DNA的提取及鉴定ppt课件.ppt
DNA的提取及鉴定,一、动物肝脏中DNA的提取,一.实验目的 学习和掌握用浓盐法从动物组织中提取DNA的原理和技术 了解分离提取DNA的一般原理,DNA的主要来源1.动物组织及器官：脾、肝、胸腺、鱼类精子等。2.植物：种子的胚芽等3.微生物：细菌、酵母菌等 核酸和蛋白质在生物体中以核蛋白的形式存在，其中DNA主要存在于细胞核中，RNA主要存在于核仁及细胞质中。,核酸提取的主要步骤：1.破碎细胞：研磨、组织匀浆、超声波、冻融；一硫氰酸胍、碱裂解；酶解（溶菌酶）2.除去与核酸结合的蛋白质以及多糖、脂类等生物大分子：酚/氯仿抽提、蛋白质变性（SDS、异硫氰酸胍等）、蛋白酶处理、高盐洗涤3.除去其他不需要的核酸分子4.沉淀核酸，去除盐类，有机溶剂等杂质,生物体组织细胞中的脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA），大部分与蛋白质结合，以核蛋白脱氧核糖核蛋白（DNP）和核糖核蛋白（RNP）的形式存在，这两种复合物在不同的电解质溶液中的溶解度有较大差异。在低浓度的NaCl溶液中，DNP的溶解度随NaCl浓度的增加而逐渐降低，当NaCl浓度达到0.14mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的1%（几乎不溶）；但当NaCl浓度继续升高时，DNP的溶解度又逐渐增大，当NaCl浓度增至0.5mol/L时，DNP的溶解度约等于纯水中的溶解度，当NaCl浓度继续增至1.0mol/L时，DNP的溶解度约为纯水中溶解度的2倍（溶解度很大）。而RNP则不一样，它在浓NaCl溶液和稀NaCl溶液中的溶解度都很大。因此，可以利用不同浓度的NaCl溶液将DNP和RNP分别抽提出来。,二.实验原理,将抽提得到的DNP用十二烷基硫酸钠（SDS）处理，DNA即与蛋白质分开，可用氯仿-异丙醇将蛋白质沉淀除去，而DNA溶于溶液中，加入适量的乙醇，DNA即析出，进一步脱水干燥，即得白色纤维状的DNA粗制品。为了防止DNA(或RNA)酶解，提取时加入乙二胺四乙酸(EDTA)。大部分多糖在用乙醇或异丙醇分级沉淀时即可除去。DNA中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应。,动植物的DNA核蛋白能溶于水及高浓度的盐溶液，但在0.14mol/l的盐溶液中溶解度很低，而RNA核蛋白则溶于0.14mol/l盐溶液，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。在核酸分子中，由于磷酸基的存在，使其酸性占优势，DNA或RNA都能溶于水中，而不溶于有机溶剂。用络合剂EDTA抑制核酸水解酶的活力,同时用去污剂SDS把蛋白质和DNA分开,再用氯仿-异丙醇作为蛋白质的变性剂沉淀蛋白质,最后用乙醇把DNA沉淀出来。,三、提取DNA的注意事项,1.避免过酸、过碱及高温2.加入DNA酶抑制剂：柠檬酸、氰化物、砷酸盐、EDTA、SDS、苯酚等3.蛋白变性剂反映不宜过于剧烈，以防机械张力使核酸链破坏。4.加入RNA降解酶除RNA5.操作迅速,四、实验器材,1.捣碎机 2.离心机 3.手术剪 4.离心管 5.刻度吸管 6.烧杯（100ml，250ml）7.玻棒 8.新鲜动物肝脏 9.石英比色皿 10.量筒（10ml，100ml）11.容量瓶（50ml）,五、实验试剂,1、0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠溶液（pH6.8）。2、0.015mol/LNaCl-0.0015mol/L柠檬酸三钠溶液：氯化钠0.828克及柠檬酸三钠0.341克溶于蒸馏水，稀释至1000ml。3、95%乙醇（A.R.）。4、NaCl固体（A.R.）。5、5%SDS溶液：5gSDS溶于100ml水中。6、氯仿（A.R.）。7、V（氯仿）：V（异戊醇）混合液20：1,六、实验操作,1）粗提 1称取猪肝8g于100ml的小烧杯中，用剪刀剪碎，加入2倍重的0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液（16ml），高速匀浆。2将匀浆液（25ml）转移到100ml离心管中，在4000r/min下离心10min，弃去上清液。沉淀中继续加入25ml缓冲液，搅拌均匀后于4000r/min离心20min，取沉淀。2）分离DNP、除蛋白 3将上述沉淀转移至250ml烧杯中，加入40ml0.1mol/LNaCl-0.05mol/L柠檬酸钠缓冲液、21ml氯仿/异戊醇、4ml5%SDS，用保鲜膜封口，振摇30min。4缓慢加入3.6gNaCl（事先在研钵中研成粉末）使体系终浓度为1mol/L。将混合液转移至离心管中于3500r/min离心20min，取上清水相（用滴管吸取并量体积）。,3）沉淀DNA 5在水相中加入等体积95%乙醇，边加边用玻璃棒朝一个方向慢慢搅动直至溶液澄清，将DNA凝胶缠绕在玻璃棒上，用滤纸吸去多余的乙醇，得DNA粗品。【注】用玻棒缠绕DNA有困难时，亦可缓慢摇动烧杯以助于DNA聚集。6将DNA粗品用5mmol/L NaOH溶解并定容至50ml，作为待测样品。,DNA鉴定或定量（二苯胺法）：颜色反应可先完成标准曲线的制作，或配置一个标准管。,CECS 694-02 Introduction to Bioinformatics University of Louisville Spring 2004 Dr.Eric Rouchka,(二)二苯胺法测定DNA含量,二、原理 核酸含量的测定方法包括紫外吸收法、定磷法和分别针对DNA和RNA的颜色反应方法 本实验采用针对DNA的二苯胺法测DNA的含量。在酸性溶液中，DNA与二苯胺共热生成蓝色化合物，该物质在595nm有最大吸收，在40400mg/mL范围内其峰值与DNA含量成正比,DNA鉴定或定量（二苯胺法）：空白管 标准管 测定管标准DNA溶液 0 1.0 待测样品溶液 1.0蒸馏水 2.0 1.0 1.0二苯胺试剂 4.0 4.0 4.060C水浴30-40min，冷却，595nm比色。计算：C测=C标*A测/A标 w=C测*50ml/8g(DNA g/g 样品),七、注意事项,1、匀浆（破碎细胞）要充分，需剪成小块。2、固体NaCl应磨碎，加入应分批慢慢加入，且边加边摇，避免局部浓度过大或未及溶解而沉入氯仿层。3、变性蛋白质层易散，吸取上清液时应仔细，不要将蛋白质及下层的氯仿吸入。4、实验结束后将变性蛋白质（肝糜）小心取出置于专用废物袋中，氯仿倒入回收瓶内。,
