循环肿瘤细胞检测原理及其应用ppt课件.ppt
循环肿瘤细胞的检测原理及其应用,知行合一、经世致用,Central South University,自强不息 厚德载物,Tsinghua University of China,01,循环肿瘤细胞检测的背景与意义,Background and significance of the CTCs,知行合一、经世致用,Central South University,循环肿瘤细胞的发展（CirculatingTumorCells，CTCs）,自强不息 厚德载物,Central South University,恶性肿瘤远处转移是临床上实体恶性肿瘤治疗失败或复发的主要原因之一,循环肿瘤细胞的存在正是实体恶性肿瘤远处转移的根源,循环肿瘤细胞CTC,癌细胞从原位脱离 侵犯血液循环，在循环中存活 渗出进入远端器官 在继发部位增殖,研究意义：深入研究CTCs有助于对肿瘤转移机制进一步了解，为抗肿瘤转移的治疗提供新的依据；CTCs的检测有助于早期转移肿瘤患者的诊断、监测术后患者肿瘤的复发与转移；有助于评估抗肿瘤药物的敏感性与患者预后以及选择个体化的治疗策略；。,循环肿瘤细胞检测难点,循环肿瘤细胞检测难点,异质性,细胞表面抗原标志物表达差异携带不同的分子信息转移潜力差异,不同形态：单细胞CTC细胞团CTM血小板包裹的CTC,不同表型：上皮细胞表型间质细胞表型（经历EMT)混合表型,循环肿瘤细胞检测,自强不息 厚德载物,Tsinghua University of China,02,循环肿瘤细胞富集原理及方法,Principle and method of circulating tumor cell enrichment,自强不息 厚德载物,循环肿瘤细胞富集,目前对于CTCs的富集主要根据：物理特性（密度和体积）分子生物学特性（免疫磁性和浸润能力）,自强不息 厚德载物,基于物理性质的分离捕获方法,一、基于肿瘤细胞大小及机械性能分离原理：主要依赖于CTCs (1530m) 相对于血细胞 (811m) 有较大的体积因此, 多种微孔滤膜、尺寸/形变依赖的微流控芯片装置的方法得到了广泛研究,基于物理性质的分离捕获方法,二、基于细胞密度离心分离原理：基于血液中各种正常细胞与CTCs密度的差别，利用其在密度梯度介质（如Ficoll-Paque介质）中的沉降系数不同，将细胞悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力的作用，用分离液将CTCs与其它细胞层分离梯度分布：血浆成分单个核细胞（淋巴细胞、单核细胞、肿瘤细胞等）分离液中性粒细胞和最下层的红细胞,自强不息 厚德载物,基于物理性质的分离捕获方法,OncoQuick系统使用一种专用的50 mL试管，内置多孔屏障，其下为密度梯度分离液，使用时将标本置于屏障之上，从而避免在离心之前与分离液混合而污染,优点：操作简便、成本低不足之处：一般要求血量较大，15-30ml；缺乏特异性, 灵敏度也较低；CTCs迁移可能至血浆层、红细胞层和粒细胞；操作过程中易导致缺乏相应密度的肿瘤细胞丢失,自强不息 厚德载物,基于物理性质的分离捕获方法,三、基于细胞电学性能分离原理：细胞可被看作是一种电中性的但是可以被极化的电介质粒子。因此, 当细胞处于电场中时, 将产生电偶极矩，电偶极矩的大小和方向主要依赖于细胞的介电性能。不同的细胞具有不同的介电性能，这成为分离肿瘤细胞的依据在实际应用中, 当不同的细胞处于电场中时, 他们将受到不同的电场力。因此, 肿瘤细胞可以通过电旋转 (Electrorotation) 或者双向电泳 (Dielectrophoresis, DEP) 的方法得到分离富集,优点：血液中捕获肿瘤细胞的效率达到70%；无标记，细胞保存良好活性不足之处：细胞的介电性能会逐渐变化，必须在较短的时间内完成；承载介质的电导率必须适当的控制在一个较低的范围,基于分子生物学特性的分离捕获方法,免疫磁珠分离：最常见且有效地检测捕获脱落肿瘤细胞的方法阳性富集捕获肿瘤细胞负性筛选去除非肿瘤细胞（如白细胞、红细胞）,肿瘤细胞表面特异性抗原标志物的表达抗原-抗体特异性结合，理论上可以同时实现对肿瘤细胞捕获和检测。,自强不息 厚德载物,免疫磁性分离,自强不息 厚德载物,原理：CTCs具有某些特殊的生物标志物，包括上皮细胞粘附分子（Epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）、细胞角蛋白（Cytokeratin，CK）以及肿瘤特异性抗原因此利用肿瘤细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单克隆抗体相结合，继而在外加磁场中与磁珠吸附的细胞滞留在磁场中或定向移动到指定区域从而使肿瘤细胞得以从血液中分离出来,自强不息 厚德载物,免疫磁性分离,CellsearchTM系统/CTC芯片（CTC-chip）,芯片的表层分布了78 000个包被抗EpCAM抗体的微柱点血液样本流经芯片时，抗体与肿瘤细胞结合粘附在芯片上,自强不息 厚德载物,免疫磁性分离,优点：方便、有效；可获取较高纯度的肿瘤细胞；富集到具有完整的细胞形态不足之处：单克隆抗体昂贵；尚无具有普适性的肿瘤细胞表面抗原；敏感性一定程度上受到CTCs表面抗原表达的制约；CTCs经历上皮间质化过程(EMT)中，丢失EpCAM这些特异性的分子,03,循环肿瘤细胞鉴定原理及方法,Principle and method of identification of circulating tumor cells,自强不息 厚德载物,自强不息 厚德载物,Tsinghua University of China,CTCs的鉴定,自强不息 厚德载物,如何鉴定所获取的细胞为CTCs?,免疫细胞化学技术（ICC）,逆转录聚合酶链反应（RTPCR）,流式细胞术（FCM）,定量聚合酶链反应（qPCR）,自强不息 厚德载物,Tsinghua University of China,免疫细胞化学技术（ICC）,自强不息 厚德载物,原理是以显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和细胞化学呈色反应，对相应抗原进行定位、定性和定量的技术。目前选择的循环肿瘤细胞的相关抗原包括EpCAM、上皮角质蛋白（CKs）、上皮细胞膜特异性抗原、肿瘤相关糖蛋白（TAG）或特异性标志物（如HER2、抗乳球蛋白等）,CTC的免疫荧光染色特性：EpCAM CK DAPI CD45 白细胞的免疫荧光染色特性：EpCAM CK DAPI CD45,优点：在于肿瘤细胞膜未被破坏，可以进行细胞大小和形态学分析不足之处：肿瘤细胞表面抗原表达的不均一性，在一定程度上降低了检测的敏感性,荧光染料,荧光染料,自强不息 厚德载物,Tsinghua University of China,自强不息 厚德载物,Central South University,流式细胞术（FCM）,原理：根据白细胞表达CD45抗原、CK阳性CTCs表达EpCAM，采用不同荧光素标记的抗CD45和抗EpCAM，通过流式细胞术分析和分选CK阳性细胞的CTC（CD45- EpCAM+）,优点：可在检测的同时进行细胞形态、DNA倍数分析不足之处：需要的血液样本量大；缺乏规范的临床操作方法；肿瘤细胞表面抗原表达的不均一性，在一定程度上降低了检测的敏感性,自强不息 厚德载物,Tsinghua University of China,自强不息 厚德载物,逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）,原理：是基于组织或肿瘤特异性mRNA的表达或某些基因改变后DNA水平的异常，这些mRNA不表达于正常外周血细胞，所以在外周血中检测到特异mRNA可以间接提示CTCs的存在。,优点：灵敏度高、可重复性好、价格低廉不足之处：mRNA不稳定；需破坏CTCs，无法计数及形态学观察；取样时上皮细胞污染、肿瘤标志物在外周血的非正常表达可造成假阳性,04,CellSearch系统在循环肿瘤细胞检测中的应用,The CellSearch system and its application,自强不息 厚德载物,自强不息 厚德载物,自强不息 厚德载物,1983 磁流体,CellSearch CTC 检测技术发展历程,自强不息 厚德载物,Tsinghua University of China,自强不息 厚德载物,CellSearch检测技术的基本原理,检测外周血循环中的上皮源性的循环肿瘤细胞,循环肿瘤细胞表型EpCAM+ and Cytokeratins 8, 18+, and/or 19+CD45-完整的细胞上皮源性细胞碎片也会被捕获到，但并不会被计数,EpCAM 上皮细胞粘附分子 APC 异藻蓝蛋白荧光染料 CK 细胞角蛋白 PE 藻红蛋白荧光染料DAPI 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DNA荧光染料）,自强不息 厚德载物,Tsinghua University of China,自强不息 厚德载物,知行合一、经世致用,Central South University,CellSearch系统概览,第一个标准化，自动化的循环肿瘤细胞捕获计数平台,自强不息 厚德载物,Tsinghua University of China,自强不息 厚德载物,知行合一、经世致用,Central South University,CellSearch自动样本处理过程,自强不息 厚德载物,Tsinghua University of China,自强不息 厚德载物,知行合一、经世致用,Central South University,CellSearch自动化结果分析,系统自动将被捕获的、经过染色的细胞置入MagNest 装置的样本盒中由于 MagNest 的磁场作用，捕获的靶细胞将移动至样本盒的分析表面，形成单细胞层系统自动分析后得到结果并由操作人员进行最终判读,自强不息 厚德载物,Tsinghua University of China,自强不息 厚德载物,知行合一、经世致用,Central South University,CellSearch检测结果,CTCs： DAPI + CK- PE+ CD45- APC-,自强不息 厚德载物,Tsinghua University of China,自强不息 厚德载物,知行合一、经世致用,Central South University,CellSearch CTC 检测结果 Cutoff 值,基线 CTC 检测结果大于等于5个细胞病人预后不好，总生存期和无进展生存期较短基线 CTC 检测结果小于5个细胞的病人预后良好，总生存期和无进展生存期较长此 Cutoff 值基于临床研究实验得出，并已被 FDA 和 CFDA 批准用于临床实践,临床应用转移性癌症的监护无进展生存期总生存期未来: 疾病管理,自强不息 厚德载物,Tsinghua University of China,自强不息 厚德载物,知行合一、经世致用,Central South University,CellSearch系统,优势：在临床试验中该系统能够具有良好的可重复性，敏感性和特异性：比传统的影像学手段（如CT）能更早发现问题；而且比其他的血液检测（如蛋白类血清肿瘤标记物）有更好的特异性和灵敏性；已经被大量的临床试验证明可以有效预测无进展生存期和总生存期；真正实现实体肿瘤的无创实时监控；.,不足之处：1、CellSearch存在着技术上的缺陷，捕获方式局限性很大，漏检率较高;2、CellSearch获取结果单一，下游应用受限;目前CellSearch系统只具有从外周血液中富集CTC，然后对其计数的功能3、独家垄断，价格高昂,
