免疫荧光技术概要课件.ppt

免疫荧光技术,免疫荧光技术,Coons和Coworkers（1941）通过荧光素标记抗体，并借助荧光显微镜观察荧光的发光物质，而建立了该项技术，人们在Coons等的基础上发展完善了这一技术。尤其是近年来，与激光技术、电子计算机、扫描电镜和双光子显微镜等技术结合发展为定量免疫荧光技术；荧光激活细胞分类器（FACS）的应用，激光共聚焦显微镜的问世，使这门技术发展到更高的阶段，开创了免疫荧光技术的新领域。,Coons和Coworkers（194,第一节 免疫荧光技术的原理,第一节 免疫荧光技术的原理,一、免疫荧光技术的基本原理,免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。,一、免疫荧光技术的基本原理 免疫荧光技术是根据抗,用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，以荧光抗体方法较常用。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。免疫荧光细胞化学分直接法、间接法和补体法以及与亲和化学物质标记荧光素的方法，例如：SPA荧光素标记物，生物素与卵白素、植物血凝素荧光素标记物等。,用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知,二、荧光产生的原理,分子都含有电子，电子在不断地运动着。根据量子理论，运动着的电子可以处于一系列不连续的能量状态（即能级）中，电子遵守一定的规则，可以从一个能级向另一个能级跃迁，并伴随着与能级差相对应的特定能量的吸收或释放。一般情况下，电子总是处于能量最低的能级（即基态）。,二、荧光产生的原理 分子都含有电子，电子在不断地运动着,在一定的条件下，电子可吸收能量（如光能，热能，电能，机械能等）跃迁到较高能量级（即激发态），这个过程叫激发。处于激发态的电子是不稳定的，它总是要跃迁回到基态，并将多余的能量释放出来。跃迁方式可能是辐射跃迁，也可能是非辐射跃迁。以非辐射跃迁时，能量大多转化为热能，而以辐射方式跃迁时，能量转化成相应波长的光，这个过程叫发射。,在一定的条件下，电子可吸收能量（如光能，热能，电能，,跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从单重激发态以辐射方式跃迁到基态，由于单重激发态很不稳定，半衰期很短，发射持续的时间也很短，这种发射光叫荧光，其寿命较短。 1838年Brewster首先描述了荧光现象，但荧光一词，是由 Stokesl852年提出的。,跃迁到激发态的电子，大多处于单重激发态。如果电子直接从,第二节 荧 光 素,第二节 荧 光 素,一、荧光色素,能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧光色素，荧光色素必须具备吸收激发光的光能并发射荧光，具有吸收一定频率光能的生色团和能产生一定光亮子的荧光团。吸收的光能转变为荧光的百分数称为“荧光效率”。荧光效率与发射荧光量子的数值成正比。荧光效率（%）= （发射荧光的光量子数） 100 （吸收光的光量子数）,一、荧光色素 能够产生荧光并能作为染料的化合物称为荧,荧光强度（即发射荧光的光量子数）和激发光（吸收的光量子数）的强度有关，激发光越强，荧光也越强。荧光素可以发射红、橙红、黄、绿及蓝色等荧光。光的强弱也与溶解荧光素的pH值、浓度、染色时间和温度等条件有关。,荧光强度（即发射荧光的光量子数）和激发光（吸收的光量子数,荧光素的种类很多，但用于标记抗体的荧光素，不同于一般荧光色素，它必须具备以下条件： 应具有与蛋白质分子形成共价键的化学基因，结合后不易理解，而未结合的色素及其降解产物容易排除。 荧光效率高，与蛋白质结合荧光效率下降不多。,荧光素的种类很多，但用于标记抗体的荧光素，不同于一般,结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响，用于活体内标记，结合应无毒性，附加抗原性小。 与蛋白质结合的方法简便而快速，结合物在一般条件下稳定。 荧光素容易溶解，溶解后不会和其他物质发生化学反应。 荧光颜色与背景组织的自发荧光颜色对比鲜明，能清晰判断结果。,结合抗体蛋白后对抗体的免疫学性质和生化性质无影响，,二、可用于标记抗体的荧光素,用于标记抗体和蛋白质的荧光色素到目前为止有以下几种。,二、可用于标记抗体的荧光素 用于标记抗体和蛋白质的荧光,1. 异硫氰酸荧光黄（fluorescien isothiocyanate，FITC） 纯品为黄色粉末，有两种异构体，易溶于水和乙醇等溶剂，在溶解状态下呈黄绿色荧光。性质稳定，低温干燥下可保存多年，室温下也可保存两年以上。FITC分子质量为390u，最大吸收光谱为490495nm，最大发射光谱为520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光。其中异构体I型荧光效率更高，与蛋白质结合更稳定。其结构式，在碱性条件下，FITC的异硫氰酸基在水溶液中与免疫球蛋白的自由氨基经碳酰胺化而形成硫碳氨基键，结合成为标记荧光免疫球蛋白，即荧光抗体。1个IgG分子上最多能标记1520个FITC分子。,1. 异硫氰酸荧光黄（fluorescien iso,2. 四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethyl rhodamine isothcyanate，TRITC) 是一种紫红色粉末，较稳定，是罗达明(Rhodamine)的衍生物，易溶于水。最大吸收光谱为 550nm，最大发射光谱为620nm，呈橙红色荧光，与FITC发射的黄绿色荧光对比鲜明。经常用于双标记染色，使用较多。,2. 四甲基异硫氰酸罗达明(tetramethyl,3. 四乙基罗达明（tetraethyl rhodamineB200，RB200) RB200是褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，不溶于水。最大吸收光谱为570nm，最大发射光谱为596600nm，呈橙红色荧光。因为RB200比较低廉，广泛用于染色和双标记示踪或染色。RB200不能直接和蛋白质结合，要先经五氯化磷（PCI5）作用下转变成黄酰氯（S02C1），在碱性条件下易与赖氨酸s氨基反应而结合在蛋白分子上。其分子质量为580u。,3. 四乙基罗达明（tetraethyl rhoda,4.其他荧光素 如4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸（SITS）呈蓝色荧光；得克萨斯红（Texas red）、藻红素R（phycoerythrin-R）、花青（cyanine，Cy2，Cy3，Cy5）等。,4.其他荧光素 如4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫,第三节 荧光素标记抗体的方法,第三节 荧光素标记抗体的方法,一、标记方法：,采用FITC标记抗体的方法 常用Marsshall（1958）法标记荧光抗体，也可以根据条件用Chadwick等（1960）标记法或Clark等（1963）的透析标记法。,一、标记方法： 采用FITC标记抗体的方法,1、Marsshall法： （1）材料：抗体球蛋白溶液、0.5molLpH9.0的碳酸盐缓冲液、无菌生理盐水、异硫氰酸荧光素、1硫柳汞水溶液、三角烧瓶（2550m1）、冰及冰槽（或1000ml烧杯）、电磁搅拌器、灭菌吸管、透析袋、玻棒、棉线及烧杯（500m1）、pH7.2或8.0的0.01molLPBS等。,1、Marsshall法：,荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白加0.01mg荧光色素，用天平准确称取所需的异硫氰酸荧光素粉末。 结合（或标记）：边搅拌边将称取的荧光色素渐渐加入球蛋白溶液中，避免将荧光素粘于三角烧瓶或搅拌玻棒上（大约在510min内加完），加完后，继续搅拌12h左右。结合期间应保持蛋白溶液与4左右。结合完毕后，将标记的球蛋白溶液离心（2 500rmin）20min，除去其中少量的沉淀物。,荧光素的准备：根据欲标记的蛋白质总量，按每毫克蛋白,透析：装入透析袋中再置于烧杯中用 pH8.0的缓冲盐水透析（04）过夜。 过柱：取透析过夜的标记物，通过葡聚糖凝胶G-25（SephadexG-25）或G-50柱，分离游离荧光素，收集标记的荧光抗体进行鉴定。洗脱液：0.01molL磷酸盐缓冲液（pH7.2）；过滤量：12ml标记全球蛋白液（过滤前未透析）；收集量：20ml（解析1.7倍）。,透析：装入透析袋中再置于烧杯中用 pH8.0的缓,分别以1mgFITC溶于2份lml 0.5molL。碳酸盐缓冲液（分别为pH9.5和 pH9.0），于2下搅拌将其各加入100mg家兔IgG生理盐水溶液中，搅匀后立即将每份分为两半。一半保留于2下，另一半置25下。间隔一定时间后各取出0.5ml通过Sephadex G-25去游离FITC，由此计算出 5mg家兔IgG结合的FITC量。,分别以1mgFITC溶于2份lml 0.5molL。碳,2、改良法 （1）试剂配制： 0.01molLpH7.2的PBS配法：NaCl 18g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO4+0.2g溶于2000ml蒸馏水中，校定pH值至9.0。 0.5molLpH9.0碳酸盐缓冲液配法：取0.5molLNa2CO3（5.3）10ml加入0.5molL NaHCO3（4.2）90ml，混合后，校定pH值至9.0。 3重碳酸钠水溶液配法：称1.5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水即成。,2、改良法,（1）试剂配制： 0.01molLpH7.2的PBS配法：NaCl 18g、Na2HPO4 1.15g、KH2PO4+0.2g溶于2000ml蒸馏水中，校定pH值至9.0。 0.5molLpH9.0碳酸盐缓冲液配法：取0.5molLNa2CO3（5.3）10ml加入0.5molL NaHCO3（4.2）90ml，混合后，校定pH值至9.0。 3重碳酸钠水溶液配法：称1.5g无水碳酸钠充分溶解于50ml灭菌蒸馏水即成。,（1）试剂配制：,藻红蛋白及标记方法,藻红蛋白或称藻胆色素蛋白，他存在被称为藻红的多聚微粒中，位于叶绿素的反应中心，在自然结构中，藻红蛋白吸收光能，吸收后转化成能量，供其发育、生长。当藻红蛋白被分离和纯化后，其蛋白质变得具有很强的荧光，能吸收不同波长的光，发出亮红色的荧光，此时不再接受任何外来的光，也不能转移光能。,藻红蛋白及标记方法 藻红蛋白或称藻胆色,藻红蛋白利用共价键结合的形式与免疫球蛋白结合，形成稳定的复合物。应用其复合物进行免疫荧光组化染色，进行定量和定性分析；也可以应用藻红蛋白抗体结合物进行免疫荧光的双重或多重染色。尤其是藻红蛋白的亚型可以发射不同波长的荧光，例如 PE的发射波长为520570nm，吸收光谱为490510nm，正好与FITC处于同一的吸收和发射波长上，利用这一特点进行双重标记，在荧光显微镜下，可同时观察到代表2种抗原成分的不同颜色（亮绿色和橘红色），大大简化了免疫荧光的双标。当然还可以和其他荧光素，胶体金结合进行免疫荧光或流式仪的三重以上标记。,藻红蛋白利用共价键结合的形式与免疫球蛋白结合，形成稳,标记方法如下： 1. 巯基化藻红蛋白（phycoerthrin，PE）的制备 6001的15.5mgm1盐酸巯醇亚胺 （iminothiolane hydrochloride）加到1.2ml的 3.6mgm1的PE中，和1.2ml PB（pH6.8）混合，装入透析袋置人50mmolL pH6.8 PB中透析，4过夜，再换用pH7.5 PB透析6h。每个PE分子中可结合8个巯基。,标记方法如下：,2. PE-IgG制备 异双功能试剂SPDPN-succinimdyl 3-（2-pyridyldlthio）propi-nate 30g（1.1mgm1）的乙醇溶液，加入700ml的4.2mgml lgG PB溶液（50molLpH7.5），在室温中反应2.5h。再加入巯基化PE400ml（1.7mgm1）加到500l反应混合液中，室温反应12h，加入100ml的50mmolL碘乙酸封闭残余巯基，用PB透析4过夜。加入0.01NaN3分装，4保存半年。,2. PE-IgG制备 异双功能试剂SPDPN,3.PE-标记蛋白A方法 取4.08mgPE溶于0.1molLpH7.4PB(含0.1molLNacl)lml中，溶解后，取出0.5ml，再加入10ml SPDP无水甲醇液(2.6mgml)，SPDP蛋白摩尔值为10，22反应5min，过SephadexG50(117cm)，用100mmolL pH7.4 PBS(含 0.1molL NaCl)平衡和洗脱。,3.PE-标记蛋白A方法,0.5ml蛋白(2mgm1)100mmolL PBS(含有100mmolL NaCl pH7.4)，加入2.6ml SPDP甲醇液，SPDP蛋白9.5，22 40min，加入25mmolL二硫苏糖醇(DTT) pH7.4缓冲液，2225min，同上过sephadex G25，收集蛋白A峰。 取0.77mgm1的PE和0.27mgml蛋白A等量混合，22反应6h，混合物4保存备用，以上两种PE标记制品，可最后溶于0.01molL pH7.4PB(含有0.1molLECTA、lmolL碘乙胺、1BAS和0.1NaN3)，05保存。,0.5ml蛋白(2mgm1)100mmolL,荧光素的种类不同，标记方法也有所不同，但所有要求的条件和步骤大致相同.影响标记的因素有温度、pH及反应液中荧光素和免疫球蛋白的比例。温度低标记时间长，温度高标记时间短。在04时，FITC标记抗体搅拌612h，在79时搅拌4h为宜。pH以9.09.5最适于免疫球蛋白的标记，一方面异硫氰酸荧光素在弱碱性条件下易于溶解，另一方面，在弱碱性环境下免疫球蛋白的羧基容易暴露，便于结合。pH偏低标记慢，pH偏高(大于pHl0)抗体易变性。,荧光素的种类不同，标记方法也有所不同，但所有要求的条件,二、荧光抗体的质量控制,对制备的荧光抗体必须进行质量鉴定，主要进行特异性和敏感性两个方面的鉴定。,二、荧光抗体的质量控制 对制备的荧光抗体必须进行质量鉴定,(一)染色特异性和敏感性的测定方法 1.特异性染色效价测定 直接染色效价以倍比稀释荧光抗体溶液如1:2，1:4，1:8与相应抗原标本作一系列染色，荧光强度在“+”的最大稀释度，为其染色滴度(效价)或单位。实际染色应用时，可取低 1个或2个稀释度(即24个单位)，如染色效价为1:64，实际应用时可取1:32或1:16。间接染色效价可按核抗体荧光染色法步骤，先用不同稀释度的荧光抗体染色，结果以抗核抗体荧光强度“+”为标准，染色用效价和直接法相同。,(一)染色特异性和敏感性的测定方法,2.非特异性染色测定 根据荧光抗体的用途不同，可用相类似的抗原切片或涂片，倍比稀释荧光抗体，按常规染色，如果在标本上出现的非特异染色应显著低于特异染色滴度，否则应采取消除非特异性染色的方法处理荧光抗体。,2.非特异性染色测定 根据荧光抗体的用途不同，可,3.吸收试验 在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室温中搅拌2h后，移人4中过夜，3 000rmin离心30min，收集上清液，再用相应抗原阳性标本染色，结果应不出现明显阳性荧光。,3.吸收试验 在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室,(二)FP值的测定方法 F(荧光素)和P(抗体蛋白)的克分子比值反映荧光抗体的特异性染色质量，一般要求FP的克分子比值为12。过高时，非特异性染色增强；过低时，荧光很弱，降低敏感性。,免疫荧光技术概要课件,1.蛋白质定量 测定荧光抗体的蛋白质毫克毫升量。 2.结合荧光素定量 先制作荧光素定量标准曲线，即准确称取FITC 1mg，溶于l0ml 0.5mmolL pH9.0的碳酸盐缓冲液中，再用0.01mmolL pH7.2 PBS稀释到l00ml，此时荧光素含量为l0Mgml，再倍比稀释9个不同浓度的溶液，用分光光度计在490nm波长测定光密度值(OD)，以光密度为纵坐标，荧光素含量为横坐标，作标准函数图。荧光素与蛋白质结合后，其吸收光谱峰值向长波方向位移5nm，FITC和蛋白质结合后由490nm变为493495nm，RB200和蛋白质结合后变为595nm。,1.蛋白质定量 测定荧光抗体的蛋白质毫克毫升量,FP比值的计算：可按以下公式计算。F/P克分子比值=,FP比值的计算：可按以下公式计算。,15g、KH2PO4+0.以0-4或-20低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性。吸收试验 在荧光抗体中加入过量相应抗原，于室温中搅拌2h后，移人4中过夜，3 000rmin离心30min，收集上清液，再用相应抗原阳性标本染色，结果应不出现明显阳性荧光。三液混合后，不断搅拌6h，7200g离心1h，吸取上清4保存备用。(7)组织或细胞内某些物质的自发荧光。6mgml)，SPDP蛋白摩尔值为10，22反应5min，过SephadexG50(117cm)，用100mmolL pH7.标本自发荧光对照 标本只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察应呈阴性荧光(无与特异性荧光相似的荧光)。尤其是藻红蛋白的亚型可以发射不同波长的荧光，例如 PE的发射波长为520570nm，吸收光谱为490510nm，正好与FITC处于同一的吸收和发射波长上，利用这一特点进行双重标记，在荧光显微镜下，可同时观察到代表2种抗原成分的不同颜色（亮绿色和橘红色），大大简化了免疫荧光的双标。组织的非特异性染色的机制很复杂，其产生的原因主要可分以下几点：1molL NaCl)平衡和洗脱。2mm之间，太厚的玻片光吸收多，也不能使激发光在标本上聚焦。,式中160 000为抗体蛋白质的分子量，390为FITC的分子量。蛋白质从克换算为毫克需再乘以103，而荧光素从克换算为微克需要再乘以106。,15g、KH2PO4+0. 式中160 000为,测定RB200荧光抗体的克分子比值公式如下：TMRITC荧光抗体克分子量比值=A515nmOD A280nmOD 或=重量比（g/g) 160000 580,测定RB200荧光抗体的克分子比值公式如下：,即先用276nm波长测得蛋白质的OD值，再用493nm波长测得FITCOD值，将这两个OD连成一直线，直线与纵线交叉处，即可查处标记抗体的下数值：FITCgml，FP的gml，FP的克分子比值，蛋白mgml等。,即先用276nm波长测得蛋白质的OD值，再用493nm波,(三)荧光抗体的保存,以0-4或-20低温保存，防止抗体活性降低和蛋白变性。最好加入浓度为：500010000的硫柳汞或者1:10005000的叠氮钠防腐，小量分装如0.1lml，真空干燥后更易长期保存。,(三)荧光抗体的保存 以0-4或-20低温保存，防,第四节 免疫荧光染色方法,第四节 免疫荧光染色方法,一、直接法,这是最简便、快速的方法，用已知特异性抗体与荧光素结合，制成特异性荧光抗体。直接用于细胞或组织抗原的检查，此法特异性高，其缺点是一种荧光抗体只能检查一种抗原，敏感性较差，但非常实用，应用也广泛，例如：穿刺IgA、IgM、IgG的检测，其效果要优于免疫酶标，还有转基因的示踪蛋白，病原体等的检测。可用于石蜡切片，冷冻切片和细胞涂片等检测。,一、直接法 这是最简便、快速的方法，用已知特异性抗体,其操作流程如下： (1)染色：切片经固定后，滴加经稀释至染色效价如1：8或1：16的荧光抗体(如兔抗-球蛋白荧光抗体或兔抗人IgG或IgA荧光抗体等)，在室温或37染色30min，切片置人能保持潮湿的染色盒内，防止干燥。,其操作流程如下：,(2)洗片：倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.4或pH7.2 PBS中洗2次，电磁振动，每次5min，再用蒸馏水洗1min，除去盐结晶。 (3)用50缓冲(0.5molL pH9.09.5碳酸盐缓冲液)甘油封固、镜检。 (4)对照染色：正常兔荧光血清染色。,(2)洗片：倾去存留的荧光抗体，将切片浸入pH7.,如上法处理切片，结果应为阳性。染色抑制试验(一步法)：将荧光抗体和未标记的抗体球蛋白或血清(相同)等量混合，如上法处理已知阳性抗原的切片。结果应为阴性。为证明此种染色抑制不是由于荧光抗体被稀释所致，可用盐水代替未标记抗血清，染色结果应为阳性。此法结果较稳定。,如上法处理切片，结果应为阳性。染色抑制试验(一步法)：将,二、间接珐,此法是直接法的重要改进，先用特异性 (对细胞或组织内抗原)抗体(或称第一抗体)与细胞标本反应，随后用缓冲盐水洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体(也称第二抗体)与结合在抗原上的抗体(是第二抗体的抗原)结合，形成抗原一抗体一荧光抗体的复合物。,二、间接珐 此法是直接法的重要改进，先用特异性 (对细,由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。如细胞抗原上每个分子结合35个分子抗体，当此抗体作为抗原时又可结合35个分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强34倍。此法除灵敏性高外，它只需要制备一种种属间接荧光抗体，可以适用于多种第一抗体的标记显示，这是现在最广泛应用的技术。,由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，,(1)标本：肾穿刺标本冷冻切片，厚 5m。 (2)试剂 第一抗体：羊抗人IgG抗血清(1:40)、羊抗人IgA抗血清(1:30)、羊抗人 IgM抗血清(1:30)，购自上海生物制品研究所； 兔抗羊IgMFITC(1:30)，本实验室自制； 0.01molLpH7.4的PBS； 缓冲甘油(配法同直接法)。,(1)标本：肾穿刺标本冷冻切片，厚 5m,(3)染色步骤 肾穿刺标本冷冻切片室温下丙酮固定 10s，PBS洗3次，每次5s； 置切片于湿盒内分别滴加羊抗人 IgG、羊抗人IgA及羊抗人IgM抗血清，37 30s； 以PBS洗切片3次，每次5s； 滴加兔抗羊IgG-FITC，37，30s； 以PBS洗切片3次，每次5s； 缓冲甘油封片，荧光显微镜下观察结果。 (4)结果：肾小球特异性荧光染色呈翠绿色。,(3)染色步骤,三、补体法,(一)直接检查组织内免疫复合物方法 用抗补体C3等荧光抗体直接作用组织切片，与其中结合在抗原抗体复合物上的补体反应，而形成抗原一抗体一补体复合物与抗补体荧光抗体复合物，在荧光显微镜下呈现阳性荧光的部位就是免疫复合物上补体存在处，此法常用于肾穿刺组织活检诊断等。,三、补体法 (一)直接检查组织内免疫复合物方法,(二)间接检查组织内抗原方法 常将新鲜补体与第一抗体混合同时加在抗原标本切片上，经37孵育后，如发生抗原抗体反应，补体就结合在次复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原一抗体一荧光抗体的复合物，此法优点是只需一种荧光抗体可适用于各种不同种属来源的第一抗体的检查。,(二)间接检查组织内抗原方法,1.材料和试剂 免疫血清60灭活20min，用Kolmers盐水作2倍稀释成l:2，1:4，1:8。补体用1:10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价如为1:32则免疫血清应用1:8稀释。,1.材料和试剂,补体用新鲜豚鼠血清一般作1:10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2U的比例，用Kolmers盐水稀释备用。 Kolmers盐水配法：即在pH7.4的0.1mol LPBS中溶解0.01MgS04。 抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1:4，补体为2U的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1:4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。,补体用新鲜豚鼠血清一般作1:10稀释或按补体结合反,2.方法步骤 涂片或冷冻切片固定和PBS洗1次，3min，吹至组织表面无水分。 吸取经适当稀释的免疫血清及补体的等量混合液(此时的免疫血清及补体又都各稀释1倍)低于切片上，37作用30min，置于保持一定湿度的染色盒内。,2.方法步骤,用缓冲盐水洗2次，搅拌或振动，每次 5min，吸干标本周围水液。 滴加经过适当稀释的抗补体荧光抗体，37反应30min水洗同。 蒸馏水洗lmin，缓冲甘油封固。,用缓冲盐水洗2次，搅拌或振动，每次 5min，吸干,3.对照染色 按间接方法对照进行。 抗原对照。阳性对照应为+。 抗血清对照。用正常兔血清代替免疫血清结果阴性。 灭活补体对照。将补体经56 30min处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等混合后，进行补体法染色结果阴性。,3.对照染色 按间接方法对照进行。,本法所用荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。,本法所用荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一,四、双重免疫荧光细胞化学标记方法,在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色，一般均采用直接法，将两种荧光抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法用TMRITC或RB200标记或PE标记，发红色荧光，可以明确显示两种抗原的定位。,四、双重免疫荧光细胞化学标记方法 在同一细胞组织标本,在同一标本上有两种抗原需要同时显示(如A抗原和B抗原)，A抗原的抗体用FITC标记，B抗原的抗体用罗达明标记，可采用以下染色方法： 1.一步法双染色方法 先将两种标记抗体按适当比例混合(A+B)，按直接方法进行染色。 2.二步法双染色方法 先用RB200标记的B抗体染色，不必洗去，再用FITC标记的A抗体染色，按间接法进行。 结果：A抗原阳性荧光呈现绿色，B抗原阳性呈现橘红色荧光。,在同一标本上有两种抗原需要同时显示(如A抗原和B抗,五、对照试验 为了保证免疫荧光细胞化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验时进行以下对照试验： (一)直接方法(需设对照试验) 1.标本自发荧光对照 标本只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察应呈阴性荧光(无与特异性荧光相似的荧光)。,五、对照试验,2.抑制试验 可分为二步法和一步方法。 二步抑制方法：标本先加未标记的特异性抗体，水洗后再加标记荧光抗体，结果应呈阴性或明显减弱的荧光。 一步抑制方法：先将荧光抗体与未标记特异性抗体等量混合，再加在标本上染色，结果应为阴性，此法效果较二步法好，并且简便。 3.阳性对照 将已知阳性标本用直接法免疫荧光细胞化学染色，结果应呈阳性荧光。,2.抑制试验 可分为二步法和一步方法。,(二)间接方法 1.自发荧光对照 同上。 2.荧光抗体对照 标本只加间接荧光抗体染色，结果阴性。 3.抑制试验 同上。 4.阳性对照 同上。 结果：如对照l和2无荧光或弱荧光，3待检查标本呈强荧光即为特异性阳性荧光。,(二)间接方法,(三)补体方法 1.自发荧光对照。 2.荧光抗体对照。 3.抑制试验。 乙补体对照 取新鲜豚鼠血清1:10稀释先作用标本，洗后再用抗补体荧光抗体染色，结果阴性。 5.抑制试验 标本加灭活的第一抗体，再加1:10稀释的新鲜豚鼠血清孵育后，再加未标记的抗补体血清与抗补体荧光抗体等量混合稀释液，结果应为阴性。 6.阳性对照。 15结果阴性，6和待检标本阳性时，则为特异性荧光。,(三)补体方法,第五节 非特异性染色 的消除方法,第五节 非特异性染色 的消除方法,一、非特异性染色的重要因素,组织的非特异性染色的机制很复杂，其产生的原因主要可分以下几点： (1)一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去引起非特异性染色。 (2)抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分非特异性结合。,一、非特异性染色的重要因素 组织的非特异性染色的机制,第五节 非特异性染色 的消除方法常用Marsshall（1958）法标记荧光抗体，也可以根据条件用Chadwick等（1960）标记法或Clark等（1963）的透析标记法。荧光显微镜摄影技术对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很宜减弱褪色，要及时摄影记录结果。0的碳酸盐缓冲液中，再用0.但这些仪器记录的结果，也必须结合主观的判断。(二)间接检查组织内抗原方法PE-IgG制备 异双功能试剂SPDPN-succinimdyl 3-（2-pyridyldlthio）propi-nate 30g（1.跃迁方式可能是辐射跃迁，也可能是非辐射跃迁。四乙基罗达明（tetraethyl rhodamineB200，RB200) RB200是褐红色粉末状，溶于乙醇和丙酮，不溶于水。15g、KH2PO4+0.3重碳酸钠水溶液配法：称1.2的PBS配法：NaCl 18g、Na2HPO4 1.一步法双染色方法 先将两种标记抗体按适当比例混合(A+B)，按直接方法进行染色。6mgm1的PE中，和1.1lml，真空干燥后更易长期保存。荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征，二是具有荧光的颜色和亮度，在判断结果时，必须将两者结合起来综合判断。涂片或冷冻切片固定和PBS洗1次，3min，吹至组织表面无水分。(3)染色步骤,(3)除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原(如Forssman抗原)，可与组织中特异性抗原以外的相应抗体结合。 (4)从组织中难以提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。 (5)抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。,第五节 非特异性染色 的消除方法 (3)除,(6)荧光素不纯，标本固定不当等。 (7)组织或细胞内某些物质的自发荧光。 (8)染色时间过长，温度过高，冲洗不够甚至在染色过程中标本干燥等原因，都会引起非特异性荧光染色。,(6)荧光素不纯，标本固定不当等。,二、消除非特异性染色的方法,应根据产生非特异性荧光的因素，采取相应的处理方法，常用有以下几种： l.衬染法 最常用0.10.05伊文斯蓝在荧光抗体染色后再染25s或用0.05伊文斯蓝稀释抗体来抑制自发荧光。 将背景的细胞和组织染成红色，与黄绿色荧光形成鲜明对比。,二、消除非特异性染色的方法 应根据产生非特异性荧光的,2.荧光抗体 在染色前用SephadexG25或G-50(用微柱型)以除去游离或聚合的荧光素及未标记的蛋白。 3.胰蛋白酶消化 经常用0.10.05胰蛋白酶消化，对于石蜡切片不仅可以提高阳性率和阳性强度，而且可抑制非特异性免疫荧光染色。消化时间要根据组织类型，固定液的不同而选择消化时间，如肾穿标本0.05胰蛋白酶消化2h最佳，而肝癌切片且消化2030min最佳。,2.荧光抗体 在染色前用SephadexG2,4.吸收 用小鼠肝粉或组织干粉吸收荧光抗体之后，再将荧光抗体作适当高倍稀释，常用于消除组织中非特异性荧光染色效果较好。 5.用正常(非免疫)血清 如110牛或羊血清先处理切片之后，再染色有明显地清除自发荧光和非特异性荧光染色的效果。 6.双重标记 用罗达明类荧光素标记抗体与用FITC标记的荧光抗体相混合进行双重标记染色可消除背景FITC的非特异性染色，同时可证实两种抗原的成分。,4.吸收 用小鼠肝粉或组织干粉吸收荧光抗体之后,7.提高抗体和标记荧光抗体的质量可采用高特异性和高效价的免疫血清。为了克服交叉免疫反应，应将抗原高度纯化，作为免疫球蛋白的Fab或F(ab)：段标记荧光素可避免Fc段交叉染色。制备人类5种免疫球蛋白的重链抗体和、轻链抗体尤其是使用单克隆抗体以保证抗体的高特异性。FP值一定保证12之间。另外可采用亲和层析法来纯化抗体。也可用DEAE纤维素层析法来纯化标记抗体。,7.提高抗体和标记荧光抗体的质量可采用高特异性和高,但经DEAE处理后，其抗体量一般约损失50。因此某些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定处理法，具体方法如下：先测定荧光抗体之特异性染色与非特异性染色效价，若两者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法与染色效价测定方法相同。,但经DEAE处理后，其抗体量一般约损失50。因此某,肝粉的制作方法如下： 将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗23次，除去血液，剥掉表面的结缔组织或脂肪。 剪碎，用生理盐水反复洗涤到无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。,肝粉的制作方法如下：,将肝匀浆装入离心管内(13左右)，交换的用23倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各3次，置上清无血色止；每次完毕先用 2 000rmin离心沉淀15min后，再除去上清液。 最后用丙酮洗涤肝匀浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37烤干(过夜)。 在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛过后，分装，密封，低温干燥保存。,将肝匀浆装入离心管内(13左右)，交换的用23,第六节 使用荧光显微镜的 注意事项,1.严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。 2.应在暗室中进行检查，进入暗室后接通高压稳压器电源，开启35min后进行激发高压汞灯，当看到高压汞灯完全亮后，停止激发，再开始观察标本。,第六节 使用荧光显微镜的 注意事项,3.防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼镜。 4.检查时间每次以1h为宜，超过 90min高压汞灯发光强度逐渐下降，荧光减弱，标本经激发15min后，荧光亦明显减弱。 5.荧光显微镜的激发装置及高压汞灯寿命有限，标本应集中检查，节省时间。 6.标本染色后应立即观察，因存放时间太久，荧光会逐渐猝灭。可将染好色的标本用黑纸包好，存放在聚乙烯塑料袋中，4保存，可延缓荧光的猝灭时间。,3.防止紫外线对眼睛的损害，在调整光源时应戴上防护眼,7.荧光亮度的判断标准：一般为四级，即“”，无或可见微弱自发荧光。“+”，仅能见明确可见的荧光。“+”，可见有明亮的荧光。“+”，可见耀眼的荧光。 8.荧光显微镜的维护与保养 (1)镜头的清洁：镜头上粘的灰尘，应用柔软的刷子轻轻刷掉，在有指纹和油污的地方宜用柔软干净的脱脂棉、纱布或擦镜纸蘸上无水甲醇或乙醇轻轻擦拭，对物镜表面上的油渍只能用汽油擦拭。,7.荧光亮度的判断标准：一般为四级，即“”，无,(2)涂漆部分、塑料部分的清洁：涂漆部分、塑料部分用中性去污剂擦拭，避免使用有机溶剂。 9.荧光显微镜标本制作要求 (1)载玻片：载玻片厚度应在0.8 1.2mm之间，太厚的玻片光吸收多，也不能使激发光在标本上聚焦。载玻片必须光洁，厚度均匀，无明显自发荧光。有时需用石英玻璃载玻片。,(2)涂漆部分、塑料部分的清洁：涂漆部分、塑料部分,(2)盖玻片：盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为了加强激发光，也可用干涉盖玻片，这是一种特制的表面镀有若干层对不同波长的光起不同干涉作用的物质(如氟化镁)的盖玻片，它可以使荧光顺利通过，而反射激发光，这种反射的激发光又可激发标本。 (3)标本：组织切片或其他标本不能太厚，如太厚激发光大部消耗在标本下部，而物镜直接观察到的上部不能充分激发。另外，细胞重叠或杂质掩盖，背景非特异性染色引起的荧光影响判断。,(2)盖玻片：盖玻片厚度在0.17mm左右，光洁。为,(4)封裱剂：封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无色透明，荧光的亮度在pH8.5 9.5时较亮，不宜很快褪去。所以，常用甘油和0.5molL pH9.09.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液作封裱剂。如果用抗褪色剂封裱荧光染色标本更有利于显微摄影。配方是将P次苯基二胺二氢氯100mg加入PBS 10ml中，调pH值9.09.5，再加人甘油 90ml混匀，在室温放置过夜，待其中小气泡完全消失即可使用。,(4)封裱剂：封裱剂常用甘油，必须无自发荧光，无,(5)镜油：一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时，必须使用镜油，最好使用特制的无荧光镜油，也可用甘油代替，液体石蜡也可用，只是折光率较低，对图像质量略有影响。,(5)镜油：一般暗视野荧光显微镜和用油镜观察标本时,10.荧光图像的记录方法 荧光显微镜所看到的荧光图像，一是具有形态学特征