第二章 生物酶解技术ppt课件.ppt

,第二章 生物酶解技术,细胞壁的层次,胞间层（中层）(middle lamella):果胶类物质组成，具强的亲水性和可塑性。初生壁(primary wall)：细胞生长过程中，原生质分泌，有纤维素、半纤维素和果胶，还含有酶和糖蛋白。次生壁(secondary wall)：细胞停止生长，原生质产生的壁物质沉积在初生壁内侧。由纤维素、半纤维素和木质素构成。分内层(S3)、中层(S2 )和外层S1 )。,生物酶解技术在中药提取中的应用,细胞壁的化学组成,纤维素(cellulose): 由葡萄糖分子串联而成。结构单位：微团(micelle) 、微纤丝(microfibre) 、 大纤丝(macrofibre) 纤维素的网络结构中交联半纤维素和果胶类物质。,目前，生物酶技术在现代中药提取中正展示着其独特的优势，引起了许多企业和科研单位的关注，并已经开始了在这一领域的探索和应用。世界上广泛开展了有关酶的性质的研究，至今已从动物，植物中发现了两千多种酶，并有两百多种酶已得到结晶。,第一节 概述,一、 酶的概念,酶的概念酶是由生物细胞产生的以蛋白质为主要成分的生物催化剂。,生物体内的反应是在很温和的条件（如温和的温度、接近中性的pH）下进行的，而同样的反应若在非生物条件下进行，则需要高温、高压、强酸、强碱等剧烈的条件。,酶的专一性,每一种酶只能催化一种或一类的化学反应,酶的催化效率是无机催化剂的107 1013 倍,酶的高效性,酶的作用条 件较温和,酶所催化的反应一般是在比较温和的条件下进行的。,第二节酶反应的特点与影响酶活性的因素一、酶反应的特点,酶活力:是酶促反应的能力。酶活力大小就是指在一定条件所催化的某一化学反应速度的快慢，即酶催化的反应速度越快，酶活力越高，反之则表示该酶活力低。,二、酶活力与酶单位,酶的定量并非对其蛋白质进行定量，而是对它的催化能力进行定量。,所以，酶的定量就是测定酶的活力，也即测定酶促反应的速度。,1. 酶活力概念,A.国际单位 (U),这种单位是由国际酶学委员会规定的。,在标准条件(25、最适pH、最适底物浓度)下，酶每分钟催化 1 mmol 底物转化，这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为1个国际单位 (IU)。,2. 酶活力与单位,指每毫克酶蛋白所含的酶活力单位数,比活力是酶制剂纯度的常用指标 比活力越大，表示酶越纯,比活力 ,酶活力单位数（U）,酶蛋白质量（mg）,3. 酶的比活力,三、影响酶活性的因素,酶解提取中药有效成分，均有较高收率，具有较大应用潜力，但该技术也存在着局限性。酶法提取对生产条件要求较高，为使酶发挥最大作用，并将其用于工业化时，必须综合考虑酶的浓度和底物浓度，温度，pH，作用时间等对提取物的影响。,温度对酶反应速度的影响具有双重性：,1. 温度对酶反应速度的影响,因此，在这双重因素的综合作用下，酶促反应具有一最适温度。,四. 温度对酶反应速度的影响,不同酶的最适温度也不一样。动物酶的最适温度一般在3540，植物酶为4050。 酶的最适温度并非酶的特征性常数，它与底物、作用时间等因素有关。,2. pH对酶反应速度的影响,H对酶反应速度的影响较大。其原因有：,每种酶只能在一定的pH范围内表现出它的活性，且在某一pH值范围内活性最高，其两侧活性都下降。 酶促反应具有一最适pH。,反应速度和pH的关系见下图：,酶的最适pH一般在7左右。也有很多例外，如胃蛋白酶的最适pH只有1.5，木瓜蛋白酶(5.6) ，胰蛋白酶(7.8)。酶的最适pH并非酶的特征性常数，它与底物的种类、浓度等因素有关。,2. pH对酶反应速度的影响,对于简单的酶反应，当酶浓度和其他条件恒定时：,Vmax,零级反应,一级反应,混合级反应,该曲线可以用米氏方程 来描述,3.底物浓度的影响,4.酶浓度对酶反应速度的影响,在一般的酶促反应中，常常SE，酶反应速度达到最大反应速度。 当SE，由于Vmax=kE0，反应速度与酶浓度成正比。,酶浓度曲线,某些物质能使酶的活性增强，成为酶的激活剂，某些物质能使酶的活性降低，成为酶的抑制剂。再如一些金属螯合剂如EDTA（乙二胺四乙酸）等能除去重金属离子对酶的抑制作用，也可视为酶的激活剂。,5. 激活剂对酶反应速度的影响,激活剂：能提高酶活性的物质。,无机离子： 主要是金属离子，它们有的本身就是酶的辅助因子，有的是酶的辅助因子的必要成分。 如: 激酶需要Mg2+激活 唾液淀粉酶需要Cl-激活,主要的激活剂有：,5. 激活剂对酶反应速度的影响,有机小分子： 一些还原剂，如抗坏血酸、半胱氨酸，使含-SH的酶处于还原态 金属螯合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)，可络合一些重金属杂质，解除它们对酶的抑制，从而使酶活升高。,抑制作用：有些物质与酶结合后，引起酶的活性中心或必需基团的化学性质发生改变，从而使酶活力降低或丧失。,6. 抑制剂对酶反应速度的影响,第三节 生物酶辅助提取中药成分的机制,酶解破壁,有效成分的提取,纤维素酶解提取,原理,内切葡聚糖酶纤维素酶 纤维素二糖水解酶 -葡萄糖苷酶 甘露聚糖酶半纤维素酶 -木聚糖酶 -葡萄糖苷酶 -甘露糖苷酶 -木聚糖苷酶果胶酶 聚-1,4半乳糖醛酸的聚糖水解酶 果胶质酰基水解酶,酶解优点,第 四节 生物酶解辅助提取条件优选,一、酶辅助提取条件的优选 植物根茎类药材纤维素酶种子药材纤维素酶、半纤维素酶花类、果类选用果胶酶动物药材蛋白酶（一）酶的种类,1.酶对有效成分的影响催化水解酶(纤维素酶）对苷类药材的影响P48,2.复合酶的作用,由于植物组织细胞壁的多样性，有时采用复合酶，但由于复合酶的作用广泛应考虑对有效成分的多重影响。 有效成分含量明显超过单一酶 复合酶 综合作用 有效成分含量低于单一酶,复合酶解法提取三七皂苷结果比较,提取方法 皂苷含量(%) 平均纤维素酶解法 9.46 8. 78 9.46 9.23果胶酶酶解法 8.90 8.64 9.16 8.90复合酶解法 11.26 11.38 10.97 11.17,（二）酶解温度,温度升高加速化学反应但酶的本质是（ ）所以温度超过一定范围（ ）所以对同一种酶在一定温度范围内活性随（ )升高而（ ）。对于对不同药材酶的最适合的温度可以通过实验考查来确定。,方法,固定酶的用量，作用时间，酶解液的PH值等相同的条件，将酶解液分成若干份，分别控制不同的温度进行酶解反应，测定代表性的有效成分为考查指标，根据含量多少确定最合适的酶解温度,实例1.苦荞茎叶粉中总黄酮酶法提取工艺研究,总黄酮的UV法测定法,标准曲线的制备:将芦丁于120烘箱中烘于干燥器中冷,却后称至恒重，称取50mg用70%乙醇溶解,定容至250mL,得0.200mg/mL芦丁对照品溶液。准确吸取芦丁对照品溶液0、3.0、6.0、9.0、12.0、15.0mL于50mL量瓶中,加入5%NaNO2溶液15mL,摇匀,放置6min后加入10%Al(NO3)3溶液15mL,摇匀,放置6min后加入4%NaOH溶液20mL,再用70%乙醇定容,摇匀,以70%乙醇为空白参比,10min后用1cm比色皿于510nm测定吸光度,得芦丁的回归方程: Y=0.0749A+0.0022(R2=0.9961)。苦荞茎总黄酮的测定:准确称取2.50g苦荞茎叶粉,于250mL三角瓶中,加入50mL水,按试验设置的处理条件,在不同的加酶量、酶解温度和pH值条件下,酶解不同的时间,然后升温至90提取,离心去沉淀,用70%乙醇定容至200mL,作为待测液。取3mL待测液于50mL量瓶中,按照标准曲线的制备项下方法测定吸光度,计算总黄酮的质量,并计算总黄酮得率(总黄酮得率=提取液中总黄酮质量/苦荞茎叶粉质量100%)。,单因素考查法（一）温度,（二）酶用量,酶解温度55，pH6.5酶解2小时纤维素酶,（三）酸碱度,固定纤维素酶的量，酶解温度，时间2h，考查pH影响。,（四）酶解时间,固定：纤维素酶量，酶解温度55pH6.5考查不同时间,二、酶解技术的工艺设计,实例1.苦荞茎叶粉中总黄酮酶法提取工艺研究1.酶解液黄酮成分测定2.正交实验设计,由表中可知，各因素对提取效果的影响顺序依次为AB C即酶解温度酶解时间达到极显著水平（P0.05）最佳工艺组合为A2B2C3,直接水提和酶法水提效果比较,在酶解辅助提取过程中，酶的种类、酶解温度，酶解时间及酸碱度各因素的影响不是孤立的，而是相互影响的，所以要在单因素考查的基础上，通过正交试验综合考虑，以获得更好酶解提取效果。,第五节 酶解技术在中药提取中的应用,一、酶解技术在中药成分提取中的应用（一）多糖实例2.甘草多糖的酶辅助提取运用正交设计法设计酶法提取工艺，采用分光光度法测定多糖含量。【结果】酶法提取甘草多糖的最佳工艺是温度40、pH值5.0、加酶量5gkg(-1)、提取时间5h。提取率3.29%酶法提取甘草多糖速度快，提取率高。,多糖的酶及超声联合提取,采用正交试验,优化玉米须多糖的酶及超声提取方案,并研究这两种方案的结合效果.结果三种提取工艺中联合提取多糖得率最高,酶辅助提取次之,超声提取最低.结论联合提取是一条高效的提取路线.方法 超声 酶法 酶法-超声时间（min) 20 170 190多糖含量 % 2.878 5.697 7.720,（二）生物碱,生物碱一般采取方法？酶法辅助提取率比传统方法显著增加，生物碱结构无（ )键，不存在被酶水解问题。实例3.贝母生物碱酶辅助提取工艺研究（1）酶解条件单因素考查,（2）酶解条件正交试验,pH,温度,由极差分析得到各因素对提取效果的影响度:ADBC,由此可见,酶解温度为主要因素,酶解时间为次要因素,其次是pH值,而酶用量的影响最小。因此得到最佳提取条件:提取温度为60,pH值为45,酶用量为2.5g/L,提取时3.5h,验证试验:按原醇提取工艺进行3次试验,同时根据正交试验优选结果对酶解工艺进行3次重复试验,结果见表3。可见,两工艺重现性良好,但是加酶工艺比不加酶收率提高了3.92%。,二、酶解技术在中药成分转化中的应用研究证明,白藜芦醇具有抗菌、抗癌、抗炎、抗过敏、降血脂和抗氧化等多方面的药理活性,是目前研究较热门而有希望的抗癌药剂之一。 白藜芦醇在虎杖中主要以苷的形式存在,因此,作者考虑将白藜芦醇苷转化成白藜芦醇苷元,这将大大提高白藜芦醇的得率。（虎杖提取用乙醇）,同样酶解技术可以用于提取黄酮类，皂苷类，苯丙素类，有机酸类，蛋白质类，挥发油。,1. 采用纤维素酶解法新工艺提取虎杖中白藜芦醇。即在乙醇提取前,先用纤维素酶处理虎杖粗粉。通过实验确定最佳的提取工艺条件为:提取温度50,酶解pH值5.0,酶解时间90min,纤维素酶与虎杖粗粉配比为1500。与传统醇提工艺相比,提取率提高了近5倍。,2.人参的有效成分为皂苷类，其中在红参与野山参中仅为十万分之几的人参皂苷Rh2等稀有成分，对肿瘤细胞具有凋亡等作用，对人体无毒且具有较高的保健功能。但人参皂苷Rh2结构复杂，以化学方法制备的难度高、污染大、收率低。金凤燮采用皂苷酶处理人参中常见组分Rb、Rc、Rd等二醇类皂苷生产Rh2等稀有皂苷。酶处理生产Rh2等的转化率在60以上，比从红参中直接提取提高了500700倍。,三、酶解技术在中药提取液精制与纯化的应用,中药水提液含有多种类型的杂质，如淀粉、蛋白质、鞣质、果胶等。采用常规提取法时，煎煮过程中药材里的蛋白质遇热凝固、淀粉糊化，影响有效成分煎出，分离困难。针对中药水提液中所含的杂质类型，采用相应酶将其降解为小分子物质或分解除去，可解决上述问题，并改善中药口服液、药酒等液体制剂的澄清度，提高成品质量。,例： 采用木瓜蛋白酶对中药材(茯苓、牡丹皮)煮出液中的蛋白质进行降解。结果表明，在pH 5.5、45的最佳酶解条件下，茯苓和牡丹皮的浊度分别降低了14和25。,展望,通过酶工程技术可在温和条件下对药效成分进行高选择性转化，不仅能克服工业常用提取方法中提取率低、工序复杂等问题，还能提高提取体系的澄清度、改变药材质地，同时可以在提取中改变原有天然成分结构，增加提取物的生理活性。且耗能低，降低生产成本，减少环境污染。因此，酶工程技术对中药有效成分的提取具有潜在的工业应用价值。,今后研究的主要方向应集中在：一、酶在中药提取过程中，对中药提取效率及生成产物的控制；二、一些重要中药化学成分的酶转化及合成；三、建立酶提取中药产物药理活性的快速筛选；四、酶反应产物结构的快速测定；五，特殊活性酶的筛选。总之，酶技术应用为开展中药生产和研究提供了新的机会和方法，应该加强酶技术在中药基础和应用上的研究。,存在问题,酶法提取对实验条件要求较高，为使其发挥最大作用，需先经实验确定最适反应条件，如温度、pH及作用时间等。还需综合考虑酶及底物浓度、抑制剂和激动剂等对提取物的影响。酶反应个别目标成分的变化。酶与非目标产物的残留酶制剂的标准,国际酶学委员会，根据各种酶所催化反应的类型，把酶分为6大类，即氧化还原酶类，转移酶类，水解酶类，聚合酶类，异构酶类和连接酶类。此外，DNA合成技术的迅速发展为酶的遗传设计开创了令人鼓舞的美好前景。只要有遗传设计蓝图，就能人工合成酶基因，从而合成某一类酶。酶遗传设计的主要目的是创造优质酶，用于生产昂贵特殊的药品以满足人们的特殊需要。,酶的分类,(一)pH值对酶活性的影响 酶的活性受环境pH的影响极为显著，通常各种酶只有在一定的pH范围内才能表现出它的活性。一种酶表现其最高活性时的 pH值称为该酶的最适pH。高于或低于最适pH值时，酶的活性降低。酶的最适pH值受酶的纯度、底物的种类和浓度、缓冲液的种类和浓度以及环境温度等条件影响。 (二)温度对酶活性的影响 每种酶都有其最适温度，高于或低于此温度酶的活性都降低。一般而言，若酶处于过高的温度环境中，会使酶活性永久地丧失；而若处于极低温度的环境中只会使酶活性受到抑制，一旦温度适宜，酶又会全部或部分地恢复其活性。,(三)酶浓度对酶促反应速度的影响 在其它条件不变的情况下，若反应物浓度大大高于酶浓度时，则反应速度随酶浓度增加而增加，两者间成正比关系，即：V=kE 但若反应底物浓度较低，而且酶的浓度足够高时，增加酶浓度，反应速度基本不变。 (四)离子对酶活性的影响 就唾液淀粉酶而言，低浓度Cl一可以增加酶活性，高浓度的Cl一或者低浓度的Cu2+则会抑制酶的活性，而低浓度的Na+、SO42-等对酶活性没有影响。不同的酶对不同的离子具有不同的效应。,酶的定义酶是由生物细胞产生的，受多种因素调节控制的具有催化能力的生物催化剂。与一般催化剂相比有其共同性，但又有显著的特点，酶的催化效率高，具有高度的专一性，酶的活性受多种因素调节控制，酶作用条件温和，但不够稳定。,酶的分类国际酶学委员会，根据各种酶所催化反应的类型，把酶分为6大类，即氧化还原酶类，转移酶类，水解酶类，聚合酶类，异构酶类和连接酶类。此外，DNA合成技术的迅速发展为酶的遗传设计开创了令人鼓舞的美好前景。只要有遗传设计蓝图，就能人工合成酶基因，从而合成某一类酶。酶遗传设计的主要目的是创造优质酶，用于生产昂贵特殊的药品以满足人们的特殊需要。,酶的最佳温度及最佳pH值往往在一个很小的范围内，为使酶的活性提高到最大值，必须严格控制酶反应时的温度及pH值，反应条件的微小波动，都可能是酶的活性大大降低，因此对实验设备有较高的要求。酶法提取过程中，有可能改变中药中某些成分，产生新的化学物质，从而影响产物的纯度及得率。,许多天然植物中含有蛋白质，采用煎煮法时蛋白质遇热凝同，影响提取成分的煎出，如加入蛋白酶，就可以将天然植物中的蛋白质分解析出，如此可提高成分的提取率。天然植物水提液除了含有提取成分外，还含有淀粉、蛋白质、果胶、树胶、树脂、黏液质等，这些成分的存在往往使提取液呈混悬状态，并影响提取液的滤过速度，为此要实施除杂，常用的方法有离心法、澄清剂法、醇沉法、大孔树脂吸附法、离子交换法、微孑L滤膜滤过法及超滤法。而酶法除杂是分离精制的新方法，此方法是根据天然物提取液中杂质的种类、性质，有针对性地采用相应的酶，将这些杂质分解或除去，以改善液体产品的澄清度，提高产品的稳定性。,酶技术应用现状酶具有催化效率高。作用专一性强和催化条件温和等特点，用于工业可提高生产率，降低耗能，改善劳动条件，减少污染，简化工艺程序，还可以生产出其他方法难以得到的产品。20世纪90年代中期以后我国也陆续有研究报道将其用于中药的提取制备中，并取得较好的效果。,细胞壁的化学组成,木质素(lignin): 大分子聚合物，增加细胞壁的硬度，分布于具有支持作用、机械作用的细胞的细胞壁中。角质(cutin)、栓质(suberin)和蜡质(wax)等脂肪类物质,中草药成分复杂，有活性成分，也有如蛋白质，果胶，淀粉，植物纤维等非活性成分，这些成分既影响植物细胞中活性成分的浸出，又影响中药液体制剂的澄清度，可选择相应的酶予以分解除去。,B. Katal,是由国际酶学委员会于1972年规定的一种新单位,在最适条件下，酶每秒钟催化1 mol 底物转化，这样的速度所代表的酶的活力即酶的量定义为 1个Kat 。,1 Kat = 60106 IU,2. 酶活力与单位,