免疫检测常用方法及运用秦伟课件.ppt

免疫检测常用方法及应用,肥城市人民医院检验科,秦,伟,免疫检测常用方法及应用肥城市人民医院检验科秦伟,免疫学检测方法是应用免疫学理论,设计的一系列测定抗原、抗体、补,体、细胞因子等免疫相关物质及微,量物质如激素、酶、血浆微量蛋白,、血液药物浓度、微量元素、毒品,等试验方法。,免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、补,这些方法所具有的特异性好、敏感,性高、简单、快速和稳定的特点为,临床上确定诊断、分析病情、调整,治疗方案和判断预后等提供有效的,实验依据，使它们在临床的应用进,一步普及和推广。,这些方法所具有的特异性好、敏感性高、简单、快速和稳定的特点为,凝集反应,(agglutination),颗粒性抗原,(,细菌、细胞等,),与相应的,抗体，或可溶性抗原,(,亦可用抗体,),吸,附于与免疫无关的载体形成致敏颗,粒与相应的抗体,(,或抗原,),，在有适量,电解质存在下，形成肉眼可见的凝,集小块。,凝集反应(agglutination)颗粒性抗原(细菌、细胞,凝集反应的分类,直接凝集反应,间接凝集反应,抗人球蛋白试验（,Coombs,试验）,凝集反应的分类直接凝集反应间接凝集反应抗人球蛋白试验（Coo,直接凝集反应,颗粒性抗原,(,细菌、细胞等,),与相应的,抗体在有适量电解质存在下，形成,肉眼可见的凝集小块。,常见的应用是血型的鉴定,直接凝集反应颗粒性抗原(细菌、细胞等)与相应的抗体在有适量电,血型鉴定示意图,血型鉴定示意图,间接凝集反应,将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当,大小颗粒性载体的表面，然后与相应抗,体（或抗原）作用，在适宜的电解质存,在的条件下，出现特异性凝集的现象称,间接凝集反应（,indirectagglutination,）,或被动凝集反应（,assiveagglutination,）,。,间接凝集反应将可溶性抗原（或抗体）先吸附于适当大小颗粒性载体,间接凝集反应,常用的载体微球有人,O,型血红细胞、绵羊,或家兔红细胞、聚苯乙烯乳胶、活性炭,/,甲苯胺红、明胶颗粒等,间接凝集反应常用的载体微球有人O型血红细胞、绵羊或家兔红细胞,间接凝集反应,正向间接凝集反应,反向间接凝集反应,间接凝集反应正向间接凝集反应反向间接凝集反应,正向间接凝集反应,用抗原致敏载体以检测标本中的相,应抗体,正向间接凝集反应用抗原致敏载体以检测标本中的相应抗体,正向间接凝集反应,胶乳凝集试验,所用载体颗粒为羧化的聚苯乙烯胶乳，,是一种直径约为,0.8m,大小的圆形颗粒，,带有负电荷，可物理性吸附蛋白分子。,将溶血素,O,吸附在羧化的聚苯乙烯胶乳,颗粒上检测抗”,O,”。,将变性,IgG,包被于羧化的聚苯乙烯胶乳颗,粒上检测,RF,。,正向间接凝集反应胶乳凝集试验所用载体颗粒为羧化的聚苯乙烯胶,正向间接凝集反应,RPR/TRUST,试验,血浆反应素试验,(RPR),所用载体颗粒为活性炭颗粒,甲苯胺红不加热血清反应素试验,（,TRUST,）,所用载体颗粒为甲苯胺红颗粒,正向间接凝集反应RPR/TRUST试验血浆反应素试验(RP,正向间接凝集反应,RPR,试验,正向间接凝集反应RPR试验,正向间接凝集反应,TRUST,试验,正向间接凝集反应TRUST试验,正向间接凝集反应,明胶颗粒凝集试验,所用载体为人工合成的惰性明胶颗,粒,梅毒螺旋体明胶凝集试验（,TPPA,）,肺炎支原体抗体检测（,MP-Ab,）,正向间接凝集反应明胶颗粒凝集试验所用载体为人工合成的惰性明,正向间接凝集反应,TPPA,试验,正向间接凝集反应TPPA试验,正向间接凝集反应,TPPA,试验,正向间接凝集反应TPPA试验,正向间接凝集反应,MP-Ab,试验,正向间接凝集反应MP-Ab试验,正向间接凝集反应,MP-Ab,试验,正向间接凝集反应MP-Ab试验,正向间接凝集反应,MP-Ab,试验,正向间接凝集反应MP-Ab试验,正向间接凝集反应,MP-Ab,试验,检测肺炎支原体的总抗体（,IgM, IgA,IgG),以滴度的方式报告检测结果（,1:80,1:80,、,1,：,160,、,1:320 ),正向间接凝集反应MP-Ab试验检测肺炎支原体的总抗体（Ig,反向间接凝集反应,用已知特异性抗体致敏载体以检测,标本中的相应抗原。,反向间接凝集反应用已知特异性抗体致敏载体以检测标本中的相应抗,抗人球蛋白试验,（,Coombs,试验）,抗人球蛋白抗体参与的间接血凝试,验，用于检测抗红细胞不完全抗体,分类：,直接,Coombs,试验,间接,Coombs,试验,抗人球蛋白试验（Coombs试验）抗人球蛋白抗体参与的间接血,直接,Coombs,试验,直接Coombs试验,间接,Coombs,试验,间接Coombs试验,凝集反应总结,一、直接凝集反应,血型鉴定,二、间接凝集反应,胶乳凝集试验,ASO/RF,1,正向间接凝集反应,RPP/TRUST,明胶颗粒凝集,TPPA/MP,2,反向间接凝集反应,三、抗人球蛋白试验,直接,/,间接,Coombs,试验,凝集反应总结一、直接凝集反应血型鉴定二、间接凝集反应胶乳凝集,酶联免疫吸附试验,（,ELISA,）,使抗原或抗体结合到某种固相载体表,面，并保持其免疫活性。,使抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或,抗体，且既保留其免疫活性又保留酶的,活性。,标本中的抗原或抗体、酶标抗原或抗,体按一定的次序与固相载体表面的抗体,或抗原反应，并通过底物与酶的反应来,反映标本中的抗原或抗体的量。,酶联免疫吸附试验（ELISA）使抗原或抗体结合到某种固相载,酶联免疫吸附剂试验,酶联免疫吸附剂试验,酶联免疫吸附试验,双抗体夹心法,双抗原夹心法,间接法,竞争法,捕获法测,IgM,抗体,酶联免疫吸附试验双抗体夹心法双抗原夹心法间接法竞争法捕获法测,ELISA,双抗体夹心法,用特异性抗体进行包被和制备酶标,抗体，以检测相应的抗原。,乙肝标志物中,HBsAg,、,HBeAg,的检,测常采用本法,ELISA双抗体夹心法用特异性抗体进行包被和制备酶标抗体，,ELISA,双抗体夹心法,ELISA双抗体夹心法,ELISA,双抗体夹心法,ELISA双抗体夹心法,ELISA,双抗原夹心法,用特异性抗原进行包被和制备酶结,合物，以检测相应的抗体。,抗,HBs,的检测,抗,HCV,的检测,抗,HIV,的检测,ELISA双抗原夹心法用特异性抗原进行包被和制备酶结合物，,ELISA,双抗原夹心法,ELISA双抗原夹心法,ELISA,竞争法,标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争,与固相抗原结合。如受检标本中无抗体,，则酶标抗体能顺利地与固相抗原结合,。加入酶标抗原后就显色深。如受检标,本中含有抗体，则与酶标抗体以同样的,机会与固相抗原结合，竞争性地占去了,酶标抗体与固相抗原结合的机会，使酶,标抗原与固相载体的结合量减少。加入,酶标抗原后就显色浅或不显色。,ELISA竞争法标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗,ELISA,竞争法,ELISA竞争法,ELISA,竞争法,最常见的应用：,乙肝,HBeAb,、,HBcAb,检测,ELISA竞争法最常见的应用：乙肝HBeAb、HBcAb检,ELISA,捕获法,（,1,）将抗人,IgM,抗体（抗人,IgM ,链抗体）连接在,固相载体上，形成固相抗人,IgM,。,（,2,）加入标本，,IgM,抗体被固相抗体捕获。洗涤除,去其他抗体。,（,3,）加入特异性抗原试剂，它只与固相上的特异性,IgM,结合，洗涤。,（,4,）加入针对特异性抗原的酶标抗体，形成固相二抗,IgM,抗体,抗原,酶标抗体复合物。,（,5,）加底物显色，如有颜色显示，则表示血清标本中,的特异性,IgM,抗体存在，是为阳性反应。,ELISA捕获法（1）将抗人IgM 抗体（抗人IgM ,ELISA,捕获法,以优生四项,IgM,抗体检测为例,ELISA捕获法以优生四项IgM抗体检测为例,ELISA,捕获法,甲肝,IgM,抗体测定,ELISA捕获法甲肝IgM抗体测定,ELISA,总结,酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性,，,几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可,用以检测。它的最小可测值达,ng,甚至,pg,水平。酶免疫测定标记试剂比较稳定,，且无放射性危害。因此，酶免疫测定,的应用日新月异，酶免疫测定的新方法,、新技术不断发展。,ELISA总结酶免疫测定具有高度的敏感性和特异性，几乎所有的,固相膜免疫测定,利用微孔膜（主要是醋酸纤维素膜）作为固相,进行免疫检测的方法,根据标记物的不同分为两类：,酶标固相膜免疫测定：,酶免疫斑点法,酶免疫印迹法,金标法：,胶体金斑点渗滤试验,胶体金免疫层析试验,固相膜免疫测定利用微孔膜（主要是醋酸纤维素膜）作为固相进行免,酶标固相膜免疫测定原理,酶标固相膜免疫测定原理,酶免疫斑点法,常应用于自身抗体的检测,酶免疫斑点法常应用于自身抗体的检测,酶免疫印迹法,酶免疫印迹法,胶体金斑点渗滤试验,胶体金斑点渗滤试验,胶体金斑点渗滤试验,胶体金斑点渗滤试验,胶体金免疫层析试验,金标双抗体夹心法测抗原,将试纸条下端浸入液体标本中，下端吸水材料即吸取,液体向上端移动，流经,C,处时使干片上的免疫金复合物,复溶，并带动其向膜条渗移。若标本中有待测特异抗,原，其时可与免疫金复合物之抗体结合，此抗原抗体,复合物流至测试区即被固相抗体所获，在膜上显出红,色反应线条（,T,）。过剩的免疫金复合物继续前行，至,参照区与固相小鼠,IgG,结合（免疫金复合物中的单克隆,抗体为小鼠,IgG,），而显出红色质控线条（,R,）。反之,，阴性标本则无反应线条，而仅显示质控线条,。,胶体金免疫层析试验金标双抗体夹心法测抗原将试纸条下端浸入液体,胶体金免疫层析试验,胶体金免疫层析试验,胶体金免疫层析试验,检测,HIV,Ab,的双抗原夹心法,胶体金免疫层析试验检测HIVAb的双抗原夹心法,金标法的应用,HCG,的检测,金标法的应用HCG的检测,金标法的应用,HBs-Ag,的检测,金标法的应用HBs-Ag的检测,金标法的应用,大便潜血试验（,FOB,）,金标法的应用大便潜血试验（FOB）,金标法的应用,轮状病毒和腺病毒抗原检测,金标法的应用轮状病毒和腺病毒抗原检测,金标法的应用,幽门螺杆菌（,HP,）抗原检测,金标法的应用幽门螺杆菌（HP）抗原检测,金标法的应用,O1,群霍乱弧菌检测,金标法的应用O1群霍乱弧菌检测,金标法的应用,HCV-Ab,检测,金标法的应用HCV-Ab检测,金标法的应用,艾滋病抗体金标检测,金标法的应用艾滋病抗体金标检测,金标法总结,上述两种试验的共同特点是：简便、快速、单份测定,、可立等结果，除试剂外无需任何仪器设备，且试剂,稳定。因此特别适用于急诊检验。,但这类试验不能准确定量，所以主要限于检测正常体,液中不存在的物质（例如诊断传染病中的抗原或抗体,）以及正常含量极低而在特殊情况下异常升高的物质,（如,HCG,等）。,虽然检测敏感性和特异性还不如,ELISA,高，但是检测的,项目越来越多和上述的特点使其应用越来越广泛。,金标法总结上述两种试验的共同特点是：简便、快速、单份测定、可,免疫检测常用方法及运用秦伟课件,