免疫组织化学原理及应用12级课件.ppt

免疫组织化学的原理 及应用,孙勤暖,免疫组织化学的原理 及应用,组织学与细胞学、组织化学、生物化学、免疫组织化学组织学、细胞学与组织化学区别： 1、组织、细胞学是研究形态结构与功能的关系 2、组织化学是研究组织细胞内的化学成分及其含量或酶的存在及其活性,组织学与细胞学、组织化学、生物化学、免疫组织化学,组织化学概念: = 细胞化学 是运用物理、化学、免疫学和分子生物学等原理，对组织与细胞化学成分或酶活性进行定性、定位和定量的研究的科学。传统组织化学概念： 是运用物理、化学 免疫学、电镜技术和分子生物学技术的发展免疫组织化学、免疫电镜组织化学、原位杂交技术等,组织化学概念: = 细胞化学,广义组织化学包括： 传统组织化学、 免疫组织化学、 电镜组织化学、 免疫电镜组织化学、 原位杂交组织化学等,广义组织化学包括：,生物化学与组织化学区别：生物化学： 1、运用化学原理分析细胞的组成成分以及这些成分在生命过程中的化学反应。 2、生物化学将组织细胞制成匀浆研究（结构被破坏） 3、生物化学的化学反应在试管内或容器内 4、生物化学的化学反应结果观察不用显微镜 5、产物需要分离、提纯、鉴定。组织化学： 运用化学反应原理在组织细胞内对组织细胞化学成分进行定性、定位和定量的研究。产物多需要显色剂显示。如：利用酶的特性,生物化学与组织化学区别：,一、免疫组织化学技术的基本原理： 免疫组织化学技术是利用抗原与抗体能特异性结合的基本特点，通过显示剂的显示,确定某些抗原或抗体的有无或其存在的位置，来研究某事物的特性。,一、免疫组织化学技术的基本原理：,二、组织化学与免疫组织化学技术的区别 组织化学技术： （HE 特殊染色） 通过应用某些能与组织、细胞化学成分特异性结合的显色试剂，定位的显示组织、细胞的特殊化学成分的一门技术。 优点：既保存原有的形态改变又显示特殊化学成分达到形态、功能与代谢相结合。 （不敏感、特异性差）,二、组织化学与免疫组织化学技术的区别,二、组织化学与免疫组织化学技术的区别 免疫组织化学技术： 将抗原、抗体反应的特异性与组织化学反应的可见性结合在一起，形成了免疫组织化学技术。 优点： 1、形态、功能与代谢相结合（微量） 2、检测的成分更加广泛、敏感、特异性更强,二、组织化学与免疫组织化学技术的区别,三、免疫组织化学技术的发展免疫荧光技术 抗体酶标法 多克隆抗体技术 单克隆抗体技术 ABC法、S-P法等 原位杂交及原位PCR等免疫组化法。,三、免疫组织化学技术的发展,四、免疫组织化学技术的优点1、特异性强2、敏感性高3、定位准确4、形态、功能与代谢相结合,四、免疫组织化学技术的优点,五、 免疫组织化学方法 免疫组织化学Immunohistochemistry Immunocytochemistry1、特异性的抗原和特异性的抗体（结合）2、显色系统显示剂：酶,金属原子, 荧光分子 同位素分子酶底物：DAB(3,3-二胺基联苯胺) AEC(3-氨基-9-乙基卡巴唑) 坚牢蓝，坚牢红.,五、 免疫组织化学方法,（一）直接法:酶标法（一步法） 将酶（HRP）标记在特异抗体上，方法简捷, 需要标记所有抗体 Ag Ab-HRP. 底物-显色剂显色,（一）直接法:酶标法（一步法）,免疫组织化学原理及应用12级课件,（一）直接法:酶标法（一步法） 将酶（HRP）标记在特异抗体上，方法简捷, 需要标记所有抗体.AgAb-HRP,（一）直接法:酶标法（一步法）,（一）直接法:酶标法（一步法） 将酶（HRP）标记在特异抗体上，方法简捷, 需要标记所有抗体.AgAb-HRP AgAb-HRP,（一）直接法:酶标法（一步法）,（一）直接法:酶标法（一步法） 将酶（HRP）标记在特异抗体上，方法简捷, 需要标记所有抗体.AgAb-HRP 底物-显色剂显色 AgAb-HRP,（一）直接法:酶标法（一步法）,（一）直接法:酶标法（一步法） 将酶（HRP）标记在特异抗体上，方法简捷, 需要标记所有抗体.AgAb-HRP 底物-显色剂显色 AgAb-HRP底物-显色剂显色 需要标记所有抗体,（一）直接法:酶标法（一步法）,免疫组织化学原理及应用12级课件,（二）间接法:二步法 将酶（HRP）标记在第二抗体上，. Ag Ab1 Ab2-HRP 底物-显色剂显色 二步法, 应用范围广; 不需标记一抗,只需标记几个种属的二抗即可,（二）间接法:二步法,免疫组织化学原理及应用12级课件,（二）间接法:二步法 将酶（HRP）标记在第二抗体上，.Ag Ab1 Ag-Ab1,（二）间接法:二步法,（二）间接法:二步法 将酶（HRP）标记在第二抗体上，.Ag Ab1 Ab2-HRP Ag-Ab1 -Ab2-HRP,（二）间接法:二步法,（二）间接法:二步法 将酶（HRP）标记在第二抗体上，.Ag Ab1 Ab2-HRP 底物-显色剂显色 Ag-Ab1 -Ab2-HRP -底物-显色剂显色 二步法, 应用范围广; 不需标记一抗,只需标记几个种属的二抗即可,（二）间接法:二步法,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,Envision System 是将二抗 和 HRP 通过一个多聚葡聚糖骨架连接成一个多聚体，多聚体中没有生物素参与，所以它不受内源性生物素的影响，使背景染色降低。特点：敏感、省时、方便、背景低,Envision Sys,免疫组织化学原理及应用12级课件,（三）三步法:将酶（HRP）标记在复合物上 1、PAP法,（三）三步法:,免疫组织化学原理及应用12级课件,（三）三步法:将酶（HRP）标记在复合物上 1、PAP法 2、ABC法,（三）三步法:,免疫组织化学原理及应用12级课件,（三）三步法:将酶（HRP）标记在复合物上 1、PAP法 2、ABC法 3、S-P法,（三）三步法:,链霉菌抗生物素蛋白,链霉菌抗生物素蛋白,抗原,一抗,二抗,生物素,酶,组织,组织,生物素,生物素,卵白素,卵白素,链霉菌抗生物素蛋白,抗原一抗二抗生物素酶组织组织生物素生物素卵白素卵白素链霉菌抗,4、 四步法、五步法 5、多重标记: 在同一组织或细胞上显示两种以上抗原。 SP法 ABC法 48倍 SP法 PAP法 2550倍,4、 四步法、五步法,组织标本的取材固定,一、取材：二、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、 切片、 捞片、烤片、脱蜡、水化三、玻片处理：防脱片胶 APES Poly-L-Lysin,组织标本的取材固定一、取材：,三、防脱片处理步骤（一）载玻片和盖玻片的处理 将载玻片或培养用的小盖片浸泡在重铬酸钾浓硫酸清洁液中24小时，然后流水充分冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍以上，而后置95%乙醇中12小时。取出擦干或烤干，贮放于玻片盒内备用。 盖玻片很薄，以上处理程序必须缩短时间，清洁液浸泡只需2小时，流水冲洗注意勿损伤玻片。,三、防脱片处理步骤,（二）黏附剂的使用1、多聚左旋赖氮酸（poly-l-lysine） 首先配制0.1%多聚左旋赖氮酸浓缩液（配方见附录一），室温下（1826）可保存1年。使用时，将试剂10倍稀释成工作液，浓度为0.01%，28冰箱保存，有效期3个月。 使用方法是将充分洗净和预先干燥的玻片浸泡于稀释后的多聚左旋赖氨酸深液数十秒或提拉十次，沥干，于室温下晾干1224小时或在45以下烤箱内烘干。处理后的玻片避光干燥可长期保存。,（二）黏附剂的使用,2、3-氨丙基-乙氧基甲硅烷（3-amino propyltriethoxy silane, APES） APES必须现用现配。用此方法黏合的玻片应垂直烤片而不能水平烤片，否则，组织片中易出现气泡。 APES的使用方法：用丙酮50倍稀释（APES 1份、丙酮49份混合），将洗净的玻片放入稀释好的APES中，停留2030秒，取出稍停，再入纯丙酮或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。注意用APES防脱片处理的载玻片捞片时组织应一步到位，并尽量减少气泡存在，以免影响染色结果。 注意不要将APES与其他防脱片剂混合使用。,2、3-氨丙基-乙氧基甲硅烷（3-amino propylt,多聚左旋赖氨酸为目前免疫组织化学染色中最常用的防脱片剂，适合于需要酶消化、微波、高温高压的防脱片处理。 如效果不佳，可用双重处理（APES和poly-l-lysine）的切片。 在以上两种方法均无效的情况下，可用如下方法：切片在脱蜡前放在APES 1：50丙酮溶液中浸泡3分钟，晾干后即可进行下一步骤。 对HE染色的切片，可在载玻片上涂抹薄层蛋白甘油。,多聚左旋赖氨酸为目前免疫组织化学染色中最常,组织标本的取材固定,一、取材：二、固定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、 捞片、烤片、脱蜡、水化三、玻片处理：防脱片胶 APES Poly-L-Lysin四、抗原修复化学法：胰蛋白酶、胃胰蛋白酶、链霉蛋白 酶、尿素等物理法：单纯加热、高压加热、微波加热 10分钟 90120秒 10分钟,组织标本的取材固定一、取材：,组 织Ab固定液PH值 3.05.07.08.010抗6.0,免疫组化染色步骤：（一）S-P法染色步骤:1、石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（PH=7.4) 冲洗三次,每次三分钟（33）。2、根据每一种抗体的要求，对组织进行相应 的修复。3、每张切片滴加一滴或50l 3%H2O2 （试剂 A） ，室温下孵育10分钟，以阻断 内源性过氧化物酶。4、 PBS冲洗（33 ）,免疫组化染色步骤：,5、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50l 的非免疫动物血清（试剂 B），室温下孵 育10分钟。6、甩取血清，每张切片滴加一滴或50l第一 抗体，室温下孵育60分钟或4C过夜。7、PBS冲洗（35 ）8、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50l 的第二抗体（试剂 C） ，室温下孵育、 10分钟9、 PBS冲洗（33 ）,5、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50l,10、甩取PBS液，每张切片滴加一滴50l 的链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液 （试剂 D） ，室温下孵育10分钟。11、 PBS冲洗（33 ）12、甩取PBS液，每张切片滴加2滴100l 的DAB或AEC显色液，显微镜下观察 3-10分钟，阳性显色为棕色或红色。 13、自来水冲洗，苏木素复染，0.1%HCL 分化0.1%氨水或PBS冲洗返蓝。 14、如果用DAB显色，则切片通过梯度酒 精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固；,10、甩取PBS液，每张切片滴加一滴50l,如果用AEC显色，则切片不能用酒精脱水，而直接用水性封片剂封片。 如果组织内源性生物素含量高或由于热修复造成内源性生物暴露，可在加3%H2O2之前，用内源性生物素阻断剂加以阻断之后继续免疫组化染色。,如果用AEC显色，则切片不能用酒精脱水，而直接用水性封片剂封,（二）Envision法染色步骤:1、石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS（PH=7.4) 冲洗三次,每次三分钟（33 ）。2、根据每一种抗体的要求，对组织进行相应 的修复。3、每张切片滴加一滴或50l 3%H2O2 室温 下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。4、 PBS冲洗（33 ）,（二）Envision法染色步骤:,5、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50l 第一抗体，室温下孵育60分钟或4C过夜。 6、 PBS冲洗（35 ）7、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50l聚 合物增强剂（试剂 A） ，室温下孵育20分 钟。8、 PBS冲洗（33 ）9、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50l酶 标抗鼠兔聚合物， （试剂 B）室温下孵 育30分钟。 10、PBS冲洗（33 ）,5、甩取PBS液，每张切片滴加一滴或50l,11、甩取PBS液，每张切片滴加2滴100l 的DAB或AEC色液，显微镜下观察 3-10分钟阳性显色为棕色或红色。12、自来水冲洗，苏木素复染，0.1%HCL 分化0.1%氨水或PBS冲洗返蓝。 13、如果用DAB显色，则切片通过梯度酒 精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固； 如果用AEC显色，则切片不能用酒 精脱水，而直接用水性封片剂封片。,11、甩取PBS液，每张切片滴加2滴100l,免疫组化在肿瘤研究中的应用 1、提高病理诊断的准确性，确定肿瘤来源及类型。 通过检测细胞骨架抗原（如CK, Vimetin, Desmin, GFAP等）;细胞功能产物抗原（如激素，免疫球蛋白，NSE, CgA等）;细胞表型标记物，属细胞膜抗原（如LCA, EMA)及各种淋巴细胞表型）和胚胎期抗原（如CEA, AFP).确定肿瘤来源,免疫组化在肿瘤研究中的应用,胰腺:腺泡细胞癌：CK8+、CK18+导管分化癌：CK7+、CK19+,胰腺:,肝脏肿瘤,肝脏肿瘤Hep-par-1AFPCK8CK18CK7CK19,甲状腺及滤泡旁细胞 甲状腺滤泡上皮发生癌 髓样癌 1、Tg + 2、TTF-1 + + 3、 Syn + 4、 Cg-A + 5、Calcitonin + 6、CEA 少+ 多+,甲状腺及滤泡旁细胞,乳头状癌 正常 CK高 + Galectin-3/HBME-1 + CK19 + + Vimitin + S-100 + P53 + MC + CD56 +甲状旁腺 PTH + （甲状旁腺激素） Syn+、 Cg-A+、 CK8+、CK18+、CK19+ Ki-675注意复查,类癌、不典型类癌、小细胞癌TTF-1 +/- +Ki-67 4050 60 80CD57 + + +CD56 + + + SYN + + + CgA + + +NSE + + +,类癌、不典型类癌、小细胞癌,男性生殖系统前列腺疾病一、前列腺的标记物 1、前列腺特异性抗原（PSA） （浆+ ）正常：在雄激素的调节下腺泡上皮、导管上皮分泌 是前列腺来源的肿瘤的敏感、特异的标记物，但不能区分良恶性 （1）前列腺腺泡上皮、导管上皮：顶端胞质+ （2）良性增生上皮：顶端胞质+ （3）前列腺癌（除外分化最差的）均阳性 分化越高，阳性越强 （4）偶尔前列腺以以外组织局灶弱+（多为尿路的腺上皮及其癌；唾液腺、乳腺癌等）尿路上皮,男性生殖系统,2、高分子量角蛋白34 12 （浆+ ） CK5/6 （浆+ ） P63 （核+ ） 能区分良恶性: 增生良性 PIN：基底细胞（浆+ ） 癌：能帮助区分良恶性 -甲基酰基辅酶消旋酶（P504s） （浆+ ） 癌：敏感性、特异性表达约80100 正常（偶尔腔面+）萎缩型腺体结节性增生（ 12% +） 非典型性腺瘤性增生（AAH）（ 17% +） 高级别PIN （ 90% +） 前列腺间质的平滑肌、尿路上皮癌、肾细胞癌、及结肠癌也可+,2、高分子量角蛋白34 12 （浆+ ）,IGCNU 精原细胞瘤胚胎性癌卵黄囊瘤混合型生殖细胞肿瘤间质,3、子宫内膜间质肿瘤 平滑肌肿瘤 SMA + + SMSA + + Desmin - + H-caldesmin - +特异 CD10 + -4、 平滑肌瘤 平滑肌肉瘤ER/PR + +Bcl-2 + +P53 + +MIB-1 + +,3、子宫内膜间质肿瘤 平滑肌肿瘤,1、 胎盘结节 、 滋养叶细胞肿瘤 Ki-67 - /少量+ 14%+/-7%2、 蜕膜组织、滋养叶细胞MEL-CAM - 中间滋养+PLAP - 中间滋养+CK - +VIM + -HCG - +CD10 + -,1、 胎盘结节 、 滋养叶细胞肿瘤,3、 女生 结肠 肝细胞癌 肺小细胞癌 肾癌 CK7 + - - - -CK20 - + - - - 4、间皮 MC + CR+ CK5/6+,3、 女生 结肠 肝细胞癌 肺小细胞癌,（三）胃肠间质瘤(GIST),起源于Cajal细胞的前驱细胞，表达KIT酪氨酸激酶受体（CD117）,似平滑肌样肿瘤的胃肠道间叶性肿瘤。形态多样：平滑肌分化： 梭形细胞，胶原丰富，核旁空泡-似平滑肌瘤；神经分化：核灶性栅栏状排列-似神经鞘瘤； 细胞增大，多角形，上皮样-似上皮样平滑肌 瘤或肉瘤。非平滑肌和神经免疫组化： CD117膜、胞质或核旁阳性，DOG-1+，CD34阳性（70-80%） ，SMA阳性（30-40%）,Desmin阳性,S-100 阳性,NF可阳性,（三）胃肠间质瘤(GIST)起源于Cajal细胞的前驱细胞，,胃肠道间质瘤A 溃疡位于病变的上端B 切面显示向管壁扩展。,胃肠道间质瘤,间质瘤A 栅栏状核似神经鞘瘤B 梭形细胞有明显细胞浆空泡C 上皮样型,间质瘤,恶性胃肠道间质瘤A 肿瘤细胞围绕血管形成血管旁细胞套，外周为坏死B 可见数个核分裂。,恶性胃肠道间质瘤,胃肠间质瘤,A 瘤细胞间见嗜伊红色胶原纤维团块,B CD34强阳性,胃肠间质瘤A 瘤细胞间见嗜伊B CD34强阳性,胃肠间质瘤A 上皮样型B Vimentin阳性,胃肠间质瘤,一、GIST是一组异质性肿瘤,多数情况下，激酶基因突变是主要的致癌事件1,2KIT：80-85%1PDGFRA：72野生型（无法检测到的突变）：10-15%1 SDH-deficient GIST 突变导致激活的酪氨酸激酶受体持续的异常表达(KIT或PDGFRA)3 Gain of function mutation,PDGFRA，血小板源性生长因子受体；PDGFRA，血小板源性生长因子受体基因1. Corless CL et al. J Clin Oncol. 2004;22:3813-3825.2. Heinrich MC et al. Science. 2003;299:708-710.3. Trent JC et al. Curr Opin Oncol. 2006;18:386-395.,一、GIST是一组异质性肿瘤多数情况下，激酶基因突变是主要的,Molecular Classification of GISTs,Molecular Classification of GI,胃肠道间叶来源的肿瘤,CD117 免疫组化检测,GIST,是,desmin检测阳性,平滑肌瘤,是,否,S-100检测阳性,神经鞘瘤,是,DOG1 检测,GIST,是,否,野生型GIST,其他肿瘤,KIT 基因检测,GIST,PDGFR基因检测,否,GIST,是,是,是,否,GIST诊断流程-GSIT 中国共识,中国GIST诊断治疗专家共识2008,胃肠道间叶来源的肿瘤CD117 免疫组化检测GIST是des,2、胃肠道间质瘤 CD117+（重要）、 DOG-1 （重要）、 CD34 + Desmin+/、SMA/MSA+/ S-100 +/ 、NF +/ P63+、P53+、Ki-67+预后差3、 Barrett食管,2、胃肠道间质瘤,SDH-deficient GIST,占GIST的5%7.5%临床上常以综合征的形式表现 （如Carney三联征或Carney-Stratakis 综合征）好发于胃，上皮样GIST，多结节性 淋巴管瘤栓，淋巴结转移免疫组化: 可表达CD117和DOG1，不表达SDHBc-kit或PDGFRA基因突变检测显示为野生型核分裂象不能评估危险度，发生转移的间隙期较长，故需长期随访,SDH-deficient GIST占GIST的5%7.,CD34,+ in 70% GISTs: 47% in small intestine; 96% in rectum; 100% in esophogusCD34 is not specific for GISTsCD34+: 孤立性纤维性肿瘤（90%）, 炎症性纤维性息肉、去分化脂肪肉瘤、皮肤隆突性纤维肉瘤 （90%）、某些神经肿瘤、卡波西肉瘤、多数血 管肉瘤、许多上皮样肉瘤,CD34+ in 70% GISTs: 47% in sma,免疫组化在肿瘤研究中的应用 1、提高病理诊断的准确性，确定肿瘤来源及类 型。 通过检测细胞骨架抗原（如CK, Vimetin, Desmin, GFAP等）;细胞功能产物抗原（如激素，免疫球蛋白，NSE, CgA等）;细胞表型标记物，属细胞膜抗原（如LCA, EMA)及各种淋巴细胞表型）和胚胎期抗原（如CEA, AFP).确定肿瘤来源 2、某些激素受体及生长因子的检测可判断预后。 如：PR、ER 、,免疫组化在肿瘤研究中的应用,免疫组化在肿瘤研究中的应用 3、癌基因蛋白的研究，研究肿瘤的发生、发展 过程，如各种癌基因、抑癌基因及其相关因素。 P53: 恶变 Bcl-2：淋巴结生发中心反应性和淋巴瘤的区别 Cer-b-B-2： 乳腺导管内上皮的重度非典型增生和 乳腺导管内癌的区别,免疫组化在肿瘤研究中的应用,4、评价肿瘤增殖活性，对肿瘤分化、复发 提供参考。如ki-67, PCNA等。 5、检测肿瘤组织的转移潜能，如nm23-H, CD44V6, MMP等。6、协助判定肿瘤的分期 LN和型可显示有无浸润7、提高微小癌灶的发现率8、指导肿瘤的治疗 PR、ER、Cer-b-B-2和许多耐药基因的检测9、免疫性疾病的辅助诊断10、病原生物的检查 如：HPV、EB、HP等,4、评价肿瘤增殖活性，对肿瘤分化、复发,免疫组化染色的注意事项：（一）抗体的保存和配制1、保存： 浓缩抗体： -20-40C 约12年 即用型抗体；4C 约1年2、抗体的配制： 浓缩抗体必须找抗体的最佳稀释度 即用型抗体直接使用（二）正确设计对照,免疫组化染色的注意事项：,阴性对照（PBS或非免疫血清）、阳性对照（购置的或自己收集的）、自身对照、抑制对照和吸收对照。 抑制对照和吸收对照一般不用。（三）出现假阳性的几种常见原因1、抗体稀释度不够，浓度太高。2、抗体与多种抗原有交叉反应。3、抗体与组织中某些成分非特异性结合， 出现异常表达，如：S-100在鳞状上皮表达。4、内源性酶的显色,阴性对照（PBS或非免疫血清）、,5、肿瘤与病变组织中有其他组织残留 （尤其是肿瘤中有正常组织残留）6、抗原的弥散或被瘤细胞吞噬而使抗原 在不该出现的部位出现。7、异位抗原的表达，（有人认为是交叉 免疫反应）8、内源性生物素的影响。,5、肿瘤与病变组织中有其他组织残留,表2：生物素在正常组织中的分布情况,注：- 阴性；+/1 弱阳性点状分布；+/2 中度阳性片状分布；+/3 强阳性弥漫分布。,表2：生物素在正常组织中的分布情况组织生物素组织生物素组织生,HE,未修复,修复,修复+封闭,修复+DAB,标准CK,HE未修复修复修复+封闭修复+DAB标准CK,生物素,生物素,标准CK,生物素+CK,生物素生物素标准CK生物素+CK,胃内分泌细胞,胃内分泌细胞,皮脂腺,皮脂腺,垂体腺瘤,垂体腺瘤,腺淋巴瘤,腺淋巴瘤,大鼠肾脏,大鼠肾脏,大鼠肝脏,大鼠肝脏,大鼠胰腺,大鼠胰腺,研究显示,（1）冰冻组织中存在内源性生物素。（2）经福马林固定石蜡包埋后生物素被封闭。（3）加热抗原修复可造成内源性生物素暴露。（4）内源性生物素暴露的强度各不相同，从弱阳性（+） 到强阳性（+）。（5）内源性生物素在组织中的分布形式，既有散在分布 也有弥漫分布，主要以颗粒状形式存在于胞浆中。（6）内源性生物素广泛存在于上皮源性组织，特别是腺 上皮组织，亦存在部分非上皮组织。（7）内源性生物素不仅存在人体组织，也存在大鼠组织。（8）内源性生物素暴露的强弱与修复液有关，其强度增 加依次为：柠檬酸、EDTA、EGTA。（9）热抗原修复暴露的内源性生物素可被鸡蛋清封闭。,研究显示 （1）冰冻组织中存在内源性生物素。,建议,为了避免免疫组化中内源性生物素的干扰，凡采用冰冻切片或石蜡切片加热抗原修复用非生物素检测系统：1、进行内源性生物素封闭，并成为常规。可采用蛋清或 卵白素作为封闭剂。2、或采用非生物素检测系统，如EnVision等。3、应坚持使用阴性对照。,建议 为了避免免疫组化中内源性生物素的干扰，凡采用冰冻,（四）出现假阴性的几常见种原因1、抗体和检测试剂盒配对不合理（现在一 般用通用型可避免试剂盒配对不合理）2、抗体的浓度太低3、孵育的时间太短（根据要求做）4、固定和温度 有的抗体不适合用于福尔马林固定的组织，仅适合用于冰冻切片；固定、包埋的温度过高，抗原丢失（62C）5、染色步骤不正确6、染色过程中切片过分干燥,（四）出现假阴性的几常见种原因,（五）出现背景着色的几种常见原因1、内源性的过氧化物酶没有阻断2、正常动物血清使用不合理（如二抗为羊抗鼠的 IgG ,因该用羊的血清)。3、脱蜡不够彻底4、组织粘贴剂使用不当或太浓5、PBS冲洗不够6、抗体稀释不合理，浓度太高。7、底物显色时间太长,（五）出现背景着色的几种常见原因,（六）显示剂的合理使用和增强方法1、显示剂：目前最常用的 DAB 和 AEC 仅用于HRP系统 AP-Red 和 Fast-Blue 仅用于AP系统2、增强剂：主要是在DAB显色加一些金 属离子。如：镍、铜、钴等（七）结果判定标准1、阳性细胞定位是否明确（膜、浆、核）2、间质是否清晰3、有无背景着色,（六）显示剂的合理使用和增强方法,4、根据不同的情况判定阳性的标准 （有的阳性细胞数在5%以上才定为阳性）5、注意抗原的联合表达如：分化差的癌可表达间叶的成分,4、根据不同的情况判定阳性的标准,（七）免疫组织化学染色中常见脱片原因1、组织固定、脱水、透明不充分。2、组织切片过厚。3、组织切片有折叠。4、过度的热抗原修复（高压、微波、水煮）处理或抗原修复液的pH偏高。5、操作过程中，冲洗方法不正确等。,（七）免疫组织化学染色中常见脱片原因,G. 结果判断,背景干净, 位置正确,G. 结果判断,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,Dako, c-kit, malignant mesothelioma,Dako, c-kit, malignant mesothe,Dako, c-kit, malignant mesothelioma,Dako, c-kit, malignant mesothe,Dako, c-kit, malignant mesothelioma,Dako, c-kit, malignant mesothe,Dako, c-kit, malignant mesothelioma,Dako, c-kit, malignant mesothe,免疫组织化学原理及应用12级课件,Dako, c-kit, GIST,Dako, c-kit, GIST,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学原理及应用12级课件,P16, anorectal SCC,P16, anorectal SCC,P16, anorectal SCC,P16, anorectal SCC,P16, anorectal SCC,P16, anorectal SCC,Breast lobular carcinoma in thyroid gland, TG,Breast lobular carcinoma in th,一. 免疫组化报告,取材 封片 观察 （共10分）,一. 免疫组化报告,一块已知的食管鳞状细胞癌组 织，周围带有少量的正常的食管组 织，让你用免疫组化Envision法、 用第一抗体为鼠抗人的单克隆抗体 CKAE1/AE3以检测该食管鳞状细胞 癌的组织情况,你如何做出一张 合格的免疫组化切片?,一块已知的食管鳞状细胞癌组,要求：1、实验目的 ：2、实验方法：3、使用的实验设备和药品：4、实验步骤：5、实验结果：二、免疫组织化学染色切片 （10分）,要求：,谢 谢,免疫组织化学原理及应用12级课件,免疫组织化学试题,免疫组织化学试题,一. 免疫组化报告,取材 封片 观察 （共15分）,一. 免疫组化报告,一块已知的肺鳞状细胞癌组 织，周围带有少量的正常的肺组 织，让你用免疫组化Envision法、 用第一抗体为鼠抗人的单克隆抗体 CKAE1/AE3以检测该肺鳞状细胞 癌的组织情况,你如何做出一张 合格的免疫组化切片?,一块已知的肺鳞状细胞癌组,要求：1、实验目的 ：2、实验方法：3、使用的实验设备和药品：4、实验步骤：5、实验结果：二、免疫组织化学染色切片 （10分）,要求：,免疫组织化学原理及应用12级课件,第二章 组织化学与免疫组织化学染色的样品制备,取材固定脱水透明浸蜡包埋修块切片防脱片处理捞片烤片进行各种染色脱水透明封片镜下观察,第二章 组织化学与免疫组织化学染色的样品制备,第一节 取材,一、组织标本取材：1、要求： 尽可能保持生活状态下形态结构的完 整性（材料尽可能新鲜） 尽量保持化学成分和酶的活性 保持组织细胞的抗原不受损2、注意事项 材料及时送检（及时固定,510倍的固定 液），尽快取材 （及时固定或及时冷冻 切片或-80保持备用） （尽可能新鲜）,第一节 取材一、组织标本取材：, 防止人为因素影响。如：避免挤压，刀刃 要锋利，不可反复切拉组织 组织块大小适中：过大过厚固定不良 一般：1.51.50.20.3cm3 最大: 2.52.50.20.3cm3免疫组化: 110.2cm3 电镜: 0.3 0.30.5cm3 注意切面: 目标组织细胞一定在目标切面上 注意特殊情况： 缝线、钙化、血液、粘液、粪便等需要先处理, 防止人为因素影响。如：避免挤压，刀刃, 取材部位: 主要病变、交接区、远离病变区正常 动物的取材：麻醉处死取材 乙醚吸入麻醉法： 大白鼠、豚鼠戊巴比妥钠和乌拉坦： 3戊巴比妥钠 或20乌拉坦 腹腔或静脉注射12ml空气栓塞法 尽快切断主动脉放血后在取材, 取材部位:,二、细胞标本取材：（一）培养的细胞 1、贴壁生长的细胞 在接种细胞前，把涂有黏附剂的小盖玻片放入培养板中，接种后细胞的 自然爬到小盖玻片上生长，取材时，将小盖玻片用预热的PBS液轻轻冲洗，沥干后即可放入固定液内。,二、细胞标本取材：,2、悬浮生长的细胞 制备浓度为2105-6细胞/ml悬液，取50100l，加入离心涂片机内，1000r/min离心2分钟即可均匀分布于已涂黏附剂的载玻片上。,2、悬浮生长的细胞,3、印片法 主要应用于活组织标本检查和剖检标本取材。将载玻片轻轻压于病变区，脱落的细胞便黏附在玻片上，立即将载玻片浸入细胞固定液内510分钟，自然干燥，低温保存备用。优秀是简便省时，细胞抗原保存较好；缺点是细胞分布不均匀，玻片上细胞有重叠。,3、印片法,（二）涂片法 取含有细胞的液体（腹水、胸水和心包液）或气管、宫颈等分泌物直接涂片，加入12ml Hanks液（或细胞培养液）轻轻混匀，500r/min离心510分钟，弃上清液，制成细胞悬液（2106细胞/ml），使用细胞离心涂片机或吸一滴于载玻片上，轻涂，干燥后固定。,（二）涂片法 取含有细胞的液体（腹,第二节 固定,固定（fixation）的目的 是用人为的方法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞死后发生自溶和组织腐败。固定还能增加组织块硬度，使其更容易切片，使不同的结构更容易染色。,第二节 固定固定（fixation）的目的,一、组织和细胞的固定方法 固定方法有物理固定和化学固定两类， 物理固定 可采用空气干燥（血涂片）、骤冷（在液氮中迅速冷冻）或微波固定等； 化学固定 有浸润法（immersion method）和灌流法（perfusion method）。,一、组织和细胞的固定方法,浸润法是组织化学和免疫组织化学最常用的方法，一次能处理大量的标本，预先需估计固定液的用量, 并在取材前配固定液，组织样品分装于小容器内，在容器上标记组别和取材时间。容器内入记录组织类型的纸条，以便包埋时辨认。固定液的用量应是样品的5/10/20/40倍，以保证组织充分固定。固定时间可根据所选固定液和组织类型而定。若进行酶组织化学染色，应在4短时间固定，固定时间长会导致酶活性减弱，甚至消失。 灌流法适用于动物实验中对缺氧敏感的器官，如神经系统和胃肠等取材。,浸润法是组织化学和免疫组织化学最常用的方法，一次,二、常用固定剂和固定方法（一）组织常用固定剂和固定方法1、甲醛 是常用的醛类固定剂，甲醛（formaldehyde）通过与蛋白多肽链氨基酸侧链的功能基团，如氨基、羟基、酰氨基等结合，使蛋白多肽分子间形成亚甲基桥（CH2），蛋白质不再发生改变，保存原位，其特点是组织形态结构保存好，穿透性强，组织收缩少。,二、常用固定剂和固定方法,但是，醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的空间构象发生改变，分子间交联形成的网络结构可能部分和完全遮盖抗原决定簇，使之不能完全暴露，因此，在免疫组织化学染色时产生假阴性结果。如果固定后能够充分水洗，可减少分子间交联。在免疫组织化学染色之前切片通过抗原修复还可使抗原再现。 为减少固定剂与抗原的交联，在使用醛类固定剂时，应缩短固定时间（824小时），降低固定温度（4）。由于上述缺点可能通过一定处理加以纠正，因此甲醛是首选固定剂。,但是，醛基与抗原蛋白氨基交联形成羧甲基，使抗,方法： （1）10%中性缓冲福尔马林：商品试剂常为37%40%甲醛水溶液，常按1：9比例使用，但甲醛的实际浓度为4%配法：甲醛原液10ml,0.1mol/L磷酸缓冲液（PB，pH7.4）90ml混匀。 （2）4%多聚甲醛磷酸缓冲液（多聚甲醛40g,0.1mol/L PB 500ml，两者混合加热至60，搅拌并滴加1N NaOH至清澈为止，冷却后加PB至总量1000ml）。,方法：,2、丙酮 为无色极易挥发和易燃的液体，丙酮（acetone）渗透力很强，能使蛋白质沉淀凝固，但不影响蛋白质的功能基团而保存酶的活性，用于固定磷酸酶的氧化酶效果较好。缺点是固定快、渗透力强，易使组织细胞收缩，保持细胞结构欠佳。一般4下3060分钟为宜。3、醇类 性能与丙酮基本相同，有固定和脱水的双重作用，穿透力快，组织块收缩明显，硬化力强。用冷液能较好地保存酶的抗原的免疫活性，但醇类对低分子蛋白质、多肽及细胞质内蛋白质保存效果较差，解决的办法是与其他试剂混合使用。,2、丙酮,4、混合固定剂（1）Bouin液： 先将饱和苦味酸750ml过滤，加入40%甲醛250ml，混合后存于4冰箱备用，临用前加入冰醋酸50ml。组织通常在4下固定68小时。此固定剂对肾脏组织保存不利。（2）Zamboni液： 称取多聚甲醛20g ，加入饱和苦味酸150ml，加热至60左右，持续搅拌，使之完全溶解，过滤、冷却后加Karasson-Schwlt磷酸缓冲液（NaH2PO4H2O3.3lg，Na2HPO47H2O33.77g，加双蒸水至1000ml）。该固定液可用于光镜、电镜免疫细胞化学观察。固定时间以618小时为宜。,4、混合固定剂,（3）AAF液： 为较常用的固定液（95%100%乙醇85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml）。（4）Clarke改良固定剂 （100%乙醇75ml，冰醋酸25ml），常用于冰冻切片的后固定。,（3）AAF液：,（二）培养细胞常用固定和固定方法 培养细胞常用固定剂有4%多聚甲醛磷酸缓冲液、丙酮、甲醇和95%乙醇。在固定之前需用37预热的PBS轻洗细胞。1、4%多聚甲醛磷酸缓冲液 固定1020分钟，干燥。2、甲醇 10甲醇固定520分钟，自然干燥。3、丙酮 4冷丙酮固定组织穿透性和脱水性强，抗原保存好，很少用于组织切片，常用于培养细胞和组织涂片的固定，平时丙酮4低温保存备用，临用时，将载玻片插入冷丙酮内510分钟，取出后自然干燥。,（二）培养细胞常用固定和固定方法,4、乙醇 95%乙醇脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而固定时间不宜过长（2小时内）。乙醇使蛋白变性程度轻，固定后蛋白可再溶解，在染色中孵育时间长的情况下，抗原可流失，并减弱反应强度。5、乙醚（或三氯甲烷） 与乙醇等量混合对组织穿透性极强，即使涂片上含较多的黏液，固定效果仍较