重金属污染降低水稻土微生物商并改变PLFA 群落结构——苏南某地污染.docx

重金属污染降低水稻土微生物商并改变PLFA群落结构苏南某地污染稻田的案例研究阎姝，潘根兴，李恋卿*南京农业大学农业资源与生态环境研究所，江苏 南京210095摘要：重金属污染可能影响土壤中微生物生物量与活性及群落结构，但这种影响随土地利用和土壤类型、污染物类型而异。采集了江苏南部某市金属冶炼产业区周边重金属污染的稻田和未明显污染稻田的表土样品，分析了重金属复合污染下土壤微生物生物量以及PLFA群落结构的变化。结果表明，重金属污染下稻田土壤的微生物生物量碳、氮及微生物商比未明显污染的土壤显著降低 (约20%)；PLFA分析显示，重金属污染下土壤微生物群落结构发生了明显的变化，细菌和真菌PLFA的变化幅度达到30%以上，革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的脂肪酸比值升高，而真菌/细菌的比例降低了约70%。这种改变可能进一步影响到土壤中C、N等养分的生物地球化学循环，这有待深入的研究。关键词：水稻土；微生物群落结构；重金属；PLFA；土壤污染中图分类号：X172 文献标识码：A 文章编号：1672-2175（2008）05-1828-05稻田是我国重要的农作生态系统。近年来，随着采矿、冶金业的迅速发展，污水灌溉以及农药、化肥的大量使用，我国稻田土壤重金属污染已日趋严重1,2。土壤重金属污染可能影响土壤中微生物生物量、群落结构及微生物活性，同时使土壤酶的活性等生态功能受损3。土壤中大多数的微生物是不可培养的，分离鉴定到的微生物只占土壤微生物总数的1%10%4。随着分子生物学的发展，一些新方法被应用到土壤微生物分析中。磷脂脂肪酸(PLFA)是活生物体细胞膜的重要成分，不同种类的微生物可以通过不同的生化途径生成不同的磷脂脂肪酸。磷脂脂肪酸构成的变化能够反映样品中微生物群落结构的变化，因此通过PLFA分析方法可以较好地对微生物群落组成进行识别和定量描述5,6。关于土壤重金属污染对微生物生态影响的研究已有许多报道7-9，但是，许多研究都是通过添加外源重金属来模拟污染土壤，难以反映田间土壤的实际污染情况。对于田间水稻土重金属污染下微生物群落结构变化的研究报道还很少。据此，本文以重金属污染的水稻土为研究对象，探讨重金属污染对稻田土壤中的微生物量及微生物群落结构组成等微生物生态特性的影响，以期为研究重金属污染下土壤生物学质量和功能的指示提供科学依据。1 材料和方法1.1 供试土壤选择江苏南部某市一个上世纪70年代发展起来的金属冶炼和加工产业区重金属污染严重的稻田2，位于该冶炼厂区的下风向约500 m的稻田 (31º24.434'N，119º 41.605'E)。土壤类型为太湖地区典型的脱潜型水稻土乌泥土，当地年平均气温15.7 ，年平均降水量1177 mm。于2006年9月27日在水稻生长的稻田中采集土壤样品，同时采集该厂区上风向约1000 m的无污染的同类型稻田土作对照。1.2 采样和土样处理在稻田中随机选择2个点，每个样点分别采集05 cm和515 cm两个深度的土壤样品。土样用荷兰Eijkelkamp 公司生产的不锈钢铲采集，置于直径15 cm的圆形密封不锈钢样盒中，带回实验室。将一部分新鲜土样过2 mm网筛，装入无菌塑料袋，置于4 冰箱内保存，供土壤微生物生物量碳氮分析。一部分土样冷冻干燥置于-20 冰箱保存，供PLFA测定。另取部分土样于室内自然风干，用玛瑙研钵研磨，过100目筛，供土壤全碳和全氮分析及重金属含量测定。1.3 分析测定1.3.1 土壤基本理化性质土壤基本性质测定按鲁如坤（2000）推荐的方法进行10。供试样品的基本性质见表1。1.3.2 土壤重金属全量的测定土壤铅、镉、铜全量分析参照鲁如坤（2000）介绍的方法10，称取过100目土壤样品0.5000 g，采用HF-HClO4-HNO3消化，原子吸收分光光度计（TAS-986，北京普析公司，2001）测定,加入国家标准物质GSS-1和GSS-3以控制分析质量。1.3.3 土壤微生物生物量碳、氮测定表1 供试土壤基本理化性质Table 1 Some basic properties of studied soils污染状况土层深度/cmpH(H2O)b(CEC)/(cmol·kg-1)w(有机碳)/(g·kg-1)w(全氮)/(g·kg-1)w(Cu)/(mg·kg-1)w(Pb)/(mg·kg-1)w(Cd)/(mg·kg-1)无污染田块0-56.4819.3125.582.2536.5523.750.705-156.4919.4024.652.1733.4523.960.64污染田块0-56.2519.1225.242.0675.89207.345.465-156.3418.8324.072.0674.02175.964.89 土样微生物量碳测定采用Wu et al(1990)推荐的CHCl3熏蒸K2SO4浸提法11，浸出液中的碳用TOC仪（Jena Multi N/C 2100）测定。浸提液中的氮采用凯氏消煮法测定。1.3.4 微生物磷脂脂肪酸分析微生物PLFA提取和纯化的步骤12一般为：取一定量的冻干土壤，加氯仿甲醇磷酸缓冲液（体积比为120.8）单相提取液直接抽提样品的总脂肪酸。再加入一定体积的磷酸缓冲液和氯仿（应使溶液中氯仿甲醇磷酸缓冲液120.8），使单相提取液分离成两相，脂类被萃取到氯仿层中。分离出氯仿层, 氮气吹干。用硅胶柱（1g硅胶，用前100 活化1 h）从中性脂和糖脂中分离出磷脂。对磷脂进行甲酯化, 并用正己烷萃取, 氮气吹干，-20 下贮存或直接进行检测。以混合脂肪酸作外标，C20:0作内标，用气相色谱（GC）或气质联用(GC-MS)测定样品中的磷脂酸甲氧脂含量。表2 供试稻田土壤微生物量的变化Table 2 Soil microbial properties of the studied rice paddys mg·kg-1土层深度污染状况微生物碳微生物氮微生物w(C)/w(N)微生物商%05 cm无污染点763.42±28.16a50.43±4.38a15.19±0.96a2.99±0.13a污染点603.32±17.05b39.25±4.25b15.49±1.76a2.39±0.09b515 cm无污染点717.64±19.60a41.30±2.14a17.40±0.87a2.93±0.35a污染点589.05±15.92b31.37±2.09b18.86±1.81a2.45±0.04b特定脂肪酸以碳的数目：双键的数目和双键距离分子末端的位置(甲基端起)的方式命名。c、t分别表示顺式和反式脂肪酸，a和i分别表示反异支链脂肪酸及异式支链脂肪酸，cy表示具环状结构的脂肪酸，10Me表示第10个碳原子的甲基(从羟基端算起)。i15:0, a15:0, 15:0, i16:0, 16:19, 16:17t, i17:0, a17:0, 17:0, 18:17和cy19:0可作为细菌的特征脂肪酸13，18:26可作为真菌的特征脂肪酸14。革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌之比(G+/G-)则通过i15:0, a15:0, i16:0及i17:0脂肪酸物质的量之和与cy17:0, 16:19及cy19:0脂肪酸物质的量之和的比值来估算15。1.4 数据统计与显著性检验数据分析在Excel 2003上进行。污染与不污染间的差异分析及PLFA主成分分析用SPSS16.0分析软件进行，统计显著性概率定为p<0.05。2 结果与分析2.1 土壤微生物生物量碳氮的变化供试水稻土土壤的微生物量的分析结果见表2。重金属污染土壤的微生物生物量碳、氮相对于未污染土壤分别显著降低18%20%，22%24%。而05 cm与515 cm土层土壤微生物量无显著差异。微生物商（Cmic/Corg）是指示土壤生态系统受到干扰后变化的灵敏指标。与未污染土壤相比, 污染样点的微生物商下降16%20%。从表2可知，所测水稻土表层土中微生物的碳氮比显著高于亚表层，但重金属污染没有造成土壤微生物w(C)/w(N)的明显改变。关于重金属污染下土壤微生物量变化的研究报道已有很多。Kuperman等对多种重金属元素复合污染的土壤研究表明，重金属积累总量达到658.7 mg·kg-1时土壤微生物生物量碳仅为未污染的32%16，李永涛等对广东大宝山矿山废水灌溉下重金属污染稻田土壤的研究也显示，重金属污染降低了微生物量碳17-18。这可能是由于重金属污染影响了细胞的代谢及微生物的功能，从而引起微生物的生存力和竞争力发生变化而导致种群数量发生改变19。污染下微生物生物量C、N的降低是普遍公认的重金属污染对土壤的重要功能的影响之一。2.2 土壤微生物 PLFA群落结构变化本文应用PLFA方法分析了重金属污染与未污染土壤微生物的PLFA谱图以表征土壤微生物群落结构的变化，检测出从C14到C20共18种脂肪酸。供试稻田土壤微生物PLFA的摩尔分数分布见图1。计算的真菌和细菌PLFA总量的摩尔分数比较示于图2。可以看出，重金属污染下土壤微生物PLFA总量较未污染土壤明显降低，这与微生物生物量C、N的降低趋势相印证。但是，微生物PLFA分析还揭示了其群落结构在污染下的可能变化。重金属污染导致了iso一(异构)支链脂肪酸il6:0, il7:0、多键不饱和脂肪酸16:l9的摩尔分数的减少，而环丙烷cyl9:0脂肪酸有所增加。同时污染土壤中真菌的特征磷脂脂肪酸（18:26）相对百分含量较未污染土壤也有明显降低，而细菌的特征磷脂脂肪酸相对百分含量总和在污染土壤中有高于未污染土壤的趋势。说明重金属污染引起水稻土中微生物群落结构的改变。计算的真菌/细菌PLFA比值表明，未污染下为0.11±0.01（05 cm）和0.13±0.01(515 cm)，而在重金属污染下，05 cm和515 cm的比值分别显著降低到0.03±0.00和0.05±0.01，降低程度达70%。 图1 供试稻田土壤微生物PLFA分布Fig. 1 Distribution of microbial PLFAs in mol percentage from the studied paddy soil图1 供试稻田土壤微生物PLFA分布Fig. 1 Distribution of microbial PLFAs in mol percentage from the studied paddy soilPLFAs摩尔分数/%PLFAs摩尔分数/%图2 供试土壤中微生物PLFAs摩尔分数(阴影：污染田块；空白：未污染田块)Fig. 2 Mol percentage of microbial PLFAs of the studied paddy soil(Shaded: polluted; Blank: unpolluted)能够表征细菌的磷脂脂肪酸相对百分含量总和在污染土壤中大于未污染土壤中（图2），革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的PLFAs含量之比同样可指示重金属污染对土壤微生物生态系统的干扰9。分析结果表明，05 cm污染土壤的革兰氏阳性细菌(G+)与革兰氏阴性细菌(G-)的PLFAs含量比值较未污染土壤显著提高了60%，而在亚表层（515 cm）土壤提高了33% (图3)，因而重金属污染提高了表层和亚表层土壤中G+/G-的比值，只是05cm G+/G-比值要显著高于515 cm，这与微生物生物量的变化相同。这些说明稻田革兰氏阴性菌相对于比革兰氏阳性菌对于重金属污染更敏感。图3 污染与未污染土壤的G+/G- PLFA比值的比较Fig. 3 Ratio of G+ to G- PLFAs of the studied soils3 讨论和结论关于重金属对土壤微生物群落结构的影响已有较多报道。Frostegard等用PLFA法研究表明重金属污染导致了土壤中il5:0, il7:0, 16:l5, 16:l7等磷脂脂肪酸的减少，而i16:0, brl7:0, brl8:0和cyl7:0等磷脂脂肪酸有所增加20。Pennanen T等21研究也表明，重金属污染下森林土壤腐殖质层中代表革兰氏阳性细菌的i15:0, i16:0, 16:l, i17:0等脂肪酸相对增加；同样，Beat Frey等22研究表明，重金属污染下森林土壤革兰氏阴性菌PLFA量减少。但Belén Hinojosa等23研究表明，在污染土壤中iso- 和anteiso-等表征革兰氏阳性细菌的脂肪酸在污染下受到抑制而革兰氏阴性菌增加。Kelly等24用相同方法发现Zn污染土壤中指示菌根真菌的PLFA相对含量下降。Kuperman等对一个多种重金属复合污染的草原土壤（重金属积累总量达658.7 mg·kg-1）的研究表明，细菌和真菌生物量较未污染的对照(重金属积累达121.0 mg·kg-1)分别下降了29%和45% 16。重金属污染对土壤微生物区系和群落结构的影响可能因不同的研究对象而不同。在供试的稻田系统，重金属污染下的土壤微生物系统PLFA群落结构的变化与上述对自然土壤的结果有些不同。一般认为，微生物对土壤污染表现出灵敏的响应，而细菌比真菌对重金属污染更敏感25。这里的结果是，污染下微生物商降低了20%左右，而真菌、细菌PLFA的量的变化程度更大（达30%60%）。尽管前人也报道了污染下真菌PLFA的显著降低，但这里观察到真菌/细菌PLFA比值在污染下降低了70%以上。因此，我们认为，重金属污染虽然同样降低了稻田的微生物生物量和微生物商，但是PLFA分析显示出这种影响更大地表现为相对组成的变化，真菌/细菌比值和革兰氏阳性菌/革兰氏阴性菌比值的大幅度改变无疑会影响到C、N等营养元素的循环过程并由此会深刻影响到土壤质量和生态功能的变化，当然这些还需要进一步的野外和实验室的研究。参考文献：1 安中华, 董元华, 安琼, 等. 苏南某市农田土壤环境质量评价及其分级. 土壤, 2004, 36(6): 631-635. 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The results showed that soil microbial biomass carbon, nitrogen and the microbial biomass quotient (Cmic/Corg) was decreased very significantly (by about 20%). However, a remarkable reduction (30%) in the total extractable PLFAs and an intense decline of the ratio of fungi to bacteria of PLFAs was observed in the polluted soil compared to the non-polluted counterpart. This is in disagreement with the general understanding of either an increase or insignificant change under heavy metal pollution. Such microbial community change would, in turn, modify the C and N cycling in paddy soils under heavy metal pollution, which deserves further study. Key words: paddy soil; microbial community structure; heavy metals; PLFA; soil pollution