抗体技术医学宣教课件.ppt
抗体分子,抗体分子,Antibody IgG structure,Antibody IgG structure,Antibody IgG structure,Antibody IgG structure,C,L,V,L,V,H,C,H,1,V,L,C,L,V,H,C,H,1,C,H,2,C,H,2,C,H,3,C,H,3,Antibody IgG structure,CLVLVHCH1VLCLVHCH1CH2CH2CH3CH3,Hinge,(Fab)2,Fab,Fc,MembraneExtension,Antibody IgG structure,抗原结合片段,恒定区片段,VHVLCLCH1CH2CH3Hinge(Fab)2Fab,Antibody IgG structure,抗体可变区片段,VHVLCLCH1CH2CH3Antibody IgG st,C,L,C,H1,Fv,VHVLCLCH1CH2CH3Fv,Fv,scFv,Single Chain Fragment variable,FvVHVLscFvVHVLSingle Chain Fra,抗体生物体最奇妙的分子,无限的多样性（diversity)功能与结构的双重性 可变区抗原结合 恒定区生物学效应功能分泌型和膜型表达,抗体生物体最奇妙的分子无限的多样性（diversity,与抗体有关的诺贝尔奖获得者,与抗体有关的诺贝尔奖获得者1901von Bering血清治,本节课主要内容,一、细胞工程抗体和基因工程抗体二、治疗性单抗研制进展,本节课主要内容一、细胞工程抗体和基因工程抗体,一、细胞工程抗体和基因工程抗体,抗体研究领域的进展大致可分为三阶段：以1890年Behring发现白喉毒素免疫血清（白喉抗毒素）为代表，其特点是用抗原免疫动物来获得多克隆抗体;以1975年Kohler创建杂交瘤技术制备单克隆抗体为代表;以1994年Winter用基因工程方法制备抗体为代表;,一、细胞工程抗体和基因工程抗体抗体研究领域的进展大致可分为三,（一）多克隆抗体(Polyclonal antibody),1. 概念 给动物接种抗原所获得的免疫血清或抗血清是多种抗体的混合物, 它是由多种抗原决定簇刺激多株B细胞增殖分化所产生的, 称为多克隆抗体.,（一）多克隆抗体(Polyclonal antibody),2. 多克隆抗体的应用 免疫学检测 被动免疫治疗和紧急预防3.存在问题 特异性差, 用于免疫学检测容易出现交叉反应,（二）单克隆抗体(Monoclonal antibody,McAb),通过B细胞杂交瘤技术, 获得特异性针对某一种抗原决定簇的细胞克隆，产生均一性的抗体.,（二）单克隆抗体(Monoclonal antibody,单克隆抗体的特性 高度均一性： 纯度很高的均一性抗体 高度专一性： 只对抗原分子上某一抗原决定 簇起反应 大量产生及稳定性： 杂交瘤细胞能在体内外无限繁殖 之传代,单克隆抗体的特性,、细胞工程抗体杂交瘤-单克隆抗体,、细胞工程抗体杂交瘤-单克隆抗体,抗体技术医学宣教课件,抗体技术医学宣教课件,抗体技术医学宣教课件,杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括,（1）抗原制备；（2）免疫动物；（3）免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备； （4）细胞融合； （5）杂交瘤细胞的选择培养； （6）杂交瘤细胞的筛选； （7）杂交瘤细胞的克隆化；（8）单克隆抗体的检定； （9）分泌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立； （10）单克隆抗体的大量制备。,杂交瘤技术制备单克隆抗体的主要步骤包括（1）抗原制备；（,免疫动物,免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。 一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞,免疫动物免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细,细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养,细胞融合的基本方法：取适量脾细胞与骨髓瘤细胞混合，在PEG作用下融合，然后用培养液将PEG融合液缓慢稀释,将混合体系移入选择性培养基HAT中培养。,细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养细胞融合的基本方法：取适量脾,HAT选择性培养的原理,融合后产生脾脾、脾瘤、瘤瘤融合细胞和未融合的骨髓瘤细胞。次黄嘌呤（ H ）、氨基碟呤（ A ）和胸腺嘧啶（ T ）氨基碟呤（ A ）阻断嘌呤和嘧啶的合成,HAT选择性培养的原理融合后产生脾脾、脾瘤、瘤瘤融合细胞和未,HAT选择性培养的原理,骨髓瘤细胞选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）缺陷型,不能利用外源性次黄嘌呤来合成自身核酸中所需要的嘌呤，而内源性嘌呤和嘧啶的合成又被氨基碟呤所阻断，不能在HAT培养基上生长。B淋巴细胞无法在体外繁殖传代。脾细胞内有这种转移酶，故脾瘤杂交细胞能用H和T合成DNA而得以生长。,HAT选择性培养的原理骨髓瘤细胞选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转,在最适培养条件下，大约105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞，单个或少数的杂交瘤细胞多半不易存活，通常加入饲养细胞（小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞）饲养细胞释放某些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。小鼠腹腔巨噬细胞还能清除死亡细胞，应用较多。,在最适培养条件下，大约105个脾细胞才能形成一个杂交瘤细胞，,筛选阳性克隆与克隆化,抗体产生细胞只占所有脾细胞的5%左右，所以融合后8-9天对每孔的培养上清液进行抗体活性的筛选工作，筛选出产生抗体的阳性克隆。常用方法：酶联免疫吸附法，免疫荧光技术（适用于细胞抗原的抗体检测）和放射免疫技术。尽早克隆化。,筛选阳性克隆与克隆化抗体产生细胞只占所有脾细胞的5%左右，所,杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定,对杂交瘤细胞进行染色体分析对杂交瘤细胞产生的单克隆抗体进行Ig类和亚类的鉴定对单克隆抗体特异性、纯度和识别抗原的相对分子质量进行测定。,杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定对杂交瘤细胞进行染色体分析,单克隆抗体的大量制备,体外培养法在培养液中添加10%-20%小牛血清，由于培养液中含有血清成分，总蛋白量可达100mg/ml,纯化困难。小牛血清又是支原体污染的原因。无血清培养法：利用白蛋白、转铁蛋白、乙醇胺等混合物代替小牛血清。但产量不高。用悬浮培养方式代替静止培养法，微载体悬浮培养,单克隆抗体的大量制备体外培养法,多采用动物体内诱生法杂交瘤细胞的两种亲本细胞都来自BALB/c小鼠，故选用BALB/c小鼠制备单克隆抗体。先给小鼠注射刺激性的有机溶剂降植烷（破坏腹腔内膜，建立杂交瘤细胞易于增殖的环境），然后注射杂交瘤细胞，待生成腹水后再抽取，离心去细胞沉淀，取上清液冻存。操作简便，经济，所得单克隆抗体量多且效价高，可有效保存杂交瘤细胞株。缺点是小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。,多采用动物体内诱生法,单克隆抗体的纯化,在纯化之前必须明确其Ig类和亚类，Ig类和亚类不同，纯化方法也不同；根据用途不同选择不同的纯化方法；如用于体外诊断试剂的IgG类抗体应采用沉淀处理结合亲和层析亲和层析的方法。IgM类抗体应采用沉淀处理结合凝胶过滤的方法；体内诊断试剂或治疗用药物应去除内毒素、病毒、核酸等微量污染物，必须采用亲和层析和阴离子交换层析。,单克隆抗体的纯化在纯化之前必须明确其Ig类和亚类，Ig类和亚,动物体内诱生法制备的单克隆抗体的纯化方法：1 澄清和沉淀处理2 分离 凝胶过滤 阴离子交换层析 亲和层析,动物体内诱生法制备的单克隆抗体的纯化方法：,、单克隆抗体在医学上的应用,A、用作诊断试剂 1. 检测淋巴细胞表面分子，区分不同分化 阶段的淋巴细胞，鉴别淋巴细胞。 2. 鉴定病原体，准确诊断传染病。 3. 用于肿瘤的诊断和分型 4. 激素类单抗用于测定体内激素含量，判 断内分泌的功能状态,、单克隆抗体在医学上的应用A、用作诊断试剂,B、用作研究工具纯化抗原分析和探查抗原结构分析抗原决定簇分子的功能C、用于疾病的治疗抗细胞表面分子单抗，用于移植排斥反应的防治抗细胞因子单抗用于自身免疫性疾病的治疗抗肿瘤单抗用于肿瘤的导向治疗,B、用作研究工具,单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题单克隆抗体的特异性 由于肿瘤特异性抗原较少，缺乏对肿瘤有严格特异性的单抗，对正常组织有交叉反应2）异种抗体反应 鼠源性单抗用于人体，导致异源性超敏反应,单克隆抗体用于免疫治疗存在的问题,（三）基因工程抗体(Genetic engineering antibody),根据研究者的意图，采用基因工程方法，在基因水平，对免疫球蛋白基因进行切割、拼接或修饰后导入受体细胞进行表达，产生新型抗体。主要包括 嵌合抗体、小分子抗体、人源化抗体、双价抗体和双特异性抗体。,（三）基因工程抗体(Genetic engineering,小分子抗体,鼠单抗人源化,基因工程改造的抗体,小分子抗体鼠单抗人源化基因工程改造的抗体,小分子抗体,小分子抗体,小分子抗体,基因工程小分子抗体仅表达鼠源性McAb的V区（ CDR ）片段，其相对分子质量仅为原抗体的1/80-1/3。Fab片段抗体，由完整的轻链和重链(VH+CH1）组成 Fv抗体（VH+VL ，非共价结合）单链抗体:由VH和VL通过一段连接肽（Linker）连接而成的重组蛋白单域抗体：由VH或VL单个可变区,小分子抗体基因工程小分子抗体仅表达鼠源性McAb的V区（ C,抗体融合蛋白,抗原结合部位与生物活性蛋白结合免疫导向免疫桥连嵌合受体,抗体融合蛋白抗原结合部位与生物活性蛋白结合,抗体融合蛋白,酶-抗体型偶合蛋白（抗体酶）在药物治疗中应用前景广阔，它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物。当抗体和酶的融合蛋白定位在肿瘤部位后再给予前体药物，药物经酶催化显示活性，提高肿瘤区域的药物浓度，降低对正常细胞的毒性。构建抗体融合蛋白的基本原则：将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因共表达。,抗体融合蛋白酶-抗体型偶合蛋白（抗体酶）在药物治疗中应用前景,在构建过程中关键的问题是两个蛋白间的Linker 序列，一般3-5个氨基酸可满足大部分融合蛋白的正确折叠要求。如加入一段有疏水性和一定伸展性的肽链，可缓解两种蛋白的相互干扰。在真核细胞中表达一般不涉及复性问题，其优点是能够将抗体多肽正确折叠和糖基化，省去了繁杂的体外复性，缺点是产量低。在原核细胞中表达有两种形式：一种分泌至菌体外，成为有活性的可溶性融合蛋白；另一种以胞内包涵体形式存在，需溶解包涵体重新折叠，成为有活性的蛋白质。,在构建过程中关键的问题是两个蛋白间的Linker 序列，一般,嵌合抗体,从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基因连接，插入适当表达载体，转染宿主细胞，表达人-鼠嵌合抗体。 特点：减少了鼠源性抗体的免疫原性，同时保留了亲本抗体特异性结合抗原的能力。保留鼠源性McAb的CDR区的结构，抗体活性不会消失（ CDR区以外的其它部分不影响抗体活性），将C区用人的Ig分子的C区置换，则对人的免疫原性消失。,嵌合抗体从杂交瘤细胞分离出功能性可变区基因，与人Ig恒定区基,嵌合抗体,嵌合抗体是构建的第一个基因工程抗体，构建时可对抗体亚类进行变换，增强抗体的免疫治疗效果。其半衰期约为鼠源的6倍，介导细胞毒性所需的抗体浓度也低于原McAb。20世纪末期构建了为数众多的抗各种恶性肿瘤的嵌合抗体，但真正应用于临床的较少，主要是因为该技术已被日益成熟的人源化抗体技术所取代。,嵌合抗体嵌合抗体是构建的第一个基因工程抗体，构建时可对抗体亚,人源化抗体（humanized antibody),运用基因工程的方法将鼠McAb除重链、轻链的互补决定区（CDR）以外的基因全部置换成人抗体的基因。又称CDR移植抗体最大限度地降低了鼠McAb的免疫原性,在人体内的生物半衰期基本上与人抗体类似。至今已有近百种人源化抗体申请临床试验，正在进行临床试验的有30多种，有些已完成期临床试验并获政府批准上市销售。,人源化抗体（humanized antibody)运用基因工,鼠单抗人源化,恒定区人源化人-鼠嵌合抗体可变区人源化人改型抗体用抗体库技术进行人源化,鼠单抗人源化恒定区人源化人-鼠嵌合抗体,鼠单抗人源化,鼠单抗人源化,双价抗体与双特异性抗体(bispecific antibody),许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。 将识别肿瘤抗原的抗体和 识别细胞毒性免疫效应细胞表面分子的抗体连结在一起，可使效应细胞更容易与肿瘤细胞结合识别，取得杀伤肿瘤细胞的作用。,双价抗体与双特异性抗体(bispecific antibod,构建方法,化学交联法 用化学试剂随机交联两个Ig分子表面上的巯基，构建双功能抗体。化学交联可能破坏抗体的功能，不易到达靶向部位，体内稳定性差，每次应用都须重新构建,构建方法化学交联法 用化学试剂随机交联两个Ig分子表面上的,生物学方法 将分泌目的单克隆抗体的杂交瘤细胞与分泌另一种抗体的脾细胞融合，形成可分泌亲代抗体和杂种抗体的杂种-杂交瘤细胞。构建过程复杂，周期长，产量低，纯化技术复杂，基因组过大不稳定。,生物学方法 将分泌目的单克隆抗体的杂交瘤细胞与分泌另一种,基因工程方法 1993年Holligen等构建出小分子双功能抗体（SCFV）2，是双功能抗体研究领域的里程碑。 用接头连接不同抗体的VH和VL区 ，使它们不能形成链内的分子配对，让其形成原抗体的分子内配对构建成双特异性（SCFV）2。 双功能抗体一臂识别肿瘤细胞抗原（癌基因产物），另一臂识别免疫效应细胞及分子，介导T淋巴细胞或毒素与药物发挥细胞毒作用,基因工程方法 1993年Holligen等构建出小分子双,单链抗体,单链抗体较好地保持了抗体亲和力，相对分子质量小、穿透力强、免疫原性小，且易与效应效应分子相连接，构建出多种新功能的抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体的理想元件。因此成为基因工程抗体研究领域的热点。单链抗体基因构建的一般方法：采用从杂交瘤细胞提取mRNA,反转录成cDNA，通过PCR扩增抗体VH和VL基因，人工合成一条寡核苷酸序列（ Linker 序列），将VL与VH连接构建单链抗体基因,单链抗体单链抗体较好地保持了抗体亲和力，相对分子质量小、穿透,修饰抗体（modified antibody),将放射性核素、生物毒素（白喉毒素、绿脓杆菌外毒素、蓖麻毒蛋白、蛇毒蛋白、相思子蛋白）或毒性极强的合成药物及抗生素等共价结合到抗体分子上.通过McAb可特异地将毒素导向肿瘤细胞等的靶部位，以达到毒杀肿瘤细胞而少损伤正常细胞的功效，形象地称之为生物导弹（药物导弹、免疫毒素）。,修饰抗体（modified antibody)将放射性核素、,治疗性单抗的研究进展,治疗性单抗的研究进展,1. 杂交瘤-单克隆抗体技术诞生2. 抗独特型治疗淋巴瘤成功3. OKT3被批准上市4. 单抗用于肿瘤治疗效果不佳5. 抗内毒素单抗试用于败血性休克失败6. 抗17-1A和ReoPro上市7. FDA批准6个单抗上市,治疗性抗体发展历程和事件,1. 杂交瘤-单克隆抗体技术诞生治疗性抗体发展历程和事件,OKT3,OKT3是美国Ortho公司生产的OKT(Ortho Kung T cell OKT)系列中的一种抗人T淋巴细胞分化抗原CD3的单克隆抗体，CD3抗原是成熟T细胞的共同分化抗原，在全部外周血T细胞和胸腺、淋巴结内接近成熟的T细胞上表达。OKT3作为一种免疫抑制剂，主要用于预防和治疗同种异体肾移植等器官移植后的急性排斥反应。OKT3主要通过细胞清除、不育性激活、功能性受体封阻、免疫调变、刺激抑制细胞增殖以及直接作用于效应细胞等途径杀伤成熟T细胞或阻断机体细胞免疫反应达到抗排斥目的。,OKT3OKT3是美国Ortho公司生产的OKT(Ortho,抗17-1A：主要作用于结肠癌、直肠癌病人原发的和转移的肿瘤；Reopro是一类抗体类药物，1994年首度获得批准，用于冠状动脉手术及心脏搭桥患者的治疗，以防止其血液拴塞。,抗17-1A：主要作用于结肠癌、直肠癌病人原发的和转移的肿瘤,抗体名称 抗体种类 靶向抗原 适应症 批准日期OKT3 鼠单抗 CD3 移植排斥 1986Panorex 鼠单抗 17-1A 大肠癌 1995（德国）ReoPro 人-鼠嵌合Fab 血小板受体 冠心病 1994 ba Rituxan 人-鼠嵌合抗体 CD20 淋巴瘤 1997Simulect 人-鼠嵌合抗体 CD25 移植排斥 1998Remicade 人-鼠嵌合抗体 TNF- 炎症性肠病、 1998、 类风湿关节炎 1999Zanapax 人源化抗体 CD25 移植排斥 1997Herceptin 人源化抗体 HER-2 乳腺癌 1998Synagis 人源化抗体 RSV F蛋白 RSV感染 1998Mylotarg 人源化抗体 - CD33 淋巴瘤 2000 化疗药物交连物Campath 人源化抗体 CD52 淋巴瘤 2001,已批准上市的治疗性单抗,抗体名称 抗体种类 靶向抗原 适应症,治疗性单抗销售概况,治疗性单抗销售概况,国外有关抗体开发的评述, 正在临床试用的治疗性单抗超过上百种, 1998-2000年20%研制的生物药品为单抗, 10年后市场上的单抗将从现在的 11个 100个以上，预计销售额为$500亿, 预计到2008年7个主要市场用于肿瘤的治疗性单抗的销售额达44亿美元,国外有关抗体开发的评述 正在临床试用的治疗性单抗超过上百种,进入临床治疗性单抗情况分析,治疗肿瘤： 32%治疗免疫系统相关疾病： 37%器官移植： 11%感染： 8%心血管： 4%其它： 6%,所治疗的疾病,进入临床治疗性单抗情况分析治疗肿瘤：,所针对的抗原,/抗原数 /应用数细胞膜分子： CD系列： 35% 42% 膜受体及粘附分子：17% 15% 肿瘤相关抗原： 10% 5%细胞因子类： 21% 26%独特型： 6% 5%病毒： 10% 7%,所针对的抗原/抗原数 /应用数,人源化和人源抗体制备技术的成熟是治疗性单抗进展的关键,在目前进入临床的单抗中： 60%为人源化鼠单抗 20%为人源单抗 20%为鼠单抗（其中70%用于肿瘤）,人源化和人源抗体制备技术的成熟是治疗性单抗进展的关键在目前,人源抗体研制的基本路线, 人血清来源 人杂交瘤单克隆抗体 鼠单抗人源化 噬菌体抗体库 转基因小鼠,人源抗体研制的基本路线 人血清来源,转基因小鼠制备人源抗体,灭活小鼠胚系Ig基因 基因敲除JH、JK和CK基因段,将人胚系Ig基因转移到小鼠染色体人工染色体技术微胞介导的染色体转移微基因位点胚胎细胞注射,转基因小鼠制备人源抗体灭活小鼠胚系Ig基因将人胚系Ig基因转,抗体技术医学宣教课件,微胞介导的染色体转移,微胞介导的染色体转移,治疗性抗体的发展趋势,人源抗体制备技术已经成熟，今后将进入以人源抗体为主的时代,基因工程抗体逐渐从研究走向临床,靶向抗原的研究和选择已逐渐成为研制治疗性单抗的关键,治疗性抗体的发展趋势人源抗体制备技术已经成熟，今后将进入以,泰欣生,泰欣生（h-R3，Nimotuzumab）重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体，是全球第三个治疗实体瘤的单抗药物，是我国批准的第一个人源化抗体药物，属国家类新药。在国家重大科技专项“创新药物和中药现代化”的支持下，我国与古巴合资企业百泰生物药业有限公司开发的一类癌症治疗新药“重组人源化抗人表皮生长因子受体单克隆抗体”（商品名：泰欣生）,于4月11日获得国家食品药品监督管理局颁发的新药证书。,泰欣生泰欣生（h-R3，Nimotuzumab）重组人源化,
