BCA法测定蛋白质含量ppt课件.ppt

分光光度计的基本原理是基于物质对不同波长的光的选择性吸收，不同的物质都有各自的吸收光谱。当白光通过某一溶液时，其中某些波长的光会被溶液吸收。,光吸收程度达到最大值的波长，为最大吸收波长，用max示。,分光光度计的基本原理,LambertBeer定律,A=KCL,定义：一束单色光通过介质溶液后，光能被吸收一部分，吸收多少与溶液的浓度和厚度成正比。,1、只适用于单色光；max2、仅适用于稀释溶液；3、对于混合稀释溶液，应该尽量去除干扰物质；（空白管）4、A值控制在0.20.8之间。,（A：吸光度；K：吸光系数；C：吸光物质的浓度；L：吸收层厚度）,思考：根据该定律，如何计算待测物的浓度？,LambertBeer定律的应用,1.利用标准管计算测定管浓度(标准管法),用一已知浓度的测定物(标准管)按测定管同样处理显色，读取吸光度，再根据A=KCL计算。,同一台仪器比色皿内径相同（L标=L测）,标准管和测定管为同一物质,吸光系数相同（K标=K测），,A测=K测C测L测,A标=K标C标L标,C测=A测/A标C标,配制一系列的标准管，然后绘出标准曲线。再测出测定管的吸光度，在标准曲线上查找到对应浓度。,时间:仪器型号:仪器编号:作图者:,A,2.利用标准曲线法进行换算测定物浓度（标准曲线法）,思考：试比较两种方法优缺点。,A待测,C待测,预热 打开电源开关，打开样品室，使仪器预热20分钟。调波长 转动波长手轮，调至所需要的单色波长。调节T=0%调节功能键到“T”档，空白溶液、待测溶液依次放入样品室，使空白溶液对准光路，按下“0%”键，使数字显示为“0.000”。（此时样品室必须是打开的）调节T=100%把样品室盖子轻轻盖上，按“100%”键，使数字显示正好为“100.0”。调节A=0 将功能键调节至“A”档,此时数字显示为“.000”。如果不是，则按T 100（即A 0键）6.吸光度测定 拉动拉杆使待测液依次进入光路，读取A值。7.关机 冲洗比色皿，关电源。,使用步骤,打开样品室盖，切断光路,蛋白质 定量 BCA法,什么是蛋白质？其元素组成？基本组成单位？分子结构？结构与功能的关系？理化性质？如何分离纯化？,定性？定量？,BCA法是根据蛋白质什么性质？,是什么或者有什么？有多少？,为什么蛋白质可以定量测定？基于什么原理？,呈色反应,A=KCL，标准管法或者标准曲线法计算,一.实验目的,1、掌握BCA法测定蛋白质浓度的原理及操作；2、掌握722型分光光度计、移液管的正确使用、试剂盘的正确摆放以及用标准曲线法计算蛋白质的浓度；3、了解蛋白质含量测定的多种方法。,二.实验原理,BCA分子式,BCA试剂盒,在碱性条件下，蛋白质将Cu2+还原为Cu+，Cu+与两分子BCA（二辛可酸）反应形成紫蓝色的络合物，测定其在562nm处的吸光度值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白质的含量。,二.实验原理,562nm,A562M蛋白质,二.实验原理,采用标准曲线法计算待测液含量,A待测,m待测,45,作图人：仪器型号：722型分光光度计时间：波长：562nm,BCA法测定蛋白质含量标准曲线,试剂盘摆放及移液管选择,试剂盘摆放：试剂在左，移液管在右侧取试剂时，将试剂和相应的移液管拿出试剂盘，用完之后放回原处，谨防试剂污染。,三.实验步骤,取7支试管按下表编号并操作：（平行加样、准确量取）,将上述各管混匀后于37C保温30分钟，用562nm 波长比色测定吸光度值。,三.实验步骤,1、以蛋白质含量为横坐标，A值为纵坐标，绘制标准曲线。2、用测定管光吸收值在标准曲线上查找相应的蛋白质含量m,再计算出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。注意：最后浓度单位要统一换算成g/L,小牛血清正常范围为：30-50g/L,原始数据,仪器名称、型号编号：波长：测定日期：测定人：,BCA法测定蛋白质含量,四.注意事项,1、实验分组，两人一组2、试剂盘的摆放：专管专用，防止污染3、准确量取试剂，正确使用吸量管4、正确操作722型分光光度计，此次由于溶液体积较少，比色皿不需要待测溶液润洗5、正确绘制标准曲线，标明名称、仪器、作图人、时间等6、实验原始数据书写规范，三线表7、待测液(小牛血清)已经稀释了500倍，,BCA试剂盒,BCA法广泛用于科研工作，其特点：1、操作简便，快速2、准确灵敏，试剂稳定性好3、经济适用4、抗试剂干扰能力较强，不受绝大部分样品中的去污剂、尿素等化学物质的影响,各种方法比较,