免疫细胞的分离技术课件.ppt
免疫细胞的分离,免疫细胞的分离技术,2022/12/29,1,免疫细胞的分离免疫细胞的分离技术2022/10/21,免疫细胞,1、概念 直接参与免疫应答及与免疫应答相关的所有细胞。2、分类 单核吞噬细胞系统:单核细胞 / 巨噬细胞 树突状细胞(DCs) 淋巴细胞系统:T 淋巴细胞 (Th / Tc) B 淋巴细胞 NK 细胞 粒细胞系统: 中性粒细胞 噬酸性粒细胞 噬碱性粒细胞,免疫细胞的分离技术,2022/12/29,2,免疫细胞1、概念免疫细胞的分离技术2022/10/22,免疫细胞的分离,人外周血单个核细胞的分离淋巴细胞的分离免疫细胞亚群的分离,免疫细胞的分离技术,2022/12/29,3,免疫细胞的分离人外周血单个核细胞的分离免疫细胞的分离技术20,细胞分离原理,细胞的大小和比重细胞表面标志细胞黏附于各种物质表面的特性,免疫细胞的分离技术,2022/12/29,4,细胞分离原理细胞的大小和比重免疫细胞的分离技术2022/10,一、人外周血单个核细胞的分离 Ficoll分层离心法,人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC): Monocyte、Lymphocyte。原理:血液中各细胞成分的比重不同,经离心沉淀,即可在分层液与血浆之间获得比较纯的单个核细胞,其中淋巴细胞占90%以上。,免疫细胞的分离技术,2022/12/29,5,一、人外周血单个核细胞的分离,不同细胞密度不同 红细胞和多形核白细胞 1.092 单个核细胞 1.070 分层液 1.077,免疫细胞的分离技术,2022/12/29,6,不同细胞密度不同 红细胞和多形核白细胞 1.092,一、人外周血单个核细胞的分离 Ficoll分层离心法Ficoll分层液:蔗糖聚合物+泛影葡胺,密度1.077+0.001g/L。,免疫细胞的分离技术,2022/12/29,7,一、人外周血单个核细胞的分离,二、淋巴细胞的分离,尼龙棉柱法E花环分离法补体细胞毒法免疫荧光法,免疫细胞的分离技术,2022/12/29,8,二、淋巴细胞的分离尼龙棉柱法免疫细胞的分离技术2022/1,二、淋巴细胞的分离 尼龙棉柱法,原理:B细胞和单核细胞具有易黏附的特性,将淋巴细胞悬液加至尼龙纤维柱上,37 作用12h后,洗脱的为非黏附性的T细胞。,PBMC,尼龙纤维棉柱,B细胞单核细胞,T细胞,免疫细胞的分离技术,2022/12/29,9,二、淋巴细胞的分离,二、淋巴细胞的分离 E花环分离法(纯化T细胞),原理成熟T细胞表面有绵羊红细胞受体(E受体,CD2分子),可和SRBC形成E花环,B细胞则无。 E花环比重大,沉淀,经分离液分离来。 E花环周围的绵羊RBC可 用低渗法除去。,免疫细胞的分离技术,二、淋巴细胞的分离,三、免疫细胞亚群的分离,免疫磁珠分离法流式细胞术,免疫细胞的分离技术,2022/12/29,11,三、免疫细胞亚群的分离免疫磁珠分离法免疫细胞的分离技术202,三、免疫细胞亚群的分离 免疫磁珠分离法,原理:将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠 (Immunomagnetic bead,IMB),免疫磁珠直接或者间接偶联在抗体上,从而与细胞相连, 在高强度、梯度磁场中达到细胞磁性分离的目的。,2022/12/29,12,免疫细胞的分离,免疫细胞的分离技术,三、免疫细胞亚群的分离,三、免疫细胞亚群的分离 免疫磁珠分离法,1. 直接法: 抗细胞表面分子抗体+磁性微球 免疫磁珠+细胞悬液 与免疫磁珠结合的细胞2. 间接法: 第二抗体+磁性微粒 第一抗体+细胞 特定细胞,免疫细胞的分离技术,三、免疫细胞亚群的分离,免疫细胞的分离技术,免疫细胞的分离技术,免疫细胞的分离技术,免疫细胞的分离技术,免疫磁珠法分选装置,免疫细胞的分离技术,免疫磁珠法分选装置免疫细胞的分离技术,三、免疫细胞亚群的分离 流式细胞术(Flow Cytometry,FCM),FCM将免疫荧光技术应用于流式细胞仪,对单个细胞的表面标志(抗原或受体)进行快速、精确的分析和自动检测,并将不同类型的细胞分选收集。原理:细胞经荧光染色后,通过高速流动系统,细胞排成单行,逐个流经检测区。当细胞从流动室喷嘴处流出时,超声震动液流,使液流段裂成一连串的均匀小滴,每个小滴内最多含一个细胞,细胞经激光束照射产生荧光和散射光,由光电倍增管接收,转换成脉冲信号,数据经电脑处理,分辨细胞类型。,免疫细胞的分离技术,2022/12/29,17,三、免疫细胞亚群的分离 流式细胞术(,流式细胞仪工作原理,免疫细胞的分离技术,2022/12/29,18,流式细胞仪工作原理免疫细胞的分离技术2022/10/218,流式细胞仪,免疫细胞的分离技术,2022/12/29,19,流式细胞仪免疫细胞的分离技术2022/10/219,免疫细胞的分离,人外周血单个核细胞的分离Ficoll分层离 心法淋巴细胞的分离尼龙棉柱法、E花环分离法、补体细胞毒法免疫荧光法免疫细胞亚群的分离免疫磁珠分离法、流式细胞术,免疫细胞的分离技术,免疫细胞的分离人外周血单个核细胞的分离Ficoll分层离,谢谢!,免疫细胞的分离技术,2022/12/29,21,谢谢!免疫细胞的分离技术2022/10/221,