免疫酶组织化学技术培训课件.ppt

免疫酶组织化学技术,免疫酶组织化学技术,第一节 基 本 原 理,抗原抗体（特异性）酶标记抗体，通过酶与底物作用生成有色反应物，定位组织或细胞内抗原的一门技术。,免疫酶组织化学技术,2,第一节 基 本 原 理 抗原抗体（,免疫酶组化,免疫学(抗原抗体反应),酶细胞化学(底物显色反应),+,特异性 敏感性 定位性 可视性,免疫酶组织化学技术,3,免疫酶组化 免疫学酶细胞化学+特异性 敏感性,PAP法,免疫酶组织化学技术,4,PAP法免疫酶组织化学技术4,免疫酶组织化学基本组成：抗原 抗体 放大系统 显色系统,免疫酶组织化学技术,5,免疫酶组织化学基本组成：免疫酶组织化学技术5,ABC法,免疫酶组织化学技术,6,ABC法免疫酶组织化学技术6,免疫酶特点： 信号定位准确 标本可长期保存 阳性标记与病变关系 方法简便，易推广,免疫酶组织化学技术,7,免疫酶特点：免疫酶组织化学技术7,一、酶及其特点 酶选择标准： 该酶用细胞化学易于被检出，能被光镜或电镜观察。 酶反应产物须稳定，不扩散，具有良好定位。,第二节 酶 和 底 物,免疫酶组织化学技术,8,一、酶及其特点第二节 酶 和 底 物免疫酶组织化学技术8, 酶易于纯化，获得纯制品。 酶与免疫球蛋白结合后，不丧失其活性。 酶在PH中性液内较稳定。 组织中不应存在与底物作用的内源性酶。,免疫酶组织化学技术,9, 酶易于纯化，获得纯制品。免疫酶组织化学技术9,符合上述条件： 辣根过氧化物酶 碱性磷酸酶 葡萄糖氧化酶,免疫酶组织化学技术,10,符合上述条件：免疫酶组织化学技术10,（一）辣根过氧化物酶（HRP） 分子量（40000），不会遮盖抗原的结合部位 稳定，易获得较高纯度酶 具有较高活性及特异性 可溶性佳，生成的产物不扩散 组织中内源性酶较少 可作用于多种底物，产生不同颜色 HRP穿透力强，易进入细胞内,免疫酶组织化学技术,11,（一）辣根过氧化物酶（HRP）免疫酶组织化学技术11,（二）碱性磷酸酶（AKP） 从小牛肠粘膜或大肠杆菌中提取 组织穿透能力较弱 内源性AKP较高 左旋咪唑具有抑制作用,免疫酶组织化学技术,12,（二）碱性磷酸酶（AKP）免疫酶组织化学技术12,（三）葡萄糖氧化酶（GOD） 底物为葡萄糖，终产物稳定 体内无内源性GOD 分子量大，穿透力较弱,免疫酶组织化学技术,13,（三）葡萄糖氧化酶（GOD）免疫酶组织化学技术13,二、底物及其特点 酶底物酶底物酶产物（显色）,免疫酶组织化学技术,14,二、底物及其特点免疫酶组织化学技术14,HRP的底物： HRP的底物为低浓度的H2O2，供氢体为胺类及酚类化合物。,免疫酶组织化学技术,15,HRP的底物：免疫酶组织化学技术15,HRP显色反应： HRPH2O2 HRPH2O电子供体（氧化型）,电子供体,免疫酶组织化学技术,16,HRP显色反应：电子供体免疫酶组织化学技术16,电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，生成不溶性有色颗粒，并就地原位沉淀。,免疫酶组织化学技术,17,电子供体被氧化后，迅速改变颜色，通过聚合等反应，,HRP常用的电子供体： 3.3-二氨基联苯胺(DAB)棕色 氨乙基卡巴唑(AEC)红色，易溶于有机溶剂，易扩散，用水溶性封固剂。 4-氯-1-茶酚（4CN）蓝色，易弥散，不能久保存 3.3，5.5-四甲基联苯胺(TMB) 黄色,免疫酶组织化学技术,18,HRP常用的电子供体：免疫酶组织化学技术18,AKP底物： AKP常用的底物为-萘酚AS-B1磷酸盐 偶联试剂：固兰BB蓝色 固红TR红色,免疫酶组织化学技术,19,AKP底物：免疫酶组织化学技术19,第三节 酶标记抗体法 酶标记抗体法（Enzayme Labelled antibody）是将酶通过共价键结合在抗体分子上，制备成酶标记抗体，通过抗体去寻找相应抗原。,免疫酶组织化学技术,20,第三节 酶标记抗体法免疫酶组织化学技术20,一、直接法原理：HRP标记在特异性抗体 （第一抗体）上，抗原- 抗体 HRP复合物,免疫酶组织化学技术,21,一、直接法免疫酶组织化学技术21,直接法,免疫酶组织化学技术,22,组织抗原第一抗体过氧化物酶直接法免疫酶组织化学技术22,步骤：一步完成特点：方法简便、省时，专一 性强，非特异染色轻， 但敏感性差，一种标记 抗体只能检测一种抗原。,免疫酶组织化学技术,23,步骤：一步完成免疫酶组织化学技术23,二、间接法原理：HRP标记在第二抗体上， 抗原-特异性抗体-第 二抗体 HRP复合物步骤：二步法,免疫酶组织化学技术,24,二、间接法免疫酶组织化学技术24,组织抗原,第一抗原,第二抗体,过氧化物酶,间接法,免疫酶组织化学技术,25,组织抗原第一抗原第二抗体过氧化物酶间接法免疫酶组织化学技术2,特点：敏感性较直接法高，一 种标记抗体能用于相应 动物制备的多种特异性 抗体，检测多种抗原。 但较直接法费时，非特 异染色稍重。,免疫酶组织化学技术,26,特点：敏感性较直接法高，一免疫酶组织化学技术26,第四节 酶 抗 酶 法 制备抗酶抗体 制备PAP复合物,免疫酶组织化学技术,27,第四节 酶 抗 酶 法免疫酶组织化学技术27,酶桥法,组织抗原,第一抗体,第二抗体,第三抗体（抗酶抗体）,HRP,免疫酶组织化学技术,28,酶桥法组织抗原第一抗体第二抗体第三抗体（抗酶抗体）HRP免疫,一、PAP法原理：抗原-特异性抗体-第 二抗体（桥抗体）- PAP复合物步骤：三步法,免疫酶组织化学技术,29,一、PAP法免疫酶组织化学技术29,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP复合物,PAP法,HRP,免疫酶组织化学技术,30,组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物PAP法HRP免疫酶组织,特点： 敏感性较高，背景染色较轻 但特异性抗体与PAP必须为 同一种属动物,免疫酶组织化学技术,31,特点：免疫酶组织化学技术31,二、双PAP法：原理：在PAP的基础上再重复 第二抗体和PAP复合物抗原-特异性抗体-第二抗体（桥抗体）-PAP -第二抗体- PAP复合物,免疫酶组织化学技术,32,二、双PAP法：免疫酶组织化学技术32,组织抗原,第一抗原,第二抗体,PAP复合物,双PAP法,HRP,免疫酶组织化学技术,33,组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物双PAP法HRP免疫酶组,双PAP法,免疫酶组织化学技术,34,双PAP法组织抗原第一抗原第二抗体PAP复合物HRP免疫酶组,步骤：五步法 特点：敏感性较高缺点：但步骤多，费时，非特 异背景重,免疫酶组织化学技术,35,步骤：五步法 免疫酶组织化学技术35,三、APAAP法原理：抗原-特异抗体-第二 抗体- APAAP复合物步骤：三步法,免疫酶组织化学技术,36,三、APAAP法免疫酶组织化学技术36,APAAP法,免疫酶组织化学技术,37,APAAP法免疫酶组织化学技术37,特点：非特异背景较轻，不受内 源性酶的干扰。 但产物易溶于有机溶剂,免疫酶组织化学技术,38,特点：非特异背景较轻，不受内免疫酶组织化学技术38,第五节 卵白素-生物素Avidin为一种硷性糖蛋白，由四个相同亚基组成Biotin小分子维生素Avidin和Biotin具有较高亲和力,免疫酶组织化学技术,39,第五节 卵白素-生物素Avidin为一种硷性糖,一 、ABC法 Avidin Biotin Complex原理：酶标记Biotin形成酶素化 Biotin,免疫酶组织化学技术,40,一 、ABC法免疫酶组织化学技术40,酶素化BiotinAvidin - ABC 复合物 抗原-特异抗体- Biotin标记 第二抗- Avidin Biotin HRP,免疫酶组织化学技术,41,酶素化BiotinAvidin - ABC免疫酶,组织抗原,第一抗体,第二抗体,HRP,生物素,卵白素,ABC法,免疫酶组织化学技术,42,组织抗原第一抗体第二抗体HRP生物素卵白素ABC法免疫酶组织,步骤：三步法特点：敏感性较高，特异性强， 应用范围广,免疫酶组织化学技术,43,步骤：三步法免疫酶组织化学技术43, 某些脏器存在内源性生物素 干扰 Avidin与核酸及细胞膜中磷脂 有非特异反应,免疫酶组织化学技术,44, 某些脏器存在内源性生物素免疫酶组织化学技术44,SABC法 Streptavidin biotin Peroxidase Complex SABC法已代替ABC法,免疫酶组织化学技术,45,SABC法免疫酶组织化学技术45,二、LSAB法 Labelled Streptavidin Biotin Method原理： Biotin标记第二抗体,免疫酶组织化学技术,46,二、LSAB法免疫酶组织化学技术46,LSAB法,免疫酶组织化学技术,47,LSAB法免疫酶组织化学技术47, HRP标记Avidin 抗原-特异性抗体-Biotin标记第二抗体-Avidin HRP复合物,免疫酶组织化学技术,48, HRP标记Avidin免疫酶组织化学技术48,步骤：三步法特点：敏感性高，特异性强， 方法简便,免疫酶组织化学技术,49,步骤：三步法免疫酶组织化学技术49,第六节 多聚合物酶法 HRP-多聚合物-抗体 一、Epos法 Enhanced polymer one-step staining,免疫酶组织化学技术,50,第六节 多聚合物酶法免疫酶组织化学技术50,多聚合物酶法,免疫酶组织化学技术,51,多聚合物酶法免疫酶组织化学技术51,组织抗原,一抗,HRP,多聚骨架,EPOS 方法,免疫酶组织化学技术,52,组织抗原一抗HRP多聚骨架EPOS 方法免疫酶组织化学技术5,免疫酶组织化学技术培训课件,步骤：一步法特点：快速，简便，特异性强， 敏感性高 但商品化种类不全， 价格昂贵,免疫酶组织化学技术,54,步骤：一步法免疫酶组织化学技术54,二、EnVision法 Enhanced Labelled Polymer System原理：HRP -多聚合物-第二 抗体,免疫酶组织化学技术,55,二、EnVision法免疫酶组织化学技术55,组织抗原,一抗,二抗,酶,多聚骨架,第一步,第二步,EnVisionTM方法,免疫酶组织化学技术,56,组织抗原一抗二抗酶多聚骨架第一步第二步EnVisionTM方,特点：敏感性高：（1 mole复合物中含70mole HRP和10 mole第二抗体） 特异性强： 复合物内无内源性Avidin和Biotin的干扰。,免疫酶组织化学技术,57,特点：免疫酶组织化学技术57,第七节 基本操作步骤,1. 抗原修复2.内源性过氧化物抑制3. 正常血清封闭4. 第一抗体,5. 第二抗体6. 酶标记体7. DAB- H2O2显色,免疫酶组织化学技术,58,第七节 基本操作步骤 1. 抗原修复5. 第二抗体免疫酶组织,第八节 抗原定位及非特异染色,免疫酶组织化学技术,59,第八节 免疫酶组织化学技术59,组织细胞 固定问题 脱蜡不彻底 内源性过氧化物 内源性生物素,免疫酶组织化学技术,60,组织细胞 免疫酶组织化学技术60,抗原 抗原弥散 抗原异常表达 共同抗原决定簇,免疫酶组织化学技术,61,抗原 免疫酶组织化学技术61,特异性抗体 非特异吸附 抗体不纯 交叉反应,免疫酶组织化学技术,62,特异性抗体 免疫酶组织化学技术62,第二抗体 IgG交叉反应 二抗不纯,免疫酶组织化学技术,63,第二抗体 免疫酶组织化学技术63,标记物 质量 纯度 标记水平,免疫酶组织化学技术,64,标记物免疫酶组织化学技术64,底物溶液 DAB H2O2,免疫酶组织化学技术,65,底物溶液 免疫酶组织化学技术65,操作 复染 抗体稀释度 孵育时间 PAS洗涤,免疫酶组织化学技术,66,操作 免疫酶组织化学技术66,第九节 免疫酶方法评价,免疫酶组织化学技术,67,第九节 免疫酶组织化学技术67,