放射免疫分析课件.ppt
放射免疫分析 Radio immunoassay （RIA）,王海龙2006.03,1,放射免疫分析 Radio immunoassay （RI,探讨的主要内容,基本概念 基本原理 放射免疫方法的建立 放射免疫分析的要求和影响因素 免疫放射的基本概念 放免分析的应用,2,探讨的主要内容 基本概念2,第一节 放射免疫概述,3,第一节 放射免疫概述3,一、概念 一种体外超微量分析法，它是将具有高灵敏度的放射性核素（如125I）示踪技术与高度特异性的免疫化学技术二者结合建立起来的分析方法。用于定量测定受检标本中的抗原。,特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。,4,一、概念 特别适用于微量蛋白质、激素和多肽的定量测定。4,二、基本原理1、标记抗原（Ag*） 、非标记抗原（Ag）和特异性抗体（Ab）三者同时存在于一个反应体系，标记抗原和非标记抗原对特异性抗体具有相同的结合力，两者相互竞争结合特异性抗体。 Ag* + Ab = Ag* Ab + Ag AgAb,=,5,二、基本原理=5,2、作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的，非标记抗原是变化的。标记抗原与非标记抗原与限量的抗体发生竞争性结合。反应达到平衡时，标记抗原抗体复合物形成的量就随着非标记抗原的量而改变。 非标记抗原量增加，相应地结合较多的抗体，从而抑制标记抗原对抗体的结合，使标记抗原抗体复合物相应减少，游离的标记抗原相应增加，亦即抗原抗体复合物中的放射性强度与受检标本中抗原的浓度呈反比。,6,2、作为试剂的标记抗原和抗体的量是固定的，非标记抗原是变化的,3、将Ag* Ab与游离Ag*分开，分别测定其放射性强度，就可算出结合态的Ag* （B）与游离态的Ag* （F）的比值（B/F），或算出其结合率B/(BF)，这与标本中的抗原量呈函数关系。用一系列不同剂量的标准抗原进行反应，计算相应的B/F，可以绘制出一条剂量反应曲线。4、受检标本在同样条件下进行测定，计算B/F值，即可在剂量反应曲线上查出标本中抗原的含量。,7,3、将Ag* Ab与游离Ag*分开，分别测定其放射性强度，就,剂量反应曲线,8,剂量反应曲线 8,放射免疫分析原理示意图,9,放射免疫分析原理示意图 9,三、放射免疫测定的优点1）灵敏度高 大分子，ng/ml水平；小分子，pg/ml水 平。2）特异性好3）精确地定量4）操作方法越来越简便5）抗体的来源日益广泛，放射免疫可测定的微量物 质越来越多。,10,三、放射免疫测定的优点10,第二节 放射免疫基本试剂,11,第二节 放射免疫基本试剂11,一、标准品 标准品是放射免疫分析法定量的依据，由于以标准品的量用来表示被测物质的量，标准抗原的基本要求：(1)标准抗原与待测抗原的免疫性必须一致，即它们与 抗体的亲和力和特异性应相同。 (2)抗原必须纯度高。(3)标准抗原的量必须准确。(4)标准抗原应有很好的稳定性。,12,12,二、标记物1、标记抗原应具备：比放射性高，以保证方法的灵敏度；免疫活性好；所用的核素的半衰期尽可能长，标记一次可较 长时间使用，这对来之不易的抗原尤其重要；标记简便、易防护。,13,二、标记物13,2、标记用的核素有放射射线和射线两大类。前者主要为131I、125I、57Cr和60Co；后者有14C、3H和32P。放射性核素的选择首先考虑比活性。125I是目前常用的RIA标记物。标记125I的方法可分两大类，即直接标记法和间接标记法。,14,2、标记用的核素有放射射线和射线两大类。前者主要,三、抗体（抗血清） 抗血清中含有对其相应抗原的特异性抗体。目前常以抗原免疫年轻、健康的纯种小动物而诱发产生多克隆抗体，选取特异性高、亲和力强及滴度高的血清，为RIA所用。,15,三、抗体（抗血清）15,四、B与F分离剂 以2%加膜活性炭溶液为例，2%加膜活性炭溶液的配制：活性炭2g（杭州木材厂生产，森工牌732型）右旋糖酐T200.2g加0.1mol/L PBS 至100ml电磁搅拌1h，然后置于普通冰箱待用。,16,四、B与F分离剂16,五、缓冲液 目前最常用的缓冲液有下列几种：磷酸盐缓冲液；醋酸盐缓冲液；Tris HCl缓冲液；硼酸缓冲淮。其中以磷酸盐缓冲液应用最多。保护蛋白防腐剂酶抑制剂阻断剂载体蛋白,17,五、缓冲液17,六、试剂盒要注意的问题1）检查药盒的数量与药盒说明书是否一致（一般药盒内装有标记抗原、抗体、标准品、分离剂）。2）标准品，抗血清、标记抗原要在-20以下保存， 加样前要将标准品、抗血清、标记抗原充分混匀，标记抗原最好当天溶解，当天使用。3）分离剂不能冷冻保存应保存在4冰箱内。4）缓冲液，每种药盒的缓冲液不相同，不能相互使用。,18,六、试剂盒要注意的问题18,第三节 放射免疫测定,19,第三节 放射免疫测定19,一、样品的处理 血清、血浆（抗凝），尿液，组织匀浆 用蒸馏水或缓冲液作适当稀释。 血清或血浆抽入试管-20保存3个月， -70保存6个月。,20,一、样品的处理20,二、测定方法用放射免疫分析进行测定时分三个步骤，即抗原抗体的竞争抑制反应、B和F的分离及放射性的测量。,21,二、测定方法21,T：总放射性,只有标记抗原时的放射性。B0：待测抗原剂量为零时的最大结合。NSB：非特异结合，标记抗原结合在非抗血清的物质上的部分。非特异结合率： （NSB/T） 100% 最大结合率：（ B0 / T） 100%,22,T：总放射性,只有标记抗原时的放射性。22,加样程序 由于抗原、标记抗原和抗体三者加样次序不同，而出现两种加样程序，分述如下：,（一）抗原抗体反应将受检标本、标记抗原和抗血清按顺序定量加入小试管中，在一定的温度下进行竞争抑制反应。 37，2h或4过夜。,23,加样程序 （一）抗原抗体反应23,1、平衡饱和加样程序 （1）基本原理：让标记Ag和非标Ag与Ab以相同的机率反应，反应达到平衡后中止反应，分离结合和游离的标记Ag。 （2）加样程序：一般先加标准物或被测样品，再加抗血清，最后加标记物。这样的顺序是让标准物或被测物与抗体有短暂的结合，提高抗原的竞争抑制能力。,24,1、平衡饱和加样程序 24,IL-2 RIA加样程序（L）,25,试剂TNSBB0B1-B5样品缓冲液-200100-标,2、顺序饱和加样程序 （1）基本原理：先将标准物或样品与抗血清混匀，免疫反应1224h，使抗原与抗体充分结合，然后再加入标记抗原，与抗体反应624h，最后分离B与F，这称为顺序饱和分析法。（2）应用顺序饱和加样，第1次温育时间可以长，而第2次温育时间要短，这样可以提高灵敏度。,26,2、顺序饱和加样程序 26,尿钠素 RIA加样程序（L）,27,试剂TNSBB0B1-B5样品缓冲液-300200-标,（二）B、F分离技术在RIA反应中，标记抗原和特异性抗体的含量极微，形成的标记抗原抗体复合物（B）不能自行沉淀，因此需用一种合适的沉淀剂使它彻底沉淀，以完成与游离标记抗原（F）的分离。,28,（二）B、F分离技术28,1、非特异性分离法(1)吸附法：利用表面活性物质将反应液中的小分子游离部分F吸附，通过离心，将F沉淀，使大分子结合物B留在上清液中，而达到分离的目的。 ,29,29,(2)过滤法：反应液中B与F混合物在通过一定规格孔径的滤膜时，大分子不会通过滤膜孔被阻留在滤膜上，小分子游离的放射性物质F被抽吸通过滤膜而分离。(3)聚乙二醇（PEG）沉淀法：PEG沉淀剂的主要优点是制备方便，沉淀完全。缺点是非特异性结合率比用第二抗体为高，且温度高于30时沉淀物容易复溶。,30,(2)过滤法：反应液中B与F混合物在通过一定规格孔径的滤膜时,2、特异性分离法 (1)双抗法(Ab2法)：,(2)固相分离法：将特性抗体(第一或第二抗体) 或抗原结合在固相物质。(3)金黄色葡萄球菌A蛋白分离法。,31,2、特异性分离法(2)固相分离法：将特性抗体(第一或第二抗体,（三）放射性强度的测定 B、F分离后，即可进行放射性强度测定。测量仪器有两类，液体闪烁计数仪（射线，如3H、32P、14C等）和晶体闪烁计数仪（ 射线，如125、131I、57Cr等）。计数单位是探测器输出的电脉冲数，单位为cpm（计数/分），也可用cps（计数/秒）表示。,32,（三）放射性强度的测定32,（四）标准曲线的制备,用半对数纸，以标准抗原的不同浓度为横坐标，以在测定中得到的相应放射性强度为纵坐标作图。放射性强度可任选B或F，亦可用计算值B/(BF)、B/F和B/B0 （零标准管结合） 。标本应作双份测定，取其平均值，在制作的标准曲线图上查出相应的受检抗原浓度。,33,（四）标准曲线的制备 用半对数纸，以标准抗原的不同浓度,34,34,第四节 放射免疫的质控,35,第四节 放射免疫的质控35,一、质量控制的目的控制系统误差，减少偶然误差。系统误差：1、试剂盒的质量； 2、检测仪的性状（稳定性、灵敏度）偶然误差：1、实验方法的不同； 2、实验人员的操作,36,36,二、放射免疫分析中测量误差的控制 1选择准确性高的方法；2建立各种类型的标准； 对标准品应规定纯度及制备方法，使用年限及贮存条件。 3建立操作规程，按章操作； 4建立可靠的检查制度。,37,二、放射免疫分析中测量误差的控制 37,5）为了达到适宜的灵敏度，在系统中抗原剂量为零时的最大结合（即B0），是测定的起点（基准）。 NSB（非特异结合管）25%曲线就能用，结合率低于20%曲线就不能用。,38,5）为了达到适宜的灵敏度，在系统中抗原剂量为零时的最大结合（,第五节 放射免疫的应用,39,第五节 放射免疫的应用39,一、心血管功能类：血栓素（TXB2）消炎痛-EDTA抗凝6-酮-前列腺素F1消炎痛-EDTA抗凝内皮素ET抑肽酶-EDTA降钙素基因相关肽抑肽酶-EDTA心钠素ANP抑肽酶-EDTA肾上腺髓质素ADM抑肽酶-EDTA醛固酮肝素抗凝,40,一、心血管功能类：40,二、多肽因子类 肿瘤坏死因子TNF、IL-1、 IL-2、 IL-4、 IL-8、 IL-10、粒细胞-集落细胞刺激因子、胰岛素样生长因子-2、红细胞生成素（EPO）三、脑-肠肽类 胃动素（MTL）抑肽酶-EDTA神经降压素（NT）抑肽酶-EDTA神经肽（NPY）抑肽酶-EDTA胃泌素血清,41,二、多肽因子类41,四、骨代谢类骨钙素（BGP）血清降钙素（CT）血清甲旁素相关肽抑肽酶-EDTA五、甲状腺功能类游离T3游离T4甲状腺球蛋白TG总T3总T4 都为血清,42,四、骨代谢类42,六、肿瘤检测类甲胎蛋白（AFP） 癌胚抗原（CEA）铁蛋白2微球蛋白七、糖尿病类胰岛素 胰岛素抗体 胰高血糖素C-肽,43,六、肿瘤检测类43,八、 吗啡、叶酸、维生素 性激素类,44,八、 吗啡、叶酸、维生素 性激素类 44,醒醒，下课啦！,45,醒醒，下课啦！ 45,
