果锅内留有冷空气，当加热时，冷空气变热很快膨胀，使压力上升，造成灭菌锅内压力与温度不一致，产生假性蒸汽压，即假上磅现象。锅内实际温度低于蒸汽压对应的相应温度，致使灭菌不彻底而达不到灭菌目的。,83,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,湿热灭菌,高压蒸汽灭菌法,84,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,湿热灭菌,高压蒸汽灭菌法,85,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,湿热灭菌,高压蒸汽灭菌法,当开始加热灭菌时，先关闭排气阀，当压力升到5kPa左右时，打开排气阀，集中排出空气，让压力降到零，然后关闭排气阀进行升压灭菌。,86,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,湿热灭菌,高压蒸汽灭菌法,在高压灭菌过程中，其压力、温度、时间对营养成分有影响，可采用提高温度、压力和缩短灭菌时间的办法减少对营养成分的破坏。虽然温度升高了，破坏增加，但受热时间缩短，则总的破坏量减少。,87,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,湿热灭菌,常压蒸汽灭菌法,采用自然压力的蒸汽进行灭菌的方法。有蒸笼灭菌、流通蒸汽灭菌灶等。常见的是用钢筋水泥砌成大型的流通蒸汽灭菌灶，一般流通蒸汽温度为1OO，杀菌时间为6-8H。其灭菌容量大，可充分杀死微生物，有的一次可灭菌几千瓶菌种。,88,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,湿热灭菌,常压蒸汽灭菌法,灭菌灶结构简单，成本低廉，可自行建造，使用普遍，但是灭菌时间长，储耗大且常有灭菌不彻底的现象。,89,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,湿热灭菌,间歇灭菌法,指间歇一定时间，连续消毒几次而灭菌的方法，适合于不耐高温的培养基的灭菌，此法是在常压下加热到100，保持20-30分钟，以杀死其中的营养体细胞，然后将培养基在常温下或保温箱中(2837)培养，使芽孢发芽长成营养体，再用同法杀死新长成的营养体细胞，如此反复三次，即可杀死培养基中的全部芽孢和营养体，达到灭菌的目的。,90,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,湿热灭菌,煮沸消毒法,将物品放入水中煮沸一定时间进行消毒的方法。可杀死微生物的营养体，但对细菌的芽孢、真菌休眠体效果差。若在水中加入25的石炭酸或1的碳酸氢钠，可提高消毒效果。此法适于制种及栽培过程中所需的一些物品、器具、器材的消毒。,91,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,热力灭菌,湿热灭菌,巴氏消毒法,将物品在60-70度的温度下经一定时间消毒，杀死有害微生物的方法。适合于不耐高温的培养基以及一些食品如牛奶、酒类、饮料的消毒，既可杀死有害微生物，又不破坏营养成分。如在蘑菇培养基的发酵期间，通常采用60-62度的巴氏消毒法，消毒47h，可杀死培养料中的病虫杂菌。,92,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,辐射灭菌,利用辐射所产生的能量进行杀菌的方法，称为辐射灭菌。它可分为电离辐射和非电离辐射。a射线、射线、r射线、X射线等属电离辐射；紫外线等为非电离辐射。,93,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,辐射灭菌,紫外线辐射,在200300nm范围内紫外线的杀菌作用最好。紫外线的杀菌作用是因为它可以被蛋白质(约280nm)和核酸(约260nm)吸收，造成变性失活,引起致死。紫外线的另一杀菌机制是因辐射空气产生臭氧，臭氧遇水又化合成双氧水，这两种物质都能杀菌。,94,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,辐射灭菌,紫外线辐射,无菌室、接种箱、超净工作台内安装的紫外线灯管，一般照射20-30min，可杀死空气中的微生物。但紫外线穿透力很弱，一层普通玻璃或水均能滤去大量的紫外线，它也不能穿过衣物、纸张等大多数物体。因此，紫外线只适用于空气和物体表面的消毒。,95,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,辐射灭菌,紫外线辐射,我国蘑菇生产中使用的覆土，在日光下曝晒，就是利用日光及其中的紫外线进行杀菌。但必须注意，经紫外线照射致死或损伤的微生物，通过自然光照又能复活，称为光复活作用。因此，经紫外线杀菌后，不要立即开启日光灯。如白天灭菌，无菌室、接种室需用黑窗帘或黑布套遮光半小时，以防止光复活作用，提高灭菌效果。紫外线对人体有害，特别对眼睛有损伤，因此，不能在开启的紫外灯下工作。,96,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,辐射灭菌,将被照射物质的原子核周围的电子击出，使其变为阳离子，击出的电子可附着在其它原子上，使其变成阴离子，也可以再冲击其它原子，引起继发电离。在液体中，射线使水电离成H+和OH一，可直接作用于微生物细胞本身而致死。,电离辐射,97,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,药剂消毒,利用化学药剂进行杀菌或抑菌的方法称为药剂消毒,重金属盐类,微生物浸在O1-05硝酸银、升汞溶液中，几分钟就会死亡。食用菌组织分离及菇木分离菌种时，常用01升汞溶液进行表面消毒。,98,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,药剂消毒,利用化学药剂进行杀菌或抑菌的方法称为药剂消毒,氧化剂,常用于消毒的氧化剂有：1高锰酸钾、1过氧化氢、02-05过氧乙酸、051漂白粉等。其杀菌机制是通过强烈的氧化作用，破坏微生物的原生质或酶蛋白质结构。,99,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,药剂消毒,利用化学药剂进行杀菌或抑菌的方法称为药剂消毒,还原剂,甲醛是常用的杀菌还原剂。市售的福尔马林含37一40的甲醛溶液。5的甲醛溶液常用于防腐。培养室、无菌室消毒常以lOmLm3福尔马林原液加5g高锰酸钾氧化熏蒸。甲醛能与微生物细胞蛋白质的氨基结合，引起蛋白质变性，使原生质失去正常活动能力。,100,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,药剂消毒,利用化学药剂进行杀菌或抑菌的方法称为药剂消毒,还原剂,喷雾消毒时甲醛溶液体积分数为5。甲醛还有防腐作用，以1：9稀释液可浸制食用菌标本。但甲醛有毒，对人的眼睛、呼吸道、皮肤等有强烈刺激，应注意防护。,101,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,药剂消毒,利用化学药剂进行杀菌或抑菌的方法称为药剂消毒,表面活性剂,表面活性剂主要破坏菌体细胞膜结构，造成胞内物质泄漏；蛋白变性，菌体死亡。025肥皂溶液是一种阴离子表面活性剂，它对链球菌作用比01升汞或07来苏尔还要强。常用的025新洁尔灭液用于皮肤消毒，它是人工合成的季胺盐阳离子表面活性剂。,102,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,药剂消毒,利用化学药剂进行杀菌或抑菌的方法称为药剂消毒,酚 类,常用的苯酚又称石炭酸，其05可用于皮肤消毒，25%可用于器皿消毒，5可用于空气喷雾消毒。来苏尔是甲酚与肥皂的混合液，常用其35%消毒皮肤、用具；接种箱表面以及器皿。,103,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,药剂消毒,利用化学药剂进行杀菌或抑菌的方法称为药剂消毒,醇 类,醇类可使膜受伤，同时能使蛋白质变性：通常使用乙醇。无水乙醇与菌体接触后使细胞迅速脱水、表面蛋白凝固，在菌体表面形成保护膜，阻止乙醇分子进一步渗入，影响杀菌力。在实际工作中常使用75的乙醇，杀菌效果最好。,104,一、菌种的制作,6、消毒与灭菌,(2)常用消毒和灭菌方法,过滤除菌,对含有加热不稳定物质的培养基