附睾上皮细胞通过附睾小体调节精子成熟的研究进展（全文）.docx

附睾上皮细胞通过附睾小体调节精子成熟的研究进展（全文）摘要哺乳动物睾丸中产生的精子缺乏运动性，而且不具备受精能力，因此在功能上尚不成熟。附睾是男性生殖道中一段非常特别、高度盘绕折叠的小管，附睾各段通过上皮细胞分泌和吸收活动的共同协作用，实现高度区域化，保证不同区段精确的功能划分。精子在附睾近端完成功能上的成熟，在远端以静息状态储存以备射精，这一过程依赖于附睾管腔特殊的微环境。附睾管腔的微环境极为复杂，目前已证实其中含有多种无机离子、蛋白质和胞外囊泡（附睾小体）。附睾小体中包含多种蛋白和sncRNA,可直接或间接促进精子成熟。本文综述了附睾管腔微环境的特点，特别关注了附睾上皮细胞产生的附睾小体对精子成熟的影响。哺乳动物的附睾连接睾丸与输精管，是一段长而高度盘曲的小管。解剖学上一般将该结构分为三个区段：头部、体部和尾部，在某些种属如小鼠和大鼠，附睾的头部近端也被称为起始部1o附睾为精子成熟和储存提供最适宜的环境,这有赖于其高度区域化的特征2o输出小管和头部近端吸收大部分进入小管的睾丸液，使精子得以浓缩。附睾头部合成和分泌蛋白质的功能非常活跃，一部分经过此处的精子具有了运动和识别卵细胞的能力。精子在附睾体部继续成熟，在尾部最终完成成熟。附睾尾部的管腔相对较大，而且上皮细胞表现出强吸收能力3,这与尾部储存精子的功能相适应。目前认为，附睾上皮细胞的分泌吸收活动使得附睾管腔微环境非常特殊，精子在此贯序成熟。附睾上皮细胞通过顶浆分泌的方式产生的外泌体样囊泡被定义为附睾小体，他们通过转运各种蛋白和非编码小RNA（smallnon-codingRNA,sncRNA）促进精子成熟。此外有证据表明，附睾小体的转运功能受环境应激因子的影响4,这对于研究精子表观遗传、蛋白质组学、子代发育和健康的启示意义目前刚刚被认识到。本综述首先介绍附睾管腔微环境的特点，然后较为详细地探讨囊泡依赖的附睾上皮细胞与精子之间的串话调节机制。-附睾管腔微环境的特点精子从睾丸中产生后，并不具备受精能力而且缺乏运动性，它需要经过附睾管才能逐渐成熟。附睾管腔内存在大量的无机离子和有机小分子,使得附睾液呈现低钠、高钾、低钙、低HCo3-浓度和PH值偏低的环境。附睾管腔微环境稳态是保障精子成熟、获得受精能力、储存和保护精子的重要条件。特定基因的缺失会使附睾管腔微环境异常，从而导致雄性不育或生育力降低（表1）。附睾上皮由不同细胞类型组成，包括主细胞、亮细胞、狭窄细胞、基细胞和免疫细胞（树突状细胞和巨噬细胞）等。在附睾管的不同节段，各种细胞的含量并不相同。相关的功能研究证实，这些细胞的空间分布不同，在雄激素和其他因子精确调控下，对精子的成熟、保护和储存发挥着独特的作用。表I影响小H时尔臂腔微环境的牧因破除类嗔破除国因类型生育表型时零管腔员环境变化学生文献ZI不H附本液低澹11架M性,曲率液不被收吸收.跑内囊泡增加5而1小H时军械体抵海(6JCrm不W起雄邻发育跳陷.M1腔PH升高(7-Dicrfl生育力降低附隼近端的代谢平所失1.上皮去分化.性激Jlf半J被破爆9-10Kix生奇力仔低成热延迟.生K过程中胶爆沉机用加11/r6不育射率变小.液体市吸收失*12Lur<InioAtfronrtn>almenl)生力降低附掌灸解13Errt不育钠国的承吸仪相水的被动运修被Hlitt常的附事国邀结构14、吊3相r的嗔吸收和水的被动运承装现断14Ixr不守好常的中性脂质的根累15不育丛生生门和PHC&击门功傩法悔.比剪桁的成氨16Fihr生育力降低头部和体端上皮细跑表刚枳谶小(17)C*5螺产率更高料了代发H缺陷足那活性仅过St等致精了气化性副伤118JHoutlO生育力修低时事出现同源好量转化19Hmull不<r附睾出现同谭k型转化201/rxm不育（与年总有美）也谷底粉不ItR跳21Tmf不育时兴缰蛆凋亡.精了停滞在:见322TX生育力降低附军除肉广收障即23SMA3不百管腔内分够异»靖多11钙化241 .附睾上皮：主细胞是附睾的主体细胞，构成高达80%的小管上皮。附睾近端的主细胞在蛋白质合成和分泌方面格外活跃。主细胞含大量有分泌功能的细胞器，如内质网、高尔基体和分泌颗粒，特别是在附睾管近端（头部和体部）有活跃的胞吐活性。在附睾管远端（尾部），主细胞主要发挥胞吞作用，其通过受体例如低密度脂蛋白受体相关蛋白2（low-densitylipoproteinreceptor-relatedprotein2,LRP2）介导机制摄取附睾管腔内容物，和亮细胞一起重吸收附睾液25o亮细胞广泛分布于头部和体部，但富集在尾部。亮细胞顶部富含胞吞结构，故有极强的胞吞能力，主要负责选择性地吸收管腔内容物并调节管腔pH。尤其是附睾远端的亮细胞这一特点更加突出，摄取并清理精子成熟过程中脱落的细胞质液滴,再循环腔内各种其他成分。亮细胞顶部还含有一些调节管腔PH的关键分子，如V-ATP酶、碳酸酊酶n、可溶性腺甘酸环化酶,这些对于管腔PH有重要的调节作用25-27o基细胞在附睾的不同节段呈现出不同的形态，起始部和头部的基细胞主要分布在主细胞以下的基底膜面，呈半球状，两端分别与基底膜和主细胞紧密相贴；而从体部到尾部近端，越来越多的基细胞伸出狭长的突起结构，穿越主细胞之间的紧密连接，与附睾腔面直接接触。有研究表明，基细胞通过旁分泌途径，调节亮细胞V-ATPase的聚集28。狭窄细胞和顶细胞主要分布在附睾起始部29,功能尚不明确。附睾上皮其他类型的细胞，推测其功能主要和免疫相关，男性生殖细胞因表达机体其他部位所没有的抗原而具备高抗原性。实际上，附睾管腔环境和成熟中的精子因血-附睾屏障的存在而与免疫监控相隔离，这一屏障由相邻上皮细胞间的紧密连接构成。附睾管由结缔组织隔分隔成许多小的区域，形成连续的、节段特异性的管腔微环境。大部分睾丸液在到达附睾近端之前被重吸收，附睾管的假复层上皮细胞主要分泌管腔液的组分。附睾液中含有大量离子、蛋白质和非编码RNA29z这些成分的分布都具有节段特异性，表明不同节段的附睾细胞具有不同的分泌和吸收功能。2 .附睾管腔液成分：附睾液中的离子成分与已知的其他体液的差异悬殊。与血浆相比，Na+、Cl-.Ca2+和HCO3-的浓度均较低,这与管腔的酸环境高度相关，以保证精子处于静息状态30。性兴奋等事件刺激附睾主细胞分泌HCO3-和Cl-,离子浓度变化被相邻亮细胞中的噤吟型受体感应，进而碳酸氢盐敏感的腺首环化酶激活下游ATP酶质子泵在亮细胞顶部重新定位，质子泵分泌H+使得管腔环境进一步酸化。这种细胞间的串话通过胞膜上的若干受体包括主细胞中的囊性纤维化跨膜转导调节因子（cysticfibrosistransmembraneconductanceregulatorzCFTR)和亮细胞中的Na+HCO3-协同转运体(Na+HCO3-co-transporterzNBC)介导。ATP酶在亮细胞顶部的聚集需要胞内的Ca2÷,因为Ca2+可以动态调整肌动蛋白细胞骨架。Ca2+也可通过位于精子鞭毛主段的阳离子通道(CATSPER)进入精子，直接调节精子的功能。敲除CatSPer将阻止Ca2+流入，进而精子运动性降低31。附睾管腔液中存在丰富的蛋白质成分。在人附睾中，77%的管腔蛋白由10种蛋白质组成：白蛋白(albumin,HAS)(43.8%)、凝集素(clusterinzCLU)(7.6%)、尼曼-皮克病C2型(Niemann-PickdiseasetypeC2,NPC2)(6%)、乳铁蛋白(IaetOferrin,LF)(5.9%)、细胞外基质蛋白(extracellularmatrixprotein,ECM1)(3.2%)、Cd-抗胰蛋白酶(Cd-antitrypsin,A1AT)(2.7%)、前列腺素D2合成酶prostaglandinD2synthase,PTGDS)(2.2%)、附睾蛋白3(humanepididymalprotein3,HE3)(1.7%)、转铁蛋白(transferrinzTF)(1.3%)、肌动蛋白结合蛋白(actinbindingproteinzABP)(1.2%)。这些附睾蛋白大多具有许多异构体的特点这些异构体的产生是由于其高度的翻译后修饰,如糖基化32oCLU作为附睾管腔中的主要蛋白质成分之一，是蛋白质的胞外伴侣，在小鼠附睾中，由头部主细胞表达，广泛存在于管腔内，参与脂质转运、细胞凋亡过程中的膜重塑和蛋白质分子调控，有抗氧化应激和补体诱导细胞裂解的保护作用，阻止蛋白聚集和沉淀，对精子成熟和获能很重要。在附睾尾部管腔的微酸性PH环境下,CLU可结合部分管腔蛋白，将其递送至精子表面。有研究表明CLU能与小鼠附睾管腔内大量存在的重要卵结合蛋白1(sperm-eggbinding1,SED1)相互作用，在一些非获能精子中，CLU和SED1的部分共定位，获能后两者分离，CLU移动到精子头部钩型区域,SED1转移到卵子结合位点33。另一附睾蛋白NPC2,包含一个功能性胆固醇结合位点，可以在膜之间转移胆固醇，精子膜的胆固醇含量在附睾成熟和雌性生殖道获能过程中发生动态变化，NPC2可能参与附睾成熟期间精子中胆固醇水平的调节。此外，与野生型小鼠相比，NPC2敲除小鼠精子具有缺陷的酪氨酸磷酸化模式，使得卵丘-卵母细胞复合体的受精能力降低，这表明NPC2与雄性生育能力相关34。有研究利用免疫组织化学方法，检测到LF位于附睾头部和尾部的主细胞胞质内，并且仅在青春期及青春期后的动物体中表达，同时在精子的中段和尾部也观察到LF的免疫标记，这提示LF结合于精子并发挥一定的保护或调节作用35o附睾管腔的另一特点是存在丰富的胞外囊泡。早在1985年，Yanagimachi等36就在仓鼠附睾精子的近表面处鉴定出了一定数量的膜性囊泡，并推测其可能向成熟精子运输胆固醇。这些囊泡在一些物种如小鼠、大鼠、公牛、人类的附睾液中已被证实存在37,现在这种附睾腔中的囊泡普遍被认为是附睾小体。附睾小体的特征为相对小的囊泡(50500nm)、内有各种大分子和膜富含胆固醇38,推测其功能为促进精子成熟，可能通过直接与精子接触传递信号，也可能通过向上皮细胞运输物质间接调节精子成熟。二.附睾小体介导的体细胞精子间通讯附睾小体是附睾上皮细胞通过顶浆分泌的方式产生的外泌体。主细胞的顶浆分泌是附睾中主要的分泌方式之一，其特点是在细胞顶部边缘合成及释放囊泡状结构（例如顶端小泡），释放膜状的胞外囊泡即附睾小体。随着囊泡在管腔中被降解，其内含物传递与精子和下游上皮细胞间的通讯（图1）。这种方式为不可通过局浆分泌运输到附睾腔内的物质提供了一种转运途径，如缺少内质网信号肽序列和/或含有糖基磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidylinositolzGPI）锚的蛋白39o这些蛋白在高尔基体内翻译修饰，被包裹成附睾小体，逐渐聚集成大的泡状结构，从上皮细胞顶部边缘形成突起，以出芽方式（可能是通过细胞骨架蛋白如肌球蛋白和-肌动蛋白的重排实现）与细胞分离并脱落到管腔。释放后的附睾小体，可以作为一种运输载体，将物质运输到精子表面，直接参与精子成熟的调节。附睾小体作为一种物质传递的中介，为附睾中体细胞和精子间交流提供了一种方式，其可以运输高分子复合物到精子，这些复合物包括数百种蛋白质和SncRNAso近年来越来越多的证据表明附睾小体中的功能蛋白和SncRNAs可参与调节精子成熟过程。图I附笔小体介导的尉第卜皮。精f的交通方式1.附睾小体相关蛋白对精子成熟的影响：蛋白质组分析显示，人类和公牛的附睾小体含有数百种蛋白质(包括酶、分子伴侣、结构蛋白和许多迄今功能未知的蛋白)。已知其中一些蛋白在附睾中可被直接运输到特定的精子区域，促进精子的功能成熟。典型的例子是巨噬细胞游走抑制因子(macrophagemigrationinhibitoryfactor,MlF),一种在多种组织中广泛分布和有多种功能的细胞因子。在大鼠和牛的附睾中，MIF从附睾小体转运到精子鞭毛的纤维鞘中，进而影响精子的运动能力37o又如，GPI锚定蛋白P26hP34H家族成员(仓鼠的P26h,牛的P25b,人的P34H),原本位于附睾小体中，然后被锚定到精子顶体表面。研究表明，这些蛋白质为精子与透明带结合所必需，是受精成功的前提38。其他被转运的蛋白还包括膜相关、跨膜和GPI锚定候选蛋白等。附睾小体可能为精子提供一种重要的物质运输方式一一装配好的蛋白质复合体。精子和附睾小体体外共孵育的研究为观察这一运输模式提供了直接证据，蛋白复合体MCA4a-PMCA4b-CASK在附睾小体中直接被免疫共沉淀出来40在最佳的体外孵化条件(pH=6.5,高浓度的Zn2÷)下，这一蛋白质复合体被运输到雄性配子关键功能区域顶体和鞭毛中段37o我们的研究也证实，Y-谷氨酰竣化酶(-gutamylcarboxylase,GGCX)与其底物基质Gla蛋白(matrixGlaprotein,MGP)的共定位主要集中在附睾体部和尾部的主、亮细胞及管腔中的囊泡状结构，协同维持附睾管腔钙稳态，提示GGCX和MGP可能参与囊泡介导的上皮细胞和精子间通讯，二者以附睾小体的方式共同分泌到附睾管腔中，使得MGP在精子周围环境中结合Ca2÷41还有研究表明，牛附睾不同节段的附睾小体能够将不同的蛋白质运输到精子上，研究者观察到，在与牛附睾精子共孵育期间，从附睾头部收集的附睾小体不会明显影响尾部附睾小体的转运功能42o从牛附睾液中发现附睾小体根据大小和分子组成不同可以分为两个独立亚群，其中较小群体的直径为10-100nmx富含有四次跨膜微区的CD9及协同分子CD26,同时含有相对高浓度的其他蛋白质，如MIF和P25b,易与活精子发生反应，在精子成熟过程中发挥作用；另一亚群的特征是含附睾精子结合蛋白1,易与死精子反应38。附睾小体的异质性及其选择性地与不同状态精子反应的能力说明，这些反应可能受到严格的调控。2 .附睾小体中SnCRNA对精子成熟的影响：除了蛋白质外，附睾小体也含有不同的SncRNA,包括miRNA和tRNA片段43-44与蛋白质一样，这些SncRNA也可以被直接转移到成熟精子中。对雄性小鼠施以饮食干扰（如低蛋白饮食）可以显著影响附睾的sncRNA谱，同时，这些变化也出现在精子的sncRNA谱中，而附睾小体被认为是将附睾sncRNA运输到精子的载体。随后，精子在受精过程中可将这些sncRNA传递到卵母细胞，再通过作用于特定的基因，对早期胚胎发育进行表观遗传控制44。这些发现有助于更深入地理解附睾小体物质包裹和运输的机制以及物质被转运到下游细胞的方式，也有助于研究载体对成熟精子功能的影响程度。检测小鼠附睾头部近端收集的精子，miRNA是最丰富的SncRNA种类45。因miRNA（2125核昔酸）对mRNA的翻译起到关键抑制作用，受到了极大关注。现在，基因芯片和高通量测序技术的应用已经实现了对人（545个）和小鼠（370个）附睾全部miRNA的鉴定2。大部分miRNA在附睾的不同节段，甚至在不同物种之间是保守的，保守序列的比例在小鼠附睾中为75%,在小鼠和人之间达31%,表明这些miRNA在调节附睾稳态中发挥着看家基因的作用。相比之下，其他miRNA的表达具有显著的节段特异性（在小鼠附睾中为15%）o例如，小鼠附睾的尾部和头部相比，miR-204-5p和miR-196b-5p分别被显著上调和下调约39倍和45倍。而每种miRNA都有调节多个靶点的可能性，使得这些差异表达的生物学意义更显著。例如，靶分子预测分析显示，分别有530个和160个基因有可能是miR-204-5p和miR-196b-5p的靶点46因此，miRNA在附睾各节段的差异表达极大地增加了附睾各节段微环境调控的复杂性。附睾miRNA差异表达的确切机制尚未研究透彻，但无疑受雄激素和其他来自睾丸的分泌因子的影响。另外，也有学者提出，从附睾近端产生的miRNA,可能被附睾小体选择性地运输到下游节段中作为接受者的上皮细胞内473 .附睾小体与精子的作用机制：对于附睾小体与精子结合的机制，有研究指出，附睾小体可能是通过GPI锚定到精子表面脂质双分子层的外面开始的，并推测这种锚定是在附睾小体和精子的膜融合之后进行的39o因CD9的黏着/融合特性，该四次跨膜蛋白可作为调节融合作用的候选蛋白。相应地，抗CD9抗体能够降低蛋白质从附睾小体到精子的转移效率48。考虑到附睾小体与精子的相互作用在物质转运和不同精子群中的选择性，推测CD9不是唯一的候选蛋白，如在牛的附睾中，不具有CD9的附睾小体亚群仍能与精子反应。由于脂筏在受体螯合中的作用，有研究认为脂筏可作为一个"平台，促进附睾小体和精子膜的融合。脂筏富含胆固醇和鞘脂49,同时分布有GPl锚定蛋白，如P25b和SPAM139,这些蛋白与附睾小体和精子的黏附有关。精子脂筏在胰蛋白酶/链霉蛋白酶的作用下，解离出P25b和SPAM1,使得附睾小体与精子的物质转运效率明显降低49。但脂筏完整性的破坏（如通过-甲基-环糊精的胆固醇螯合作用）是否会影响附睾小体与精子融合仍有待研究。有研究认为附睾小体和精子间的作用可能不涉及各自膜的完全融合50。附睾小体黏附后可能会产生一个瞬时融合孔，一旦物质转运完成，就释放附睾小体。附睾小体和精子的蛋白质组学分析已经鉴定出众多互补转运蛋白（如SNARE蛋白、Ras样蛋白和发动蛋白），可以参与调节这种形式的细胞内交流。这种不完全融合的转运方式有利于促进蛋白质和大分子物质与成熟精子之间的双向交换。这也解释了为什么有一部分附睾小体保留在精液中而未被精子完全吸收。但现在仍未有充分证据验证上述转运蛋白与精子-附睾小体反应有关，也未证实附睾小体可以分离精子中的蛋白。在体外实验中，将来自附睾头部中端的附睾小体进行脂质标记（Dilc12）,发现其可与头部远端的上皮细胞相结合51。这一结合过程具有时间依赖性，荧光成像显示上皮细胞与附睾小体作用后，DiICI2在上皮细胞内呈点状分布。这种模式与在其他组织模型中观察到的外泌体与体细胞相互作用情况一致52,即精子并非附睾小体的唯一受体。三.小结附睾微环境因含大量来自上皮细胞的胞吞、胞吐内容物而高度特化，这对不可转录和翻译的精子的成熟和储存是非常重要的。因此，了解附睾上皮细胞如何促进这些过程的分子机制以及附睾上皮与精子之间以何种方式进行物质交流，将有助于我们了解男性生殖调控，对男性避孕干预和不育诊治有重要意义。