兔子免疫血清和无免疫血清课件.ppt
兔子免疫血清和无免疫血清成分分析比较,作者：钟园园、郑晓阳,兔子免疫血清和无免疫血清,1,兔子免疫血清和无免疫血清成分分析比较作者：钟园园、郑晓阳兔,目录,前言材料、仪器设备与方法 结果分析 讨论与总结,兔子免疫血清和无免疫血清,2,目录前言兔子免疫血清和无免疫血清2,前言,血清是血浆中不含纤维蛋白原的胶状液体,具有维持血液的正常粘度、酸碱度、渗透压等作用。它主要由水和各种化学成分组成,这些化学成分包括白蛋白、1 、2 、- 球蛋白,甘油三酯,总胆固醇,谷丙转氨酶等。动物在生命活动过程中常常会受到病原微生物的侵袭而发病甚至死亡。为了防止动物发生传染性疾病,所以常常对其进行免疫接种。动物获得免疫能力对自身生理有什么影响，这是一个值得研究的方向。本实验主要是粗略地测量血清中的成分在免疫后与无免疫中的含量变化，从宏观上把握免疫对血清成分含量的影响。,兔子免疫血清和无免疫血清,3,前言 血清是血浆中不含纤维蛋白原的胶状液,前言,血清总胆固醇测定是血脂分析的常规项目,目前国内大多数实验室的常用方法有酶法、硫酸一磷酸一高铁显色法、硫酸一醋醉直接显色法、硫酸一醋酥煮沸显色法及邻苯二甲醛一硫酸显色法和邻苯二甲醛法等。本实验我们采用的是邻苯二甲醛法。其在临床上的意义：血清中总胆固醇的浓度可作为脂类代谢的指标，但脂类代谢又常与糖类及激素的代谢密切相关，故在其他物质代谢异常时亦可影响血清总胆固醇的浓度。,兔子免疫血清和无免疫血清,4,前言 血清总胆固醇测定是血脂分析的常规项,前言,血清谷丙转氨酶活力的测定为一种较好的早期诊断肝炎的方法之一。其在临床上有重要意义：正常时，谷丙转氨酶主要存在于组织细胞内，以肝细胞含量最多，心肌细胞中含量其次，只有极少量释放入血中。所以血清中此酶活力很低。当肝脏、心肌病变、细胞坏死或通透性增加时，细胞内各种酶释放出来，使血清中此酶活性升高。所以测定血清中此酶的含量可作为诊断、鉴别诊断及预后观察的依据。本实验采用纸层析法和比色法探究动物免疫对血清成分含量的影响。,兔子免疫血清和无免疫血清,5,前言 血清谷丙转氨酶活力的测定为一种较好,前言,分离、纯化与鉴定球蛋白的方法很多，本实验用醋酸纤维素膜电泳法对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定，是较为经济、快速且可重复的方法。本次血清清蛋白与-球蛋白的分离与鉴定覆盖了传统生化技术，包括离心技术、层析技术、分光光度法和电泳技术。,兔子免疫血清和无免疫血清,6,前言 分离、纯化与鉴定球蛋白的方法很多,1. 1材料来源及处理,4号血清：由生命与环境科学学院生化试验室提供。从四只兔子分别提取血清用于生化实验，其中有一只兔子是有免疫的，其它的是未免疫的，血清提取出后置于冰箱冷藏。 （血清主要由水和各种化学成分组成,这些化学成分就包括白蛋白、1 、2 、- 球蛋白,甘油三酯,总胆固醇,谷丙转氨酶。大量实验证明将血清密封放入-10 冰箱中长时间保存,由于水分和这些化学成分没有变化,因此新鲜血清和-10 保存一年的血清醋酸纤维素薄膜电泳后的血清白蛋白、1 、2 、- 球蛋白的百分值无显著差异,两种血清的甘油三酯,总胆固醇,谷丙转氨酶也无明显差异。完全能满足实验的要求。这不仅不浪费血清,而且方便又节省实验经费）。猪肝：由生命与环境科学学院生化试验室提供。几天前从菜市场买来置于冰箱里保鲜处理，到要用时取出（同上，冷藏对谷丙转氨酶影响不大）。,兔子免疫血清和无免疫血清,7,1. 1材料来源及处理兔子免疫血清和无免疫血清7,1.2 仪器与设备,1.2.1 凝胶柱及架1.2.2 30、37水浴箱1.2.3 定时器1.2.4 微量进样器1.2.5 分光光度计1.2.6 透析袋1.2.7 电炉1.2.8 电子天平1.2.9 水浴锅1.2.10 离心机 1.2.11准确的加样器,兔子免疫血清和无免疫血清,8,1.2 仪器与设备兔子免疫血清和无免疫血清8,1.4 方法,1.4.1 血清胆固醇的定量测定：邻苯二甲醛法1.4.2 血清清蛋白与-球蛋白的分离与鉴定：盐析法分离提纯蛋白质、透析法脱盐与蛋白质浓缩、凝胶过滤层析、醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白1.4.3 谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定：纸层析法、分光光度法测定血清丙转氨酶的活力,兔子免疫血清和无免疫血清,9,1.4 方法兔子免疫血清和无免疫血清9,结果分析,2.1.1血清总胆固醇的含量 图1血清总胆固醇标准曲线,兔子免疫血清和无免疫血清,10,结果分析 2.1.1血清总胆,图2 兔子血清总胆固醇含量,由图2可知免疫兔子血清中胆固醇含量比未免疫的兔子低很多,兔子免疫血清和无免疫血清,11,图2 兔子血清总胆固醇含量 样品吸光度胆固醇,凝胶层析洗脱结果,图3 凝胶层析洗脱曲线图 由图3可知蓝色的蓝葡聚糖比黄色的重铬酸钾先流过凝胶柱，且蓝葡聚糖在第10管，即约流出197ml时,达到溶质数最大,即浓度最大；重铬酸钾在第24管，即约流出473ml时达到溶质数最大,兔子免疫血清和无免疫血清,12,凝胶层析洗脱结果 图3,全血清、清蛋白和-球蛋白 电泳结果,纯化的-球蛋白样品为一条带（-球蛋白位置），正常兔子血清样品为五条带（清蛋白、1、2、及-球蛋白）上清液的迁移距离=2.50cm -球蛋白的迁移距离=1.57cm全血清中：-球蛋白的迁移距离=1.52cm -球蛋白的迁移距离=2.10cm-球蛋白的迁移距离=2.50cm 上清液的迁移距离 =2.78cm,图4 全血清、清蛋白和-球蛋白电泳谱图,兔子免疫血清和无免疫血清,13,全血清、清蛋白和-球蛋白 电泳结果图4 全血清、清蛋白,兔子血清中谷丙转氨酶的活力单位测定,图5 A520nm下酶活力单位的标准曲线,由右表可知免疫兔子血清中酶活力单位比未免疫的大,兔子免疫血清和无免疫血清,14,兔子血清中谷丙转氨酶的活力单位测定 图5 A5,图6 纸层析结果图,兔子免疫血清和无免疫血清,15,图6 纸层析结果图 兔子免疫血清和无免疫血清15,22讨论与总结,血清成分的变化能够对血液质量产生重要影响。因而对血清成分的分析具有非常重要的意义。本实验通过邻苯二甲醛法定量测定血清胆固醇的含量,血清清蛋白与-球蛋白的分离与鉴定,血清谷丙转氨酶活性的鉴定及活力测定,对兔子血清的成分进行分析。,兔子免疫血清和无免疫血清,16,22讨论与总结 血清成分的变化能够对血,血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法）,本实验采用邻苯二甲醛法，操作简便，即无须将样品中的胆固醇提取出来或除去样品中的蛋白质，灵敏、稳定。在实验中，应注意几个事项，如硫酸含量的高低对显色有影响，故混合酸的配制和测定过程中的加量应非常准确；加好溶液混合完毕要静置10minutes左右,使更好的混合等等。胆固醇是细胞膜的重要成分，人体内90的胆同醇存在于细胞中，如果没有胆固醇，细胞就会死亡；胆固醇还是人体内许多重要生物活性物质的合成材料，如胆汁、性激素(如睾酮、雌二醇)、肾上腺素(如皮质醇)和维生素D3等。本实验得出免疫兔子血清中胆固醇含量比未免疫的兔子低很多，原因可能是免疫影响了胆汁、性激素、肾上激素等的含量，进而影响血清中胆固醇的含量，这需进一步研究。,兔子免疫血清和无免疫血清,17,血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法）,血清谷丙转氨酶活性的鉴定及活力测定,通过本实验测定，免疫兔子血清中酶活力单位比未免疫的大。可能的原因是免疫的兔子本身发生病变或者是免疫使兔子的细胞膜通透性增高，从而引起血清中谷丙转氨酶活性提高，具体原因需进一步研究。 本实验误差来来源可能为：将测定管和对照管置于水浴中与二硝基苯肼作用20分钟过程中反应未完全。氢氧化钠的加入量不够准确,这道接影响对照管的光密度, 使酶的活力出现偏高。与显色剂反应的温度未能控制好。这时, 对照管光密度偏低,而测定管从“ 水浴中取出后, 管内温度仍高于室温, 反应可能接近完全, 因此测得的酶活力偏高。,兔子免疫血清和无免疫血清,18,血清谷丙转氨酶活性的鉴定及活力测定 通过本实验测定，免疫,血清清蛋白与-球蛋白的分离与鉴定,分离蛋白质需要经过很多步骤，这要求实验中要做好每一步，如盐析、透析等等。在洗脱步骤中用蓝葡聚糖和重铬酸钾代替蛋白质通过凝胶柱,由结果知蓝色的蓝葡聚糖比黄色的重铬酸钾先流过凝胶柱，说明蓝葡聚糖的分子量比重铬酸钾大。 在纤维素薄膜电泳中, 纯化的-球蛋白样品为一条带,正常兔子全血清样品为五条带（清蛋白、1、2、及-球蛋白）。由于实验误差较大，因此全血清中的-球蛋白和清蛋白的迁移距离和纯化的-球蛋白和清蛋白相差很大。但是通过鉴定也使我们了解血清中蛋白质的种类。,兔子免疫血清和无免疫血清,19,血清清蛋白与-球蛋白的分离与鉴定 分离蛋,参考文献,1中级医刊2：107，19622 林书. 影响血清转氨酶活力测定因素的探讨. 福州市传染病院,1978, (9):407-4103 黄天锡. 那些疾病和原因出现转氨酶增高. 右江民族医学院附院,1998:35-374 叶晓健，田纪伟，高岱峰，李家顺，贾连顺，赵书平. 脊髓半切伤大鼠血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性变化的研究.中国临床康复,2004,8(17) :3282-3283 5 董宁池,潘雪峨,金润昭,郭旭芹,张兴. 五种血清总胆固醇测定方法的比较. 陕西医学检验,1994,9(4)：24-256 童和、胡纹、刘音、朱元因. 人和动物血清谷丙转氨酶活力的测定. 铁道部劳动卫生研究所工业毒物研究室, 2003：28-247 河南扶沟县人民医院肝炎防治研究小组. 血清谷丙转氛酶升高在病毒性肝炎保护诊断应用上的凡个问题.新医学,1978，9(12):586-587,兔子免疫血清和无免疫血清,20,参考文献1中级医刊2：107，1962兔子免疫血清和,我们的论文报告到此结束,请老师给予指导和改正,兔子免疫血清和无免疫血清,21,我们的论文报告到此结束请老师给予指导和改正兔子免疫血清和无免,
