放射免疫分析全面版课件.pptx

1,放射免疫分析,第1页/共119页,1放射免疫分析第1页/共119页,第1讲 放射免疫分析 的概念和产生,放射免疫分析(radioimmunoassay，RIA)是最早的一种标记免疫分析，通过放射性示踪物观察抗原与抗体的结合反应产物测定微量物质。,第2页/共119页,第1讲 放射免疫分析 的概念和产生,1952年I.A. Mirsky提出老年性糖尿病可能不是因为胰岛素分泌不足引起的，而是由于肝胰岛素酶降解胰岛素的速度加快引起的。,第3页/共119页,1952年I.A. Mirsky提出老年性糖尿病可能不是因为,为了验证这种观点，S.A. Berson和R.S. Yalow等人(1956)给非糖尿病和糖尿病受试者静脉注射131I标记胰岛素以研究其代谢，他们比较了接受胰岛素治疗的病人和从未接受过胰岛素的受试者的血浆，发现前者胰岛素的消失速度比后者慢得多，提出外源胰岛素的注射使病人体内产生了抗体，与抗体的结合导致胰岛素消失速度降低。,第4页/共119页,为了验证这种观点，S.A. Berson和R.S. Yalo,第5页/共119页,R.S. YalowS.A. Berson第5页/共119页,由于胰岛素抗体的浓度太低，用以往的免疫学技术不能测定，因此Berson和Yalow等人采用放射性标记法测定浓度极低的抗原-抗体复合物。电泳结果表明在接受胰岛素治疗的病人的血浆中，胰岛素与一种球蛋白结合，证明胰岛素抗体确实存在。,第6页/共119页,由于胰岛素抗体的浓度太低，用以往的免疫学技术不能测定，因此B,值得一提的是，在20世纪50年代中期，免疫学家还不能接受“胰岛素抗体”这一概念。Berson和Yalow等人的论文被Science退稿，刚开始投Journal of Clinical Investigation(JCI)也是退稿，后来向JCI的编辑作出妥协，从标题中删去“胰岛素抗体”字样，论文才得以在JCI上发表。,第7页/共119页,值得一提的是，在20世纪50年代中期，免疫学家还不能接受“胰,Berson和Yalow等人的工作引发了免疫学上的一场革命。现在普遍认为一些小分子量的多肽如后叶加压素和后叶催产素也可以是抗原。,第8页/共119页,Berson和Yalow等人的工作引发了免疫学上的一场革命。,在方法上，Berson和Yalow等人提出：当抗体已定量时，标记胰岛素和抗体的结合与非标记胰岛素的浓度成函数关系，这就为血浆胰岛素的放射免疫分析提供了基础。,第9页/共119页,在方法上，Berson和Yalow等人提出：当抗体已定量时，,在随后的几年中，他们又做了一些研究工作，包括胰岛素与其抗体反应的定量和可得抗血清的物种特异性等，这些必要的工作使放射免疫分析由理论转变为实践，于1959年首次完成人血浆(不进行抽提)胰岛素的测定。,第10页/共119页,在随后的几年中，他们又做了一些研究工作，包括胰岛素与其抗体反,RIA具有技术简易、价格便宜、特异性强和灵敏度高等优点，广泛用于生物医学研究和临床诊断。到20世纪60年代晚期，RIA已成为一项重要的分析技术。,第11页/共119页,RIA具有技术简易、价格便宜、特异性强和灵敏度高等优点，广泛,据估计，在1975年的一年之中，全美进行RIA的临床实验室有4000个以上。Yalow因此荣获1977年Nobel生理学或医学奖(遗憾的是，Berson于1972年因心脏病逝世，未能共享殊荣)。,第12页/共119页,据估计，在1975年的一年之中，全美进行RIA的临床实验室有,第2讲 放射免疫分析 的原理和特点,当抗体初始浓度Ab0低于标记抗原初始浓度Ag*0和非标记抗原初始浓度Ag0之和时，非标记抗原Ag将与标记抗原Ag*竞争结合抗体Ab，分别生成非标记抗原-抗体复合物Ag-Ab和标记抗原-抗体复合物Ag*-Ab。,第13页/共119页,第2讲 放射免疫分析 的原理和特点,第14页/共119页,Ag* + AbAg*-Ab+Ag-Ab第14页,当Ab0和Ag*0都已确定时，如果Ag0低，则生成的Ag*-Ab多(其浓度B高)，剩余的标记抗原Ag*少(其浓度F低)，B/F值较高；相反，如果Ag0高，则B低，F高，B/F值较低。,第15页/共119页,当Ab0和Ag*0都已确定时，如果Ag0低，则生,在测定时，Ab0和Ag*0都是已知的。以B/F值为纵坐标，以标准溶液非标记抗原初始浓度为横坐标制作标准曲线，得到回归方程，在相同条件下测定未知非标记抗原的B/F值，即可用回归方程求得未知非标记抗原的初始浓度。,第16页/共119页,在测定时，Ab0和Ag*0都是已知的。以B/F值为纵,第17页/共119页,0Ag0B/F标准曲线第17页/共119页,根据加样顺序与温育次数的不同，放射免疫分析可分为如下三种。平衡法：将非标记抗原、抗体、标记抗原依次加入反应管，混匀后一次性温育至反应达到动态平衡，再加分离剂使B与F分离。,第18页/共119页,根据加样顺序与温育次数的不同，放射免疫,顺序加样法：先将非标记抗原与抗体在反应管内作第一次温育，待反应达到动态平衡后，加入标记抗原，作第二次温育，然后分离B与F。,第19页/共119页,顺序加样法：先将非标记抗原与抗体在反应管内作第一次温育，待反,急诊检测法：为临床上快出结果而提出的反应方式，不等RIA反应达到动态平衡就终止反应。,第20页/共119页,急诊检测法：为临床上快出结果而提出的反应方式，不等RIA反应,放射免疫分析巧妙地结合了抗体抗原反应的高特异性和放射性核素标记的高灵敏度。RIA的灵敏度极高，可检出0.1 pg/ml(0.05 pM)的胃泌激素。,第21页/共119页,放射免疫分析巧妙地结合了抗体抗原反应的高特异性和放射性核素标,相比之下，受体位点分析(receptor site assay)的最低检出浓度一般至少是RIA的10-100倍。酶标记分析(enzyme marker assay)由于作为标记的酶分子与抗原共价连接，抗原-抗体反应存在空间阻碍，分析灵敏度的降低几乎不可避免。,第22页/共119页,相比之下，受体位点分析(receptor site assa,第3讲 放射免疫分析的发展,第1代(1959-1964)：Berson和Yalow等人于1959年首次提出了竞争抑制免疫反应原理，创建了RIA技术检测人血浆胰岛素的水平。1960年，Ekins根据RIA相同原理，以某些天然特异性蛋白作结合剂，建立了竞争结合蛋白分析法(CPBA)检测血浆中的甲状腺素、甾体类激素等小分子半抗原。因操作程序比较复杂，难以应用到临床样品的常规检测。,第23页/共119页,第3讲 放射免疫分析的发展第1代(1959-1964)：B,第2代(1965-1970)：RIA技术的独特优势受到生物医学研究者的高度关注，许多学者对这一新的检测技术进行了大量方法学的研究，在抗原-抗体复合物和游离标记抗原分离方法上取得了满意的结果，简化了实验程序，将RIA和CPBA技术推进到了临床实用水平，为建立试剂盒产业化生产提供了条件。,第24页/共119页,第2代(1965-1970)：RIA技术的独特优势受到生物医,第3代(1971-1980)：1970年Brown等人将三碘甲腺原氨酸(T3)和聚赖氨酸以共价键偶联制成结合物(T3-PLL)，免疫动物获得T3抗体，打破了半抗原不能制备出抗体的论断，1971年Chopra首次完成了血清T4 RIA方法的建立。从此，RIA完全取代了CPBA检测小分子化合物，扩大了RIA技术应用范围，推动了RIA试剂盒产业化的发展。,第25页/共119页,第3代(1971-1980)：1970年Brown等人将三碘,第4代(1981-1995)：早在l975年，Milstein和Kshler将绵羊红细胞注射给小鼠，将获得的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合，得到了杂交细胞，经培养、分离、成株等系列步骤后，首次制备出小鼠抗绵羊红细胞的单克隆抗体(mAb)。这一重大研究成果为RIA及其他免疫分析技术提供了新型特异性抗体。进入20世纪80年代，mAb制备技术的完善和许多固相载体材料的研制成功，将试管固相、塑料球等包被mAb制成固相抗体，传统IRMA技术的灵敏度、特异性和检测量程度提高到了一个新水平。,第26页/共119页,第4代(1981-1995)：早在l975年，Milstei,第5代：近年来，磁性微粒子在标记免疫分析中的应用迅速，它是在磁性活性炭和磁性微球的基础上发展起来的。磁性微粒子和磁性微球主要差别是直径的大小和均一性。前者直径为800-2000 nm，均一性良好，在液体中具有较高的悬浮性，而磁性微球则否。磁性微粒子表面带有活性基团，如-CONH2、-NH2和-COOH等，经偶联剂以共价键结合抗体制成磁性固相抗体。其包被量大、均一性高、牢固性强等特点是物理吸附难以比拟的。磁性微粒子固相抗体或固相亲和素首先应用于CLIA试剂盒的制造，最近也应用于IRMA和RIA。,第27页/共119页,第5代：近年来，磁性微粒子在标记免疫分析中的应用迅速，它是在,(1)液相双标记IRMA技术：将两株mAb分别标记125I和异硫氰酸荧光素(fluorescein isothicyanate，FITC)作为标记试剂，检测时将样品和标记试剂加至试管中，温育后加入磁性固相抗FITC，5 min后，置于磁性分离器上，洗涤后即测量放射性。抗原和标记抗体在液相中反应生成双抗体夹心复合物，免疫反应达到平衡所需时间比固相试管法更短，各项技术参数均超过目前广泛采用的IRMA法。,第28页/共119页,(1)液相双标记IRMA技术：将两株mAb分别标记125I和,(2)磁性固相第二抗体RIA竞争法：这一免疫反应模式实际上是一种新型的磁性二抗分离技术，有两种不同的第二抗体可制成磁性固相供快速分离。一种是制备抗第一抗体的二抗磁性微粒子固相作分离剂，另一种是将第一抗体IgG标记FITC、抗FITC抗体和磁性微粒子结合作为分离剂，两种分离剂检测结果高度一致。与常规试剂盒相比，优点是不必加复合二抗分离剂以及离心沉淀分离步骤，简化了程序，缩短了时间，提高了精密度。,第29页/共119页,(2)磁性固相第二抗体RIA竞争法：这一免疫反应模式实际上是,(3)磁性第一抗体固相RIA竞争法：此种免疫反应模式是将第一抗体制成磁性微粒子固相，检测程序较磁性第二抗体分离剂法更简便，可一步完成。只需将样品、125I标记抗原和磁性微粒子固相抗体加至塑料管中，温育后置磁性分离器上倾出上清液，经一次洗涤后即可测量放射性强度。在实验研究中发现，此模式非特异结合过高，而操作人员又很难发现，从而降低了检测技术的灵敏度和精密度，影响测值的准确性。,第30页/共119页,(3)磁性第一抗体固相RIA竞争法：此种免疫反应模式是将第一,(4)自身抗体快速检测法：许多临床常见病、多发病的发病机理与自身免疫状态关系密切，如甲状腺疾病、糖尿病和系统性红斑狼疮等，检测相关自身抗体对临床诊断及疗效判断是一种有价值的指标。采用磁性微粒子RIA技术，具有简便、快速、特异性高等优点，其原理是血清中的抗体和125I-抗原混合温育，生成抗原-抗体复合物，然后反应液中加入抗人IgG磁性微粒子分离剂5 min，置于磁性分离器上，弃上清液，测放射性。放射性强度与血清中自身抗体量呈正比。,第31页/共119页,(4)自身抗体快速检测法：许多临床常见病、多发病的发病机理与,(5)生物活性肽IRMA法：生物活性肽是一类分子量为(2-4) 103的肽类，参与多种生理生化代谢和互相调节过程，检测这类物质水平对研究心脑血管疾病的发生、发展及防治具有重要意义。最近的实验研究表明，生物活性肽在人血浆中以多种形式存在。既有前体物又有降解产物的片段，目前检测这类化合物采用多抗RIA竞争法，抗体和降解物片段有不同程度的免疫反应，测值为待测物和降解物的总和，称为免疫反应样物质，不能表示待测物的真实浓度。随着肽合成技术的完善和mAb制备方法的改进，已可由生物制品公司提供肽的N端和C端肽类化合物片段及相应的mAb，使建立生物活性肽IRMA技术成为现实。研究者应用这一新的技术研制的人血清C-肽磁性微粒子RIA试剂盒，其各项方法学指标超过目前市场上的产品水平。,第32页/共119页,(5)生物活性肽IRMA法：生物活性肽是一类分子量为(2-4,具有类似原理的其他分析方法,免疫放射分析(IRMA) 标记的是抗体，分为如下两种。单位点IRMA：抗原为小分子抗原，只有一个抗原决定簇，见下页图。,第33页/共119页,具有类似原理的其他分析方法免疫放射分析(IRMA)第33页/,上图中ImAd-Ag为固相抗原免疫吸附剂，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗原。,第34页/共119页,上图中ImAd-Ag为固相抗原免疫吸附剂，一般用聚苯乙,双位点IRMA：又称双抗体夹心法，抗原有两个抗原决定簇，所用的两种抗体在与同一抗原结合时互不干扰，见下页图。,第35页/共119页,双位点IRMA：又称双抗体夹心法，抗原有两个抗原决定簇，所用,上图中ImAd-Ab为固相抗体免疫吸附剂，一般用聚苯乙烯塑料珠包被抗体。,第36页/共119页,上图中ImAd-Ab为固相抗体免疫吸附剂，一般用聚苯,从加样顺序来看，双位点IRMA分为如下三种。正向两步法：待测抗原先与固相抗体结合，再与标记抗体结合，然后去除游离的标记抗体，测固相抗体-抗原-标记抗体复合物的放射性计数。,第37页/共119页,从加样顺序来看，双位点IRMA分为如下,反向两步法：待测抗原先与标记抗体结合，再与固相抗体结合，然后去除游离的标记抗体，测固相抗体-抗原-标记抗体复合物的放射性计数。,第38页/共119页,反向两步法：待测抗原先与标记抗体结合，再与固相抗体结合，然后,一步法：又称同时加样法，待测抗原与固相抗体和标记抗体同时反应，然后去除游离的标记抗体，测固相抗体-抗原-标记抗体复合物的放射性计数。,第39页/共119页,一步法：又称同时加样法，待测抗原与固相抗体和标记抗体同时反应,放射受体分析3H标记的四环素可与样品中四环素类药物竞争结合特异性受体，当样品中残留有四环素类药物时，残留药物与受体结合，从而阻止了标记四环素与受体的结合。样品中的四环素类药物含量越高则结合的受体越多，而标记四环素结合的受体越少。,第40页/共119页,放射受体分析第40页/共119页,第4讲 放射免疫分析的应用,RIA除了用于测定胰岛素、胃泌激素外，还被用于测定维生素B12和甲状腺素等。在临床上，用放射免疫分析可检测2-微球蛋白和铁蛋白等。可用RIA测定的物质如下：一、肽类激素垂体激素：生长激素、促肾上腺皮质素、促黑激素(-促黑激素、-促黑激素)、糖蛋白类(促甲状腺素、促卵泡激素、促黄体激素)、催乳素、促脂素、加压素、催产素绒毛膜激素：人绒毛膜促性腺激素、人绒毛膜生长促乳素胰腺激素：胰岛素、胰高血糖素、胰多肽,第41页/共119页,第4讲 放射免疫分析的应用 RIA除了用于测定胰岛素,趋钙激素：甲状旁腺素、降钙素胃肠激素：胃泌素、促胰液素、缩胆囊肽、血管活性肠多肽、胃抑制多肽血管活性组织激素：血管紧张素、缓激肽释放抑制因子：促甲状腺素释放激素、促黄体激素释放激素、促生长素抑制素其他肽：P物质、内啡肽、脑啡肽,第42页/共119页,趋钙激素：甲状旁腺素、降钙素第42页/共119页,二、非肽类激素甲状腺激素：甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、反三碘甲腺原氨酸类固醇：醛固酮、皮质类固醇、雌激素、雄激素、孕酮前列腺素生物胺：5-羟色胺、褪黑激素,第43页/共119页,二、非肽类激素第43页/共119页,三、非激素物质药物与维生素：强心苷、滥用药物、精神活性药物、抗生素、中枢神经系统抑制剂、维生素A、叶酸环核苷酸酶：C1酯酶、果糖1,6-二磷酸酶、纤维蛋白溶酶原、纤维蛋白溶酶、糜蛋白酶、胰蛋白酶、碳酸酐酶同工酶、醛糖还原酶、羧肽酶、胰弹性蛋白酶,第44页/共119页,三、非激素物质第44页/共119页,病毒：肝炎相关抗原、鼠白血病病毒(粗病毒，劳氏病毒，莫氏病毒)、Mason-Pfizer猴病毒肿瘤抗原：癌胚抗原、甲胎蛋白血清蛋白：甲状腺素结合球蛋白、免疫球蛋白(G、E、A、M)、备解素、纤维蛋白原、阿朴脂蛋白B、肌红蛋白、髓基本蛋白其他：内在因子、类风湿因子、凝血因子XII、后叶激素运载蛋白、葡萄球菌肠毒素,第45页/共119页,病毒：肝炎相关抗原、鼠白血病病毒(粗病毒，劳氏病毒，莫氏病毒,第5讲 非标记抗原的准备,制备标记抗原、特异性抗体和制作标准曲线都需要高纯度的非标记抗原。非标记抗原纯化的方法有：盐析法、凝胶过滤法、离子交换法、柱层析法、亲和层析法、免疫沉淀法、电泳法和高效液相色谱法等。,第46页/共119页,第5讲 非标记抗原的准备制备标记抗原、特异性抗体和制作标准,若是半抗原，则先要制备成人工抗原。对于具有氨基的半抗原，可用碳化二亚胺法合成与载体羧基以肽键连接的人工抗原，或者用戊二醛法合成与载体氨基以西佛碱键连接的人工抗原。,第47页/共119页,若是半抗原，则先要制备成人工抗原。对于具有氨基的半抗原，可用,第48页/共119页,第48页/共119页,第49页/共119页,第49页/共119页,对于具有羧基的半抗原，可用碳化二亚胺法或氯甲酸异丁酯法合成与载体氨基以肽键连接的人工抗原。,第50页/共119页,对于具有羧基的半抗原，可用碳化二亚胺法或氯甲酸异丁酯法合成与,第51页/共119页,第51页/共119页,具有羟基、酮基、酚基的半抗原先分别用琥珀酸酐法、O-(羧甲基)羟胺法、一氯醋酸钠法和重氮化的对氨基苯甲酸法合成具有羧基的半抗原衍生物，再用碳化二亚胺法或氯甲酸异丁酯法合成人工抗原。,第52页/共119页,具有羟基、酮基、酚基的半抗原先分别用琥珀酸酐法、O-(羧甲基,第53页/共119页,第53页/共119页,第54页/共119页,第54页/共119页,第55页/共119页,第55页/共119页,第56页/共119页,第56页/共119页,第6讲 标记抗原的准备,多数采用125I标记抗原，标记方法有如下几种。6.1 氯胺-T法氯胺-T(N-氯-p-甲苯磺胺钠，见下页图)在溶液中能缓慢释放出次氯酸，该酸是一种温和氧化剂，可将125I离子氧化成125I，后者可取代抗原Tyr残基苯环上3和5位上的H。抗原中的各Tyr的碘化程度不一样，取决于Tyr的暴露程度。,第57页/共119页,第6讲 标记抗原的准备 多数采用125,第58页/共119页,第58页/共119页,不足之处是可能引起抗原免疫活性的丢失，原因在于：碘取代Tyr上的H改变了抗原性；内照射损伤了抗原；氧化剂对抗原造成损伤；试剂中聚合的碘引起抗原损伤。,第59页/共119页,不足之处是可能引起抗原免疫活性的丢失，原因在于：碘取代Tyr,其操作流程为： 将试剂溶解于磷酸缓冲液中，pH为。在反应管中加入抗原5 g(10 L)。加Na125I 37 MBq(10 L)。加氯胺-T 10 g(15 L)，边加边搅拌，三者混匀，反应1 min。,第60页/共119页,其操作流程为： 第60页/共119页,加入Na2S2O5 200 g(30 L)中止反应。纸层析测定标记率。Sephadex G-50凝胶过滤分离、纯化。测定标记抗原的放化纯度、鉴定免疫活性、加防腐剂、加白蛋白稀释，冷干，保存。,第61页/共119页,加入Na2S2O5 200 g(30 L)中止反应。第6,6.2 酶促碘化法6.2.1 乳过氧化物酶法用乳过氧化物酶催化H2O2放出O2，将125I离子氧化成125I。它比氯胺-T法温和，副反应较少，一般不改变抗原的三维结构，可得到高免疫活性和高比活度的标记抗原。,第62页/共119页,6.2 酶促碘化法第62页/共119页,其操作流程为：将试剂溶解于0.4 mol/L醋酸缓冲液，pH为。在反应管中加抗原5 g(10 L)。加乳过氧化物酶25 ng(10 L)。加H2O2 200 ng(10 L)。,第63页/共119页,其操作流程为：第63页/共119页,具有羟基、酮基、酚基的半抗原先分别用琥珀酸酐法、O-(羧甲基)羟胺法、一氯醋酸钠法和重氮化的对氨基苯甲酸法合成具有羧基的半抗原衍生物，再用碳化二亚胺法或氯甲酸异丁酯法合成人工抗原。准确性是指测量值与真值的符合程度。急诊检测法：为临床上快出结果而提出的反应方式，不等RIA反应达到动态平衡就终止反应。当Ab0和Ag*0都已确定时，如果Ag0低，则生成的Ag*-Ab多(其浓度B高)，剩余的标记抗原Ag*少(其浓度F低)，B/F值较高；当Ab0和Ag*0都已确定时，如果Ag0低，则生成的Ag*-Ab多(其浓度B高)，剩余的标记抗原Ag*少(其浓度F低)，B/F值较高；放射性强度与血清中自身抗体量呈正比。用缓冲液冲洗Iodo-bead和反应管，洗液与反应液合并，后经纯化。具有类似原理的其他分析方法待测样品作一系列稀释，将其反应曲线与标准曲线比较。在反应管中加入抗原5 g(10 L)。,加Na125I 37 MBq(10 L)。混匀，反应7 min，再加上述H2O2 3 L，继续反应7 min。加入10 mmol/L巯基乙醇0.5 mL阻断反应1 min。加入载体NaI溶液1 mL。上葡聚糖凝胶柱分离纯化。,第64页/共119页,具有羟基、酮基、酚基的半抗原先分别用琥珀酸酐法、O-(羧甲基,6.2.2 葡萄糖氧化酶法葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能少量而不断地、有控制地产生H2O2参与碘化反应，对标记抗原免疫活性的影响比乳过氧化物酶法更小。反应易于控制，加入葡萄糖即能启动，加入含有0.1 N NaN3的缓冲液即能停止。,第65页/共119页,6.2.2 葡萄糖氧化酶法第65页/共119页,6.3 联接碘化法某些抗原缺乏Tyr或Tyr的碘化降低了抗原的免疫活性，可用联接碘化法。该法由Bolton和Hunter于1973年建立。主要步骤是先用氯胺-T法将3-(p-羟苯)-丙酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯用125I标记，用苯抽提碘化产物，干燥后与抗原混合反应1 h，碘化乙酰基以肽键与抗原的-NH2或-NH2连接。,第66页/共119页,6.3 联接碘化法第66页/共119页,其优点是可避免与氧化剂接触而导致的损伤；一般不会使His碘化。缺点是可能使重要的Lys酰基化而影响抗原与抗体的结合。,第67页/共119页,其优点是可避免与氧化剂接触而导致的损伤；一般不会使His碘化,6.4 固相催化碘化法6.4.1 Iodogen碘化法Iodogen即氯甘脲，化学名称为1,3,4,6-四氯-3, 6-二苯甘脲，是一种固相催化剂。主要步骤：将Iodogen 1 mg溶于25 mL的二氯甲烷，取50 L加入反应管，用N2吹干有机溶剂，即在反应管底部形成Iodogen薄膜，加入Na125I和抗原，轻轻摇动，反应5-20 min，即可标记抗原。,第68页/共119页,6.4 固相催化碘化法第68页/共119页,6.4.2 Iodo-bead碘化法Iodo-bead是一种无孔聚苯乙烯小球，其上连接了氯胺-T衍生物(N-氯-苯磺酰胺钠)。主要步骤：在2 mL带盖的塑料试管中加入5 L抗原(5 ng)，加45 L磷酸盐缓冲液(，0.1 mol/L)，加2 L Na125I 37 MBq，加一粒或多粒Iodo-bead，立即盖上盖，反应5 min，用移液管把反应液转移到另一个试管。用缓冲液冲洗Iodo-bead和反应管，洗液与反应液合并，后经纯化。,第69页/共119页,6.4.2 Iodo-bead碘化法第69页/共119页,6.5 标记抗原的纯化和鉴定标记后反应液中含有未标记抗原、损伤的标记抗原、未损伤的标记抗原、Na125I和磷酸盐等，只有未损伤的标记抗原才是分析所需，其纯化的方法有：离子交换法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、薄层层析法和高效液相色谱法等。,第70页/共119页,6.5 标记抗原的纯化和鉴定第70页/共119页,一般认为每个抗原分子标记上一个125I原子，对免疫活性影响不大，若标记上二个125I原子则可能对免疫活性有影响，因此要测定标记抗原的比活度。,第71页/共119页,一般认为每个抗原分子标记上一个125I原子，对免疫活性影响不,比活度按如下公式计算：,第72页/共119页,比活度按如下公式计算：A YW比活度 =式中A为投入总放射,标记抗原的免疫活性鉴定可用理化方法如电泳法、吸附法和凝胶过滤法等，也可测定标记抗原与抗体的结合率，再测定标记抗原和非标记抗原对抗体的亲和力是否一致。,第73页/共119页,标记抗原的免疫活性鉴定可用理化方法如电泳法、吸附法和凝胶过滤,第7讲 抗体的准备及标记抗原-抗体 复合物与标记抗原的分离,7.1 多克隆抗体抗原的乳化：将抗原与福氏完全佐剂(石蜡油2份、羊毛脂1份、每mL另加卡介苗5-10 mg)混合制成乳化液。,第74页/共119页,第7讲 抗体的准备及标记抗原-抗体 复合物与,免疫动物：一般用兔、豚鼠、山羊和绵羊作为免疫动物，多数采用纯种家兔(1.5-2.0 kg雄性健壮大耳白兔)，在同一批中应有足够数量的兔子，以便从中挑选高质量的抗体。免疫剂量：每只兔子注射1-2 mg的抗原。,第75页/共119页,免疫动物：一般用兔、豚鼠、山羊和绵羊作为免疫动物，多数采用纯,免疫部位：在兔颈、背部的皮内、皮下多点注射或肌肉、脚垫及近淋巴结的大腿外侧注射。免疫时间：对于大分子抗原，可在注射后6-8周采血测定抗体滴度。对于人工抗原，在注射后14-16周才可采血测定抗体滴度。,第76页/共119页,免疫部位：在兔颈、背部的皮内、皮下多点注射或肌肉、脚垫及近淋,7.2 抗体质量鉴定特异性：若抗体与待测抗原的结合力强，与类似抗原的结合力弱，表示抗体特异性强。反之，表明类似抗原将对测定结果产生干扰。,第77页/共119页,7.2 抗体质量鉴定第77页/共119页,鉴定抗体特异性需作交叉反应，其方法是将类似抗原配成不同的浓度，按照待测抗原相同的条件制作标准抑制曲线，求得各自的半抑制浓度(IC50)，按Thornecroft法计算交叉反应率。,第78页/共119页,鉴定抗体特异性需作交叉反应，其方法是将类似抗原配成不同的浓度,第79页/共119页,交叉反应率(%)=待测抗原的IC50类似抗原的IC50 1,亲和力：抗体与抗原的亲和力表示两者结合的牢固程度。亲和力大，则结合速度快、解离度小。反之，则结合速度慢、不牢固、易解离。,第80页/共119页,亲和力：抗体与抗原的亲和力表示两者结合的牢固程度。亲和力大，,抗体亲和力可用亲和常数K表示。如果Ab0已确定，那么,第81页/共119页,抗体亲和力可用亲和常数K表示。如果Ab0已确定，那么K,K值可通过作Scatchard图求得，以B/F值为纵坐标，以B浓度为横坐标作直线回归，所得直线斜率即为亲和常数K。,第82页/共119页,K值可通过作Scatchard图求得，以B/F值为纵坐标，以,滴度：抗体的稀释倍数过高或过低均会影响分析的灵敏度和准确性。抗体的滴度反应其浓度。将抗体按一系列倍数稀释，分别与定量的标记抗原反应，用分离剂将标记抗原-抗体复合物和标记抗原分离，以B/T%为纵坐标，以抗体的稀释倍数为横坐标作图，B/T%为50%时的稀释倍数即称为抗体的滴度。,第83页/共119页,滴度：抗体的稀释倍数过高或过低均会影响分析的灵敏度和准确性。,7.3 单克隆抗体将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交细胞，该杂交细胞产生的抗体只作用于一种抗原决定簇。将B淋巴细胞与骨髓瘤细胞按2-10 : 1的比例混合，在50%的聚乙二醇作用下可实现融合，融合的成功率约几万分之一。,第84页/共119页,7.3 单克隆抗体第84页/共119页,指抗体与待测抗原的类似抗原的交叉反应程度，前文已作叙述。根据加样顺序与温育次数的不同，放射免疫分析可分为如下三种。磁性微粒子固相抗体或固相亲和素首先应用于CLIA试剂盒的制造，最近也应用于IRMA和RIA。抗体的滴度反应其浓度。放射免疫分析及其相关的技术.3H标记的四环素可与样品中四环素类药物竞争结合特异性受体，当样品中残留有四环素类药物时，残留药物与受体结合，从而阻止了标记四环素与受体的结合。正向两步法：待测抗原先与固相抗体结合，再与标记抗体结合，然后去除游离的标记抗体，测固相抗体-抗原-标记抗体复合物的放射性计数。放免实验室通风换气应良好，避免空气中有粉尘，应采用湿式操作的方法，可使污染降低到最低。肿瘤抗原：癌胚抗原、甲胎蛋白第四军医大学出版社.具有羟基、酮基、酚基的半抗原先分别用琥珀酸酐法、O-(羧甲基)羟胺法、一氯醋酸钠法和重氮化的对氨基苯甲酸法合成具有羧基的半抗原衍生物，再用碳化二亚胺法或氯甲酸异丁酯法合成人工抗原。有的放射免疫分析先在37温育一段时间，再在4下温育。具有羟基、酮基、酚基的半抗原先分别用琥珀酸酐法、O-(羧甲基)羟胺法、一氯醋酸钠法和重氮化的对氨基苯甲酸法合成具有羧基的半抗原衍生物，再用碳化二亚胺法或氯甲酸异丁酯法合成人工抗原。常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸缓冲液和硼酸缓冲液。第113页/共119页福建水产, 2005, (3): 47-49.采用磁性微粒子RIA技术，具有简便、快速、特异性高等优点，其原理是血清中的抗体和125I-抗原混合温育，生成抗原-抗体复合物，然后反应液中加入抗人IgG磁性微粒子分离剂5 min，置于磁性分离器上，弃上清液，测放射性。,融合后在氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶（HAT）培养液中、5-7%的CO2、37的条件下培养。未融合的B淋巴细胞和骨髓瘤细胞几天后渐渐死亡，只有融合的杂交细胞能在HAT培养液中生长传代，经10-14天的培养，杂交细胞形成克隆。,第85页/共119页,指抗体与待测抗原的类似抗原的交叉反应程度，前文已作叙述。融合,此时用免疫学方法检测杂交细胞分泌的抗体，通过对千百个培养小孔中培养的上清液进行筛选，可发现一些抗体阳性的孔，尽快将能够分泌所需抗体的高滴度阳性孔中的杂交细胞进行单细胞克隆。,第86页/共119页,此时用免疫学方法检测杂交细胞分泌的抗体，通过对千百个培养小孔,重复上述检测和克隆，确保得到的抗体是单个细胞后代分泌的。一旦杂交细胞能稳定地产生高滴度抗体，即将该杂交细胞扩大培养。,第87页/共119页,重复上述检测和克隆，确保得到的抗体是单个细胞后代分泌的。一旦,其方法是将它注射到预先用降植烷或医用石蜡油处理过的同种小鼠的腹腔内，让杂交细胞在腹腔内生长，一般经10-14天后，小鼠腹部胀大形成腹水，在其腹水或血清中含有高浓度的单克隆抗体。这种细胞若不用时，可在液氮中长期保存，需要时可取出扩大培养，可得到同质的单克隆抗体。,第88页/共119页,其方法是将它注射到预先用降植烷或医用石蜡油处理过的同种小鼠的,7.4 标记抗原-抗体复合物与标记抗原的分离双抗体法：第一抗体与抗原结合，第二抗体与第一抗体结合，生成分子量较大的复合物(Ag-Ab1-Ab2)，能自然沉淀。优点是分离效果好、非特异性结合率低，缺点是费用增加、需要第二次温育、时间延长。,第89页/共119页,7.4 标记抗原-抗体复合物与标记抗原的分离第89页/共11,聚乙二醇(PEG)法：PEG浓度为7-9%时能使抗原-抗体复合物沉淀。优点是经济、简便，缺点是重复性差、非特异性结合率高。,第90页/共119页,聚乙二醇(PEG)法：PEG浓度为7-9%时能使抗原-抗体复,活性炭吸附法：用包被了葡聚糖衣的活性炭吸附抗原，然后离心收集。盐析法：用中性盐如硫酸铵沉淀抗原-抗体复合物，然后离心收集。微孔滤膜法：用微孔滤膜吸附抗原-抗体复合物。,第91页/共119页,活性炭吸附法：用包被了葡聚糖衣的活性炭吸附抗原，然后离心收集,固相法：抗体与固体材料连接，生成的抗原-抗体复合物亦与固体材料连接。凝胶过滤法：利用葡聚糖的分子筛效应。双抗体-PEG法：将两种方法组合，沉淀抗原-抗体复合物。,第92页/共119页,固相法：抗体与固体材料连接，生成的抗原-抗体复合物亦与固体材,磁化活性炭吸附法：将活性炭和氧化铁混合，加入聚丙烯酰胺交联成胶状颗粒，吸附抗原后，将反应管放在磁铁上，使颗粒沉淀。现在一般采用第二抗体与PEG合用的方法，称为双抗体-PEG法，它结合了两种方法的优点。,第93页/共119页,磁化活性炭吸附法：将活性炭和氧化铁混合，加入聚丙烯酰胺交联成,第8讲 放射免疫分析方法 的建立和鉴定,8.1 方法的建立8.1.1 标记抗原、抗体和待测抗原的用量标记抗原的加入量一般为6000-10000 cpm，抗体的滴度一般用与标记抗原结合率为30-50%时的滴度，待测抗原的含量应在标准曲线范围内，三者的容积为0.3-1.2 mL。,第94页/共119页,第8讲 放射免疫分析方法 的建立和鉴定8.1 方法,8.1.2 反应条件常用的缓冲液有磷酸盐缓冲液、巴比妥缓冲液、Tris-HCl缓冲液、醋酸缓冲液和硼酸缓冲液。温度一般为4或37 ，在4下反应达到平衡所需时间长，但结合率较高；在37下反应达到平衡所需时间短，结合率较低。有的放射免疫分析先在37温育一段时间，再在4下温育。加样均须在4下进行。,第95页/共119页,8.1.2 反应条件第95页/共119页,8.1.3 样品预处理和加样顺序若样品中的待测抗原含量高，可先稀释；可用溶剂萃取待测抗原，然后去除溶剂；可分离纯化。后两种方法必须测定回收率。按加样顺序不同分为平衡法和非平衡法。平衡法：将待测抗原、标记抗原和抗体依次加入、温育。非平衡法：先加待测抗原和抗体、温育一定时间，然后加入标记抗原、温育。,第96页/共119页,8.1.3 样品预处理和加样顺序第96页/共119页,8.1.4 制作标准曲线和计算样品含量计算标准结合率Bs/B0(%)：,cpms为标准抗原 + 标记抗原 + 抗体反应的平均计数率，cpm0为标记抗原 + 抗体反应的平均计数率。,第97页/共119页,8.1.4 制作标准曲线和计算样品含量Bs/B0(%)= c,令b = Bs/B0(%)，b的logit转换,以标准抗原的剂量为横坐标，若以Bs/B0(%)为纵坐标，则标准曲线是“L”形，若以logitb为纵坐标，则标准曲线是一条直线。,第98页/共119页,令b = Bs/B0(%)，b的logit转换logitb,在与标准抗原相同的条件下测得样品 + 标记抗原 + 抗体反应的平均计数率，计算样品的结合率或其logit转换，然后依据标准曲线方程求出样品中的抗原含量。,第99页/共119页,在与标准抗原相同的条件下测得样品 + 标记抗原 + 抗体反应,8.2 方法的鉴定8.2.1 精密度精密度是指结果的重复性，即同一份样品用同一种方法多次测量，若结果的标准误差小，表示重复性好。在同一批测定中取高、中、低不同剂量，每个剂量至少作20个重复，得到的标准误差为批内误差，应小于10%。,第100页/共119页,8.2 方法的鉴定第100页/共119页,8.2.2 准确性准确性是指测量值与真值的符合程度。将样品分二份，一份加入已知量的标准品，测定加入标准品的回收率。平均回收率应为90-110%。,第101页/共119页,8.2.2 准确性回收率(%)= 所加标准品的量 100,8.2.3 健全性待测样品作一系列稀释，将其反应曲线与标准曲线比较。若二者平行，则测定结果与样品实际含量成正比；若不平行，则测定结果存在系统误差。,第102页/共119页,8.2.3 健全性第102页/共119页,8.2.4 灵敏度一般用B0管10个以上，求出结合率的平均值和标准误差。平均值减去两倍标准误差的值，在标准曲线上所对应的浓度为该方法的最小检出量，即该方法的灵敏度。,第103页/共119页,8.2.4 灵敏度第103页/共119页,8.2.5 特异性指抗体与待测抗原的类似抗原的交叉反应程度，前文已作叙述。,第104页/共119页,8.2.5 特异性第104页/共119页,第9讲 进行放射免疫分析时应注意的防护,9.1 放射性污染的危害空气污染和表面污染：外照射；吸入和取食：内照射。125I可以通过无损伤的皮肤进