免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用培训课件.ppt

免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,引言： 1842年BeNNeftt首先提出了“组织学”，同时virchow作了大量正常和病理组织显微镜研究，于1856年发表了“细胞病理学”。百余年来组织病理学进展很快，但在应用和解释形态学标准时仍有困难，单靠组织切片检查有时并不能作出全面的诊断，随之发展了特殊染色和各种组化技术，为病理诊断提供了新的参考依据。1941年由cooN等建立的荧光抗体在组织切片中检测细胞抗原的技术，首次提供了一种根据细胞抗原及细胞产物来识别细胞的手段，这种手段在病理的某些领域，尤其是肾脏病、皮肤病的研究中取得了非常大的成功。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,2,引言：免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用2,但在外科病理学中并未得到推广，主要是由于该方法需要新鲜组织作冰冻切片，并只能获得较少的形态学特征，这对于传统的根据细胞形态学的特征，有时甚至是极细微的表现来识别细胞和诊断肿瘤的外科病理学家来说无疑是一大障碍。尽管荧光抗体技术并未在肿瘤研究中得到广泛应用，但由于其简便而快速的特点，在肾小球肾炎、皮肤病的研究中仍发挥着重要的作用。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,3,但在外科病理学中并未得到推广，主要是由于该方法,1966年NakaNe和Averameas等建立了免疫酶标技术，1970年seerNberger等人发展了一种过氧化物酶抗过氧化物酶(PAP)技术，1975年Kohler和MilsteiN建立了杂交瘤制备单克隆抗体技术，这些对于外科病理的发展是一个重大的技术里程碑。随着辣根过氧化物酶代替荧光素异硫氰酸盐，作为初级抗体的标记物，一种全新的信号分子得到了应用，在辣根过氧化物酶中加入显色的底物进行染色，产生一种能被普遍光镜所观察的稳定显色反应。酶免疫组化法对于病理学家诊断肿瘤、对其分类、判断预后产生了巨大的影响，同时也扩展了人们对于各种疾病与肿瘤形成过程的认识，提高了病理诊断与研究水平。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,4,1966年NakaNe和Averameas等,一、 免疫组化技术 利用能与特异性抗体结合的酶，在酶-抗体-抗原反应的位点上诱导通过底物或显色剂而完成的变色反应。辣根过氧化物酶是免疫酶学的原型，其它酶系统如葡萄糖氧化酶，碱性磷酸酶也被成功应用。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,5,一、 免疫组化技术 免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用5,酶桥法： 利用酶联抗体将酶与组织切片中抗原相结合，通过与适当底物反应（通常是H2O2）以及二氨基联苯胺(diamiNobeNzidiNe DAB)的显色剂，产生一种不溶性棕色反应产物。该法已被进一步改进发展为更敏感的多级桥联法，后者利于增加在抗原部位反应产物的沉积。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,6,酶桥法：免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用6,PAP法是过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)复合物，包括辣根过氧化物酶抗体，及辣根过氧化物酶抗原组成的可溶性复合物为五环状结构，3个分子辣根过氧化物酶和二个抗体分子组成，极为稳定，比免疫荧光法敏感100-1000倍，比酶桥法敏感20倍，其原理是特异性初级抗体（一抗）的Fab段与组织抗原结合，二抗（桥抗）在一抗与PAP复合物之间形成分子桥联，此时一抗与PAP中的免疫球蛋必须是同一种属，以使得衍生自其它种属的二抗，对一抗分子PAP中的FC段及稳定成份都具有特异性。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,7,PAP法是过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP),由于免疫酶学技术普遍使用辣根过氧化物酶，因此组织切片中内源性过氧化物酶一开始就必须用H2O2或H2O2和甲醇组成的混合物加以灭活，并通过与桥抗同一种属来源的非免疫稀释血清阻断非特异性结合，足够的桥抗使所有游离抗原结合位点都能与PAP复合物连接，并在加入PAP可溶性复合物到组织切片中反应之前洗去未结合的桥抗，最后使PAP复合物与底物及显色剂反应， 以产生能被普通光镜所见到的不溶性棕色产物，以此识别组织切片中抗原所在的位置。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,8,由于免疫酶学技术普遍使用辣根过氧化物酶，因,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,9,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用9,免疫酶学技术还包括碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶(APA-AP)系统2 及葡萄糖氧化酶抗葡萄糖氧化酶（GAG)系统等，这些技术与PAP技术相似，只不过是将碱性磷酸酶或葡萄糖氧化酶代替辣根过氧化物酶而已，据称这两种技术可以减少背景染色的干扰，因为相应的内源性酶在组织中分布有限，尤其是APA -AP技术更适用于血液标本染色。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,10,免疫酶学技术还包括碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶,生物素是一种低分子量的维生素，可以与一抗共价结合。亲合素是一种从卵白素中提取的具有4 个生物素结合位点的糖蛋白，这一特性能使之成为多级免疫酶学系统各成分之间的桥接物。1981年Hsu 等人建立了卵白素-生物素-过氧化物酶(AvidiN BiotiN-peroxidase Complex ABC)系统。该方法是通过生物素相关的次级抗体将一抗连接到卵白素-生物素-过氧化物酶复合物上，结果产生的复合物是一种点阵样、三维构造的复合物，有助于将多个辣根过氧化物酶分子结合于切片中的一个抗原所在的位点上，因此比PAP法更灵敏，约比PAP法敏感8-40倍，特异性强、非特异性背景着色低、方法简便、应用广。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,11,生物素是一种低分子量的维生素，可以与一抗共,ABC系统通过将链球菌抗生物素蛋白代替抗生物素蛋白而得到进一步改进，称为链球菌抗生物素蛋白-生物素系统(StreptavidiN biotiN system SAB)。链球菌抗生物素蛋白在生理PH环境中为电中性，而不产生非特异性结合，而抗生物素蛋白在生理PH环境中带正电荷。应用抗生物素蛋白-生物素法时，内源性生物素能与抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物直接结合而产生非特异性或称假阳性染色，避免的方法可先通过切片与游离抗生物素蛋白反应以去除游离生物素。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,12,ABC系统通过将链球菌抗生物素蛋白代替抗生物,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,13,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用13,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,14,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用14,葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal proteiN A SPA)是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白成分， 单链多肽，分子量为42000，SPA最大的特点是能与不同种属血清中免疫球蛋白分子稳定FC段结合，此外还能与其它物质如荧光素、过氧化物酶、铁蛋白、胶体金等结合，并不影响其生物活性，因此被用来发展为一种简便而迅速的免疫过氧化物酶法，即用SPA代替PAP技术中的次级抗体，因SPA可与多种动物的抗血清反应，而不需因不同种动物而制备相应的第二抗体。SPA可以结合大多数IgG分子，可以充当第一抗体和衍生自不同种属的抗过氧化物酶抗体的桥接物即SPA-过氧化物酶联法。同时由于SPA与FC段的高亲和力可以减少非特异性背景染色。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,15,葡萄球菌A蛋白(Staphylococca,金属离子和金属蛋白复合物如铁蛋白、金和汞可作为免疫组化反应中的标记物，如免疫金银法 (ImmuNogold silver techNique IGST)。其基本原理是用特异性抗体与抗原反应，随后用金标记的间接抗体或SPA蛋白，再与特异性抗体结合，用乳酸银处理，使银颗粒沉积在金颗粒上，还原银反应而显示出黑褐色。适用于石蜡切片，冰冻切片，培养细胞，细胞涂片和树脂包埋的电镜切片，该法敏感性高，可检测组织中微量抗原，定位准确，无扩散现象，背景清晰，对比度好，方法简便。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,16,金属离子和金属蛋白复合物如铁蛋白、金和汞可,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,17,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用17,美国抗体公司新近又推出“二步法”系统，清除了与内源性生物素的非特异性结合，具有灵敏度高，无背景，步骤少，节省时间等诸多优点，其原理是通过一个葡聚糖分子，将多个抗小鼠或抗兔的二抗同多个辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸酶(AP)聚合在一起。由于葡聚糖分子较大，其每个骨架可以结合多达100个酶分子和 20 个抗体分子，因此大大提高了检测的灵敏度， 又由于二抗和酶合二为一，其测定过程至少比SBA/ABC法少一个步骤。另外无需阻断内源性生物素，所以血清封闭这一步可以省去。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,18,美国抗体公司新近又推出“二步法”系统，清除,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,19,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用19,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,20,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用20,原位杂交也称为“杂交组织化学”(HydridizatioN Histochmistry) 是在单个细胞水平上提供了形态学定位特异性DNA或RNA顺序，DNA二条链之间以碱基的氢键相连，而四种碱基均按严格的互补规律结合成对(T或U-A,C-G)，DNA经变性处理碱基间氢键发生断裂，双链DNA 可解离成单链，终止变性处理后，DNA可恢复双链结构，因而利用标记已知核苷酸序列DNA片断作为探针，按碱基配对的互补原则去检测组织切片中的DNA或RNA。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,21,原位杂交也称为“杂交组织化学”(Hydrid,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,22,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用22,二、 显色剂 在各种免疫组化显色剂中，3.3-二氨基联苯胺(DAB)是目前用得最多的，它的棕色反应产物清晰可见，且不溶于酒精，因此适用于多种抗体染色及固定介质中，但DAB具有致癌性。3-氨基-9-乙基卡巴唑(AEC)为红色终产物，溶于酒精，使用该显色剂时需要一种特殊的含水固定介质，其反应产物不稳定，在贮存过程中密度逐渐降低。与DAB一样AEC也具有致癌性8，因此没有足够的理由将其作为DAB的替代物。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,23,二、 显色剂 免疫组化技术在病理诊断和,其它的显色剂如4-氯-1-萘酚为兰色的终产物，溶于酒精、盐酸对苯二胺/焦性儿萘酚，形成兰黑色终末产物，不溶于酒精。四甲基联苯胺、-萘酚和同香草醛酸，它们的作用是在有H2O2存在的情况下，由氢化物酶介导其产生氧化诱导反应，产生一种沉积于组织中抗体-酶复合物位置上可见的氧化产物。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,24,其它的显色剂如4-氯-1-萘酚为兰色的终产物，,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,25,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用25,三、试剂 免疫组化质量好坏的重要因素之一是所应用的第一抗体的质量，单克隆抗体有很强的特异性，不同的批号之间差异不大，由于它们主要是针对抗原表位，而不是整个抗原，所以单克隆抗体较常规多克隆抗体敏感性低。事实上有些单克隆抗体，尤其是作用于细胞表面抗原的，也许只与低温，恒温切片中的未固定细胞反应，因此这种单抗的应用受到限制。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,26,三、试剂 免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用26,第一抗体有时与商标说明并不相同。因此每个实验室须将新购的抗体进行测试，一般可在多组织块(即由20-30种不同瘤组织组成的复合物）中进行测试。 试剂最佳浓度的确定受到固定方法、时间、组织处理过程的影响，最佳浓度在不同实验室是不同的，最合适的稀释度是以得到最大强度的特异性染色和最弱的背景染色为标准。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,27,第一抗体有时与商标说明并不相同。因此每个实验室,在诊断性免疫组化中的质量控制是个重要问题。美国生物染色委员会成立了一个专家小组，以负责检测商品抗体的程序，这是质量控制的保证手段，并使附属商品以及商品试剂信息标准化，美国食品及药品管理局（FDA)通过美国病理学会批准出台一项政策，列出了61种在一些严重疾病的诊断和/ 或监测中充分标准的单克隆抗体，并要求制造商自政策发表之日起的30个月内向FDA提交合适的产品使用申请，在此期间产品虽被允许用于医学目的在市场销售，但制造商们必须在产品上标明“未经法律批准，暂时供应以满足重要的医学目的”。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,28,在诊断性免疫组化中的质量控制是个重要问题。美国,此外，制造商及进口商将负责保证通知所有实验室中的医生及相关人员。制造商们必须确保在30个月内给出产品的安全性及效能的数据,否则将从市场上消失。FDA的这些限制是针对外科病理学检验中所应用的试剂，但其含意明显延伸到免疫组化中应用的试剂。关于是否有必要区别应用于免疫组化，流式细胞仪，以及外科病理检验中的抗体，当同种抗体应用于不同目的时其抗体的标准及范围的讨论仍在继续，免疫组化方法的标准化，如组织准备，染色时段等，使各实验室之间标准化与进行比较是十分困难的，自动化染色便能很好的解决这个问题，自动化染色可使各实验室间标准统一。但是免疫组化方法中重要的一点是组织固定与处理的方法在各实验室间区别甚大，以致于即使实现自动化也很难达到标准统一，自动化将实现实验室内部标准化，使定量技术如密度分析得以实现。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,29,此外，制造商及进口商将负责保证通知所有实验室中,抗体保存在不吸附蛋白质的材料中，如储存抗体中蛋白浓度很低时（10-100mg/l），应另加隔离蛋白，以减少容器对抗体蛋白的吸附，隔离蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。绝大多数已稀释的抗体应保存在4-8的条件下，以免冻融对抗体蛋白产生有害的效应。抗体原液和已分离的免疫球蛋白组分应保存于-20条件，避免反复冻融。冷冻的抗体溶液应置于室温中缓慢地解冻，应绝对避免用高温快速解冻。被细菌污染的抗体常会出现假阳性结果，为了防止细菌污染，可在抗体溶液中加入0.01%叠氮钠。抗体经真空冷冻干燥后置-20以下可以保存2-3年，保存稀释后的单抗应加入0.1%叠氮钠。大多数稀释抗体不可进行冷冻保存，多数抗体可能会丢失抗原活性，多数抗体只要蛋白浓度适当，可在4下保存数月。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,30,抗体保存在不吸附蛋白质的材料中，如储存抗体中蛋白浓度,四、免疫组化增强染色方法，可采取几种形式 不溶性氧显色剂产物的可见度可通过金属离子或有机化合物增强。例如将免疫染色切片浸泡于0.5硫酸铜溶液、0.125%四氧化锇、1氯化钴、 或1 硫酸镍铵中，可以根据使用不同溶液而改变其反应产物的颜色以增加可见度12, 但并不提高免疫染色的灵敏度。在应用黑白显微摄影技术时，这些方法较有效，如锇的黑色能增强与苏木素，甲基绿或钴兰绿等背景染色形成强烈对比 。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,31,四、免疫组化增强染色方法，可采取几种形式免疫组化技术,其它技术如用咪唑也可以实现免疫染色增强，由辣根过氧化物酶介导DAB 的过氧化反应可以被多种含氮化合物增强，咪唑是最有效的一种。另一项免疫染色增强技术尤其适用于组织内抗原数量很低时，重复使用初级抗体，开始抗体孵育过程很短，接着PBS冲洗，然后再次与同一浓度的初级抗体进行反应，并在4“孵育”过夜，这一过程也可以颠倒即先一抗4孵育过夜（或室温下）然后PBS洗，再次反应。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,32,其它技术如用咪唑也可以实现免疫染色增强，由辣,五、免疫组化中的固定，这也是免疫组化好坏的关键 有证据表明目前石蜡包埋处理的组织减少了可以检测的抗原数量15。 、冰冻组织 在新鲜冰冻组织中细胞表面抗原及其它组织抗原，仅需极少量组织即可被检测到，而在常规操作及蜡块包埋时这些抗原可能完全丢失。所以新鲜组织冰冻切片仍是抗原保存的金标准。 未被冰冻的组织必须立即固定，以免变干，否则抗原将“失活”。若抗原长期暴露于固定剂后将被毁掉，因此用于免疫组化目的的组织，应尽可能短时间固定，即刻包埋。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,33,五、免疫组化中的固定，这也是免疫组化好坏的关键免疫组,、醛固定剂 甲醛是诊断实验室中被广泛应用的固定剂，组织在10缓冲甲醛中，保存很长的时间仍可保持令人满意的细胞形态，但长时间固定于甲醛中绝对是免疫组化不值得提倡的，抗原的保存量与固定时间负相关。很多种普通组织抗原在持续固定后丢失。非肿瘤组织的多组织块固定于甲醛3天后，抗原染色密度显著下降，7天后大多数抗原丢失。VimeNtiN和DismiN即使固定于甲醛中一天也会丢失很多。特别是尸检组织常固定较长时间，影响免疫组化结果。因此要想获得多种抗原的满意结果，固定时间最好不要超过6-8小时。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,34,、醛固定剂 免疫组化技术在病理诊断和研究,、非交联固定剂 不同的固定剂对抗原有不同的保存结果，如Carroy 溶液(60乙醇、30 氯仿、10冰醋酸)，methacarN(60甲醇、30氯仿、10醋酸）和95乙醇更适合于检测组织中的VimeNtiN。BouiN 溶液能较好保存N肽及生物胺。重金属固定剂如B5和ZeNker溶液更适合于一些核抗原的免疫组化检测，但这些固定液常使背景染色增加，对于环境又是一个有毒的污染物。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,35,、非交联固定剂 免疫组化技术在病理诊断和研,过碘酸盐-赖氨酸副甲醛溶液能氧化糖类，产生交联、稳定脂质和蛋白，并保留形态的完整，较适合于淋巴细胞膜抗原的保存。并较适用于雌激素受体蛋白的免疫染色。 当固定剂中含有酸性物质时最易导致抗原的丢失，可能是蛋白质三级，四级结构受损，因此使用中性或接近于生理PH值的固定剂可获得最满意的形态及抗原保存效果。因此现在提倡使用缓冲甲醛固定液。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,36,过碘酸盐-赖氨酸副甲醛溶液能氧化糖类，产生交,细胞涂片的固定100% 的乙醇最为常用，在免疫染色准备中通常是先用乙醇固定尔后脱落细胞巴氏染色。SuthipiNtawoNg等发现将空气干燥的涂片在0.1甲醛盐溶液中固定14小时，随后在100乙醇溶液中10分钟，可得到组织抗原保存的最佳效果，同时还可以减少背景染色。这一种固定方法可使样品在室温下保存一周，或在-70中保存5周，便于涂片及细针抽吸样品的空气干燥，并进行实验研究，而不必担心固定过程中的抗原丢失。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,37,细胞涂片的固定100% 的乙醇最为常用，在免,、初级固定的微波照辐射 加热能使蛋白质部分变性，但加热从未在固定剂中广泛应用，微波(MW) 加热技术的出现克服了生物组织导热性能差的限制，提供了一种清洁而快捷的产生稳定热量的方法。在过去10年微波辐射作为一种快速组织固定法而得到广泛应用，而且成为甲醛的优良替代物用于细胞抗原的保存，将样品切成2毫米厚浸泡于生理盐水，MW辐射温度至62C，随后组织将放在100 乙醇和氯仿或二甲苯中循环处理3.5小时，然后借助真空技术进行石蜡包埋，对于细针抽吸或内镜活检材料可处理时间稍短些，约 65 分钟左右，应用MW代替甲醛作为固定剂及在自动处理过程中放弃使用甲醛，不仅消除了有毒和具有潜在毒性的试剂的危害，而且实现了从各种组织中获得高质量诊断切片的快捷准备措施。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,38,、初级固定的微波照辐射 免疫组化技术在,MW固定组织以保留抗原的方法明显优于10中性甲醛固定的组织，除了能对多种抗原的免疫染色有很好的效果外，其形态学保存效果也很出色。甲醛固定的组织从5小时起其免疫染色的程度低于相应MW的切片。MW还可以保存大量不稳定的淋巴细胞抗原，这些抗原在甲醛固定或石蜡包埋后通常被丢失。MW 对于CytokeratiN 和DismiN 没有影响，因此对这两种抗原检测，MW 的组织无需在免疫染色前进行酶的预处理。MW固定既改变了传统的甲醛固定引起的污染毒性，同时它具有使石蜡组织更好保留抗原的优点。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,39,MW固定组织以保留抗原的方法明显优于10,、重金属溶液的固定 重金属盐如锌盐已被作为一种有效的蛋白沉淀剂产生不溶性复合物，多肽锌甲醛作为一种固定剂可增强免疫染色。有研究表明组织固定后浸泡于硫酸锌中也可改善免疫染色效果。据介绍锌甲醛(1硫酸锌，溶于3.7 非缓冲甲醛中）用于自动组织处理法中较使用中性缓冲甲醛溶液能取得更好的抗原保存效果，值得注意的是它对抗原并没有严重的影响与损坏19。现在有加热诱导抗原保存技术，因此没有必要与足够的理由去使用像重金属这样的环境污染物。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,40,、重金属溶液的固定 免疫组化技术在病理诊断和研,六、抗原(决定簇)热修复 组织在甲醛或其它固定液中固定会引起位于蛋白内或蛋白间的亚甲基桥的桥连，即甲醛可使蛋白质凝固，引起蛋白质交联，进而引起许多抗原决定簇被封闭，阻碍抗原抗体的结合，断开交联，暴露抗原决定簇，使抗原抗体充分的结合，以达到抗原修复的作用。最常用的抗原修复技术是酶消化或热引导的抗原决定簇的修复（heat-iNduced epitope retrieval，HIER）。Cattoretti等报道用10mmol枸椽酸盐缓冲液(PH6.0)使用MW处理，能增加抗体稀释度，增强染色与减少“孵育”时间，这是一种重现抗原的步骤，其它作者拓展了这一方法，显示了该法对多种诊断性抗体都有效。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,41,六、抗原(决定簇)热修复免疫组化技术在病理诊断和研,该法具体过程为，脱蜡重新水化切片置于10mmol(PH 6.0)的枸椽酸盐缓冲液中，(2.1g -水枸橼酸溶于900ml蒸镏水，使用13ml 2mol NaOH调节PH至6.0）置于家用微波炉内，将能量调至最高，直至样品沸腾，该热溶液被弃去或用蒸镏水再次加满，重复以上过程，当再次达到沸点时加热停止，切片在免疫染色前在热缓冲液中再浸泡25分钟，如组织曾经固定较长时间该法可重复使用。该法用于目前的大多数诊断性抗体，能大大改善染色结果。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,42,该法具体过程为，脱蜡重新水化切片置于10m,如最常易被甲醛固定，石蜡包埋而掩盖的抗原CD19，抗体稀释倍后仍有染色。也有些抗原应用此方法并不增加免疫染色，如H222克隆的ER，mPR3克隆的PgR、CD21 、CD35、Mac387、LM、IV型胶原等。有时此法联合使用酶消化可以改善一些抗原染色。最近该法又进一步改进，将切片置于枸椽酸盐缓冲液的密闭玻璃容器中，微波辐射至沸腾，然后调节微波使缓冲液一直处于沸腾状态10分钟，然后在热缓冲液中再浸泡25分钟，可以大大增强灵敏度。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,43,如最常易被甲醛固定，石蜡包埋而掩盖的抗原CD,使用HIER时注意两点： 抗体孵育前每一步操作均不能使组织干燥， 加热后放置足够的时间，使之变凉（至少10-20分钟），可假设为允许蛋白恢复到它自然的结构。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,44,使用HIER时注意两点：免疫组化技术在病理诊断,除了枸橼酸盐缓冲液外，还有几种“抗原重现”试剂EDTA，Tris-Hcl，氯化铵或商品化靶修复液。用微波辐射0.05mol/L甘氨酸盐酸(PH3.5)中的组织切片可以检测核抗原的免疫染色，用微波辐射4M尿素中的切片，可以显示细胞及膜表面免疫球蛋白有效23，还可以用高压锅、电饭煲、电炉、电水壶等代替微波炉产生高温加热，也有抗原重现的作用。 EDTA-HIER的作用机制是通过钙离子的鳌合而实现，而且这种鳌合作用只有在碱性PH值下才起作用，枸橼酸盐缓冲液的作用似乎也是通过此作用。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,45,除了枸橼酸盐缓冲液外，还有几种“抗原重现”试剂,酸性抗原修复液如Tris-Hcl似乎通过高浓度的氢离子离解了钙离子复合物或打断了福尔马林固定产生的交联而实现。抗原修复液中PH值也至关重要，多数抗原在偏碱性PH值时效果好。对固定时间很长的非常旧的档案资料，酸性PH值抗原修复液工作效果优于碱性PH值的修复液。检测细胞膜或细胞浆抗原时，应用柠檬酸盐（CB）或EDTA缓冲液进行微波3档10分，效果，EDTA缓冲液作用优于CB，但有时可出现背景着色。检测细胞核抗原用CB，高氏处理较为理想，酶消化几乎没有作用，但这种方法对切片要求高，须防止脱片现象。检测细胞外间质抗原用酶消化好，特别是复合酶是最佳选择。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,46,酸性抗原修复液如Tris-Hcl似乎通过高浓度的氢离子离解了,七、抗原保存的几项特殊技术 、冻干 组织置于-45 10-2torr有P2O5中48小时能将组织冻干，随后进行石蜡包埋，对于保存淋巴细胞膜上不稳定抗原有效。但该法设备特殊、昂贵，组织干、硬、脆、切片后的形态学效果差。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,47,七、抗原保存的几项特殊技术免疫组化技术在病理诊断和研究中的应,、丙酮和丙酮-甲基苯甲酸盐-二甲苯(AMEX法) 丙酮为一种澄清无色易燃液体，在水、乙醇及大多数有机溶剂中均能溶解，作为脱水剂已广泛用于组织的处理，而且比乙醇等脱水剂更易挥发。丙酮易燃故不用于自动化处理过程，组织长期接触丙酮会变脆，丙酮作为细胞学中抗原固定剂，主要用于显示淋巴细胞膜抗原。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,48,、丙酮和丙酮-甲基苯甲酸盐-二甲苯(AME,最近丙酮在AMEX技术中充当固定剂，将组织固定于丙酮中-20过夜，随后用甲基苯甲酸盐及二甲苯清洗，尔后石蜡包埋，所得到的组织学效果据称比冰冻切片更好而且仍保存了淋巴细胞不稳定的抗原，这些学者声称从AMEX法固定的组织中可提取出与新鲜组织同样多的蛋白质。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,49,最近丙酮在AMEX技术中充当固定剂，将组织固定,、塑料包埋 在适当的固定后用新型塑料包埋组织，可获得良好的细胞形态学和抗原保存，用副甲醛、丙酮或BouiN液固定后在低温(4时)用多聚酶树酯包埋。 、冰冻替代法及塑料包埋 即用冰冻替代法配合低温塑料包埋避免了组织的固定而且具有比固定、包埋组织及低温、恒温切片更优越的形态学保存效果。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,50,、塑料包埋 免疫组化技术在病理诊断和研究,八、脱钙溶液和组织处理 很多报告都显示了EDTA、甲酸、10醋酸几乎都不影响免疫反应，即使经过长达7周的脱钙过程,但5% 硝酸脱钙将造成免疫反应的减弱，此时，用蛋白酶消化可稍加改善，三氯乙酸被认为是一种较有效的一步脱钙固定剂。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,51,八、脱钙溶液和组织处理免疫组化技术在病理诊断和研究中,有关脱钙组织中抗原保留的详细研究较少，60以上可引起抗原失活，细胞形态的丧失，尤其是核结构，因此浸蜡最好在60以下进行。必要时使用低溶点的蜡。组织切片在58烤干与37相比，前者抗原显著丢失28，但是抗原重现溶液在沸点的有效使用说明温度对于所受加热为湿热的固定组织并不是一个关键的因素。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,52,有关脱钙组织中抗原保留的详细研究较少，60,九、免疫组化染色方法 、传统的免疫组化染色 多种免疫组化方法的使用取决于各人爱好，免疫染色方法中的任何一步都可能隐藏着陷井，如阻断内源性过氧化物酶和过氧化物酶样酶失败可导致假阳性结果，非特异性的背景染色，尤其是结缔组织及胶原的染色，是免疫过氧化物酶染色中最令人讨厌的。如普通血清或牛白蛋白预先孵育可以减少背景染色。应用最大可能稀释的初级抗体同样有利于减少不必要的背景染色。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,53,九、免疫组化染色方法免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用53,多数初级抗体室温孵育为20-30分钟，将温度提高到70时，可以缩短孵育时间，但可能由此而增加背景染色而影响结果，最好是应用初级抗体的最低浓度4过夜（室温22过夜也有报道）。有些效价低的单克隆抗体或不易于与抗原结合的抗体，4过夜有时染色效果并不理想，可能是温度影响了抗体的生物活性，降低了两者特异性结合的速率。提高温度无疑是克服上述问题的方法之一。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,54,多数初级抗体室温孵育为20-30分钟，将,但应使用高质量的抗体稀释液来稀释一抗或使用商品化的抗体工作液，因为两者均含有抗体保护剂和稳定剂，这样才能使提高抗体孵育温度成为可能。具体步骤是加完一抗后，把组织切片置于密封较好的湿盒内，室温18-20过夜，有空调设备的房间或使用恒温培养箱更为适宜。这样可以较准确地控制实验温度，保持免疫组化染色外部条件的稳定。 应该强调的是组织切片在操作过程中不能晾干，否则会产生假阴性。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,55,但应使用高质量的抗体稀释液来稀释一抗或使用商品,、微波刺激免疫染色 微波辐射可以减少初级抗体孵育的时间，可以获得较佳的细胞形态学保存效果和更干净的背景29，微波还可用于石蜡切片染色中初级抗体、次级抗体、过氧化物酶复合物等所有阶段的孵育，还可用于加速阻断步骤，整个染色时间大约16分钟30，因此尤其适用于紧急的、或特殊情况时所需的即时染色及迅速获得的结果。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,56,、微波刺激免疫染色 免疫组化技术在病理诊断和研究中的应,、预先染色的切片免疫组化染色 对HE切片重新进行免疫组化染色，多采用于ABC方法，移去盖玻片后，用酸性乙醇对苏木素、伊红进行短时间脱色，随后针对性进行免疫染色，该法并不影响抗原检出。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,57,、预先染色的切片免疫组化染色 免疫组化技术在病理诊断,、复染 一般来讲免疫组化切片不需复染。但为了识别某些细胞的类型，复染是有用的。一般为轻微复染，常用于核复染的是苏术素和甲基绿，钴蓝B与甲基绿具有相似的性质，尤其适用于切片中将黑色素染成蓝-绿色，这使得DAB棕色原本难以区别的黑色素变得易于区别了。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,58,、复染 免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用58,十、蛋白酶解消化 10的缓冲甲醛是诊断实验室中最通用的固定剂，这种固定剂易使蛋白质产生交联，使抗原分子的抗原决定簇被掩饰，用蛋白酶对组织切片进行预处理，可以打开抗原分子间的交联，重建其免疫反应活力。蛋白酶的消化可以增加细胞和组织的，使抗原和抗体最大限度地结合。胰蛋白酶消化最早用于石蜡切片的免疫荧光染色，现已广泛用于免疫组化。除胰蛋白酶外，还有胃蛋白酶、水解酶和链霉菌酶等，牛胰蛋白酶，0.1%胃蛋白酶最为常用，消化的时间取决于抗原掩盖的强度，蛋白酶消化的时间与甲醛固定时间成正比32, 相比较乙醇固定的组织显示了较好的抗原保存，尤其是VimeNtiN，在乙醇中经不同时间长度固定后，免疫染色效果无明显区别。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,59,十、蛋白酶解消化免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用59,有学者指出固定于95乙醇和固定于甲醛-乙醇(90ml 80%乙醇，10ml浓甲醛和0.22g醋酸钠)中的组织抗原保存的相对范围相似，而固定于10甲醛的组织，其大量抗原将无法标记。乙醇除了可以较好的保存胞浆中VimeNtiN外，对于其它抗原并不是一种优越的试剂，而且乙醇固定的形态学，表现为组织皱缩，核染色质聚集及嗜碱性增强。在生理盐水中用微波辐射固定使组织直接经纯乙醇处理而避免这些缺点。胃蛋白作用强，但偏酸性，易造成组织结构破坏。抗原修复液胰蛋白酶一般用于细胞内抗原，膜抗原慎用。复合酶（胰蛋白酶为主）浓度增高，并含有稳定剂，PH7.2，主要用于细胞外间质抗原的检测。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,60,有学者指出固定于95乙醇和固定于甲醛-,适当的酶消化有助于减少背景染色而增强特定抗原的免疫反应，但可能会出现假阴性。也有些情况酶消化反尔产生背景染色及假阳性。过分消化会破坏细胞的完整性使抗原丢失，酶消化还易于引起掉片。可使用绿矾酸，ELMER凝胶和多聚赖氨酸等作为粘合剂来解决掉片这一问题。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,61,适当的酶消化有助于减少背景染色而增强特定抗原的,十一、免疫组化染色的质量保证 对于不同抗体的特异性、相似抗体克隆的不同来源、相似的克隆冠以不同名称出售、以及其它问题不断出现，强调了要认真制定一个诊断性免疫组化的质量保证，各种酶联抗体，显色剂，药盒等可以通过多种商业途径购得，目前已有300多种免疫试剂及抗体有售，不断增长的抗体数目，不断成为可商业购得的商品，却没有统一灵敏度及特异性标准。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,62,十一、免疫组化染色的质量保证免疫组化技术在病理诊断和研究中的,不同克隆所要检测的是相似抗原，相同抗原可作为浓缩形式或未稀释形式，还可作为培养基上清液，或即用型液体出售，同一商品可在不同分销商名下作为不同名称的商品出售，购买者所购买的试剂不必去证实制造商及分销商所声称的灵敏度和特异性，而且有趣的是所有商业抗体都标明“非诊断用”，但事实上这些抗体正是用于诊断这一目的。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,63,不同克隆所要检测的是相似抗原，相同抗原可作为,关于免疫组化染色的标准问题最初是由美国生物染色委员会(Biological staiN commissioN USA)的一项小研究而引发的，该组织评估了5家独立实验室针对3种多发性肿瘤块进行的单纯抗-角蛋白抗体染色，所报道的染色形式在所参加的5家实验室中有显著差别34，另一项关于乳腺癌中激素受体免疫染色在多家实验室的研究中也得到了不尽相同的结果。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,64,关于免疫组化染色的标准问题最初是由美国生物染,毫无疑问，免疫组化如能正确应用，确实是一种有力而又有用的诊断工具，它为外科病理学家提供了高水准的专业服务，补充了他们的观察技巧，拓宽了形态学诊断的潜能。为了保证免疫染色的高质量， 我们对切片处理方面的所有问题都应认真考虑与检查，以确保组织抗原的最佳保存。免疫组化在未完成之前无可靠的检测手段，染色结果常反复无常，这与许多因素有关，如抗原保存，蛋白酶消化，增强技术及对抗体的管理、使用和试剂的浓度，因此稳定质量的保持比其它的实验室技术更困难，除非进行大量的免疫组化操作，否则保持好的质量与取得合理的经验是很难的。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,65,毫无疑问，免疫组化如能正确应用，确实是一种有力而又有用的诊断,每次使用新抗体时都必须检测其最佳稀释度、使用免疫组化方法与组织固定等。但使用一些试剂盒或即用型试剂，可以减少上述麻烦，使用方便。但试剂盒也有其自身的缺陷，这些即用型已稀释过的抗体给人有一种方便与稳定的假象，某些试剂盒无法达到期望效果，但又难以将这些试剂定为假货。药盒即用型试剂由制造商设计成适合所有使用者，其试剂浓度并不是最佳浓度，因为各个实验室有不同的固定与组织处理方法，所以使用即用型试剂的结果常并不是最佳结果。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,66,每次使用新抗体时都必须检测其最佳稀释度、使用,免疫染色质量控制需要设置对照组，包括已知存在抗原的阳性对照组，如含抗原的正常组织，最好是使用含少量抗原的瘤组织作为对照，使与所检测切片中的抗原水平趋于一致，而且后者可能含有表达抗原的非瘤组织，可以作为内部对照。阴性对照，应用缺乏抗原的组织切片。空白对照，即采用非免疫血清，缓冲液，或其它无特异性的抗体（最好是同一免疫球蛋白的类型）以取代初级抗原的位置或用抗原预先吸附抗体而除去阳性染色，这常是可靠的对照，但由于该法不实用而未被常规使用。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,67,免疫染色质量控制需要设置对照组，包括已知存在抗,实验室在确定使用新抗体之前，使用者应该了解下列情况： 、确定对于所要研究抗原的最敏感抗体； 、检测抗体的最佳工作浓度； 、熟悉相关试剂的灵敏度、特异性、特别应了解哪些组织表达这些抗原，确定免疫染色的方法及细胞中的抗原分布，这将有助于确定阳性染色，特别是当细胞表达水平低时尤为重要 。,免疫组化技术在病理诊断和研究中的应用,68,实验室在确