常规石蜡制片HE染色技术ppt课件.ppt

光镜下观察组织标本需克服的几个问题,如何保持组织标本取材前的形态？ 如何制备薄组织片，允许光的通过而便于 观察？ 如何使不同组织结构具有不同的光折射 率，便于对标本进行结构的仔细辨别？,光镜标本的基本制作技术,第二章,光镜样本的基本制作技术（组织制片技术）是医学研究和生物学研究中，观察细胞、组织的正常或病理形态变化的一种必不可少的手段，借此可以弥补活体观察的不足 同时光镜样本的基本制作技术也是其它光镜标本技术的基础,取材 固定 漂洗 脱水 透明 浸蜡 包埋 切片 脱蜡 染色 脱水 透明 封片,光镜样本的制作的基本过程,第一节 取材及固定,医学研究的组织样本来源 人体（最好） 临床的活检组织 尸检组织 （取材方法及注意事项按病理学要求进行） 正常组织 用正常动物的组织材料替代,一、动物致死法,动物的福利，3R原则 动物致死法选择 致死动作应迅速,1断头法 2击头法 3麻醉法4股动脉放血法 5空气栓塞法,动物致死方法,细胞标本制备,1. 印片法 2. 穿刺法 3. 沉淀法 4. 培养细胞标本制备,二、取材及注意事项,1材料保持新鲜2组织块免受挤压3组织块力求小而薄 4尽量保持组织的原有形态5选取好组织块的切面 6动物品种的选择和熟悉取材的解剖位置7切除不需要的部分8保持材料的清洁,三、组织固定法,固定是使要观察的组织构造尽量接近它取材前的状态,（一）固定目的 1标本不发生离开身体后或死后变化 2随后处理中，标本不易损坏 3. 组织块硬化 4使组织内各种结构产生不同的折光 率，或对染料具有不同的亲和力,（二）固定方法 1蒸气固定法（较细小而薄的标本） 2小块组织固定法（直接投入固定液中） 3注射、灌注固定法（体积过大或固定 液极难渗入内部的组织标本） （1）局部灌注固定（肺、肝、肾、脑等） （2）全身灌注固定 （小鼠、大鼠、兔、 狗、猴、人） 4. 微波固定法,灌注过程 充分暴露心脏 针尖插入左心室或升主动脉中 快速灌注生理盐水 剪开右心耳（或右心房）放血 换灌固定液，先快后慢输入,用量 1. 生理盐水 大鼠需用80-100ml、兔150-200ml、 猫200-250ml、猴300-500ml、 狗800-1000ml 2. 固定液 动物血液量的2倍 动物体重（g）7%20（ml）,无论是局部灌注固定，还是全身灌注固定，在灌注完毕后，必须立即将组织块、器官或整个动物再放入同样的固定液中进行后固定,1组织块不宜过大 2软组织或较大块组织可先经23小时固定后，再修整成小块重投入新配制的固定液内继续固定 3固定液的量是组织块大小的5-20倍为宜，在固定组织的瓶底垫上脱脂棉、数层纱布或滤纸 4固定时间的长短视固定剂的种类、温度、组织块的大小而定,（三）固定注意事项及影响因素,1甲醛（福尔马林）：商品甲醛的浓度是37% 40%的甲醛水溶液。常用甲醛的固定液浓度是10%，而实际甲醛浓度只有4% 固定小块组织(15152mm)10小时左右 经它长期固定的组织，需经2448小时的自来水流水冲洗,四、固定液 （一）单纯固定液,甲醛单纯固定液的常用配方 10%甲醛水溶液 37%-40%甲醛液 10ml 自来水或蒸馏水 90ml 10%甲醛生理盐水溶液 37%-40%甲醛液 10ml 氯化钠 0. 85g 自来水或蒸馏水 90ml,2多聚甲醛：一种渗透速度极快的甲醛聚合物，在热水中可解聚成甲醛单体而溶解，在接近水的沸点时溶解极快；也可溶解于弱碱中。多聚甲醛溶液实际上是新配制的甲醛液，宜临用前配制,4%多聚甲醛单纯固定液的常用配方 多聚甲醛 4g 蒸馏水（或0.2 mol/L PB） 50ml 在通风橱内加热使之完全溶解，然后冷却 0.2 mol/L PB（或蒸馏水） 100ml,3戊二醛：一种常用的醛类固定剂，能较好的保存组织结构，但其穿透力弱，作为单纯固定液多用于电镜技术中。市售的戊二醛是25%的溶液，使用时需配制成1%6%的不同浓度,4酒精：单纯固定液为80%95%的浓度，不必水洗而直接脱水。多用于组织化学中的糖原固定 酒精固定的组织易变硬和发脆、组织收缩较大，所以不易长时间停留其中（70%酒精除外） 可作为配制混合固定液的基本成分,5 其它固定液 丙酮 苦味酸 醋酸 重铬酸钾 三氯醋酸 铬酸 氯化汞 锇酸,用多种具有固定作用的试剂混合配制的固定液，达到各试剂在固定作用中具有的优缺点平衡目的,（二）混合固定液,常用混合固定液,1酒精-甲醛液（A-F 液） 95%或无水酒精（A） 90ml 37%40%甲醛液（F） 10ml 2Carnoy液 冰醋酸 10ml 氯仿 30ml 无水酒精 60ml3Bouin 液 饱和苦味酸水溶液 75ml 甲醛液（37%40%） 25ml 冰醋酸 5ml,4Helly 液 重铬酸钾 2.5g 升汞 5g 蒸馏水 100ml （以上是Helly储存液） 甲醛液(37%40%) (临用时加入) 5ml 51%多聚甲醛-1.25%戊二醛固定液 多聚甲醛 1g 蒸馏水 50ml 在通风橱内加热使之完全溶解，然后冷却 25%戊二醛 5ml 0.2 mol/L PB（pH 7.4） 100ml,第二节 固定后处理及切片,一、组织修整 固定结束后，将受挤压或不需要的部分组织修切或整形，同时选择好包埋面，称组织修整。修整可在冲洗前、也可放在冲洗后,二、组织洗涤,洗去渗入组织内的固定液，再进行下一步骤的操作；否则会妨碍染色效果，或引起沉淀、结晶而影响观察，也可能会继续发生化学反应造成后道操作困难 1水洗涤法：凡用水配制、或含铬、锇等的固定液所固定的组织块，需用水洗涤 2酒精洗涤法：凡用酒精、或酒精混合液、或含有苦味酸等固定液固定的组织块，多采用酒精洗涤,三、组织脱水,（一）脱水意义与脱水剂 因水和石蜡不能相溶，而组织经固定及水洗后含有水分，所以不能直接用石蜡进行包埋。需用某些溶剂逐步置换组织块中的水分，称脱水 脱水剂必须具有下列特性：1）脱水剂能与水按任意比例混合；2）脱水剂高浓度时不含水分；3）脱水剂也能与透明剂按任意比例互相混合,脱水剂中最常用的是酒精。 一般从70%酒精开始脱水，逐步升高酒精浓度；脱水时间根据组织块的种类、大小、及使用的固定液种类等因素而定,70%酒精 25小时(可长期保存组织) 80%酒精 25小时 90%酒精 25小时 95%酒精（） 25小时 95%酒精（） 25小时 无水酒精（） 30分钟 无水酒精（） 30分钟 无水酒精（） 30分钟,（二）脱水步骤和时间 以18mm18mm，厚约23mm的组织块 为例，其脱水步骤和参考时间如下,（三）脱水注意事项 1组织脱水必须掌握由低浓度逐步 过渡到高浓度的原则 2脱水时间要适度 3组织脱水要彻底干净,四、透明,（一）透明意义及透明剂 组织脱水后，内部仅含脱水剂，但大多数脱水剂不能与石蜡相溶，石蜡仍不能浸入组织内进行包埋和切片。为此，需要一种既能溶于脱水剂又能溶于包埋剂（石蜡）的溶剂，以便逐步将脱水剂置换成包埋剂。这一过程往往使组织呈半透明状，故称透明 二甲苯为石蜡包埋法中最常用的透明剂；它透明能力强，但易使组织收缩、变脆，故组织块的透明时间不宜太长，小组织块以30分钟为宜，较大组织块适当延长但不超过2小时,（二）透明步骤和时间 为了减少组织块过度收缩，往往在无水酒精之后，先经过酒精和二甲苯的混合液，然后再浸入纯二甲苯中 透明步骤和时间大致如下 1无水酒精:二甲苯=1:1 2030分钟 2二甲苯（） 2030分钟 3二甲苯（） 2030分钟,（三）透明注意事项 二甲苯必须保持无水 组织块脱水过程要彻底,五、浸蜡,（一）浸蜡目的 浸蜡是将透明过的组织块在熔化的石蜡中浸渍的过程。目的是用石蜡代替组织块中的二甲苯，在随后温度下降中，使较软的组织块变成有一定硬度的组织蜡块，以便切片机切片,第1杯熔蜡(软蜡)(熔点54以下) 1小时 第2杯熔蜡(硬蜡)(5860) 1小时 第3杯熔蜡(硬蜡)(5860) 30分钟 整个浸蜡时间控制在3小时之内 浸蜡在恒温箱中进行，且恒温箱温度高 于石蜡熔点 23,（二）浸蜡的步骤,（三）浸蜡注意事项 1浸蜡最佳温度应是石蜡刚熔化、或蜡杯底部 尚残留小部分未熔完蜡时的温度 2浸蜡中一般采用浸蜡篮浸蜡法，把组织块和 标签一齐装入分格篮内浸蜡 3石蜡应在加热的条件下过滤除去杂质 4浸蜡用的石蜡要定期更换 5新石蜡应在使用前放在温箱内熔化一次，使 其中的挥发性物质蒸发 6包埋结束后应将熔蜡从温箱内取出，以免 石蜡无益地加温熔化,六、包埋（石蜡包埋法）,（一）包埋目的及包埋剂 包埋是将某些特殊的支持物质浸入到组织块内部，利用支持物质的物理特性，将整个组织加以包埋，最后凝固成均匀一致的较硬固态结构，以便切片机制备极薄切片 石蜡是组织学切片技术中最常用的包埋剂,（二）包埋过程 1取预热包埋框及金属板，搭成包埋模具 2. 迅速倾注少量熔蜡于包埋框中 3. 从蜡杯中夹取组织块，切面向下置于框底 4. 加熔蜡至包埋框上缘 ，将标签纸紧贴旁边 5. 表面熔蜡凝结至一定厚度时，慢慢浸入冷水 中（夏天用冰水）急速凝固 6. 凝结蜡块自动漂浮于水面，或30分钟后推开 包埋框，取出蜡块。 7. 修块,（三）包埋注意事项 1包埋蜡的熔点选择 2石蜡脆性大时，可加蜂蜡提高韧性 3包埋用石蜡和最后浸蜡的石蜡熔点要 相同 4包埋中组织块间要有一定距离 5石蜡凝固要快速,七、切片,（一）石蜡切片机及切片刀 1石蜡切片机 最常用的石蜡切片机是轮转式切片机，它的切片刀固定不动，而靠右侧旋转的重轮带动螺纹轴和齿轮，将组织块夹具按所调节的切片厚度向前推进，并在上下平面运动，让组织块经过前下方切片刀而切成一定厚度的切片,2切片刀与磨刀 石蜡切片常用的切片刀为平楔型切片刀，也有一次性切片刀 非一次性使用的切片刀在切片前需要研磨，以保持其锋利；研磨刀可分为手工研磨刀和机械研磨刀（磨刀机）两种,（二）石蜡切片过程 1修块 2蜡块和切片刀固定 3调整蜡块切面和切片刀角度(10以内) 4. 调整刀台与标本台距离 5. 修整蜡块切面，暴露完整组织切面 6. 调整切片厚度调节器(厚度为68m) 7. 正式切片 8切片展平 9贴片和烘片,（1）切片碎卷状：脱水、透明或浸蜡时间长、浸蜡温度高 （2）蜡片卷曲：刀口不锋利或脏、刀角倾斜过度、石蜡过硬 （3）切片不成蜡带：室温低、石蜡过硬、蜡块上下边过小或 不平 （4）蜡带弯曲：蜡块的两侧大小不等、刀口不锋利 （5）切片皱褶：石蜡过软、浸蜡不完全、刀的倾斜角度过小 （6）切片厚薄不均：刀口不锋利、切片机性能不佳、刀架或 刀或蜡块未固定牢 （7）切片出现纵纹：刀刃有缺口、石蜡或组织的硬度不一 （8）切片出现横纹：蜡块、刀或刀架未固定好 （9）切片粘刀：刀锋沾污、刀的倾斜角度过小、刀口不锋利 （10）蜡块底边呈白色：刀的倾斜角度过小 （11）切片粘蜡块：刀纯、刀口不洁、室内温度高、太干燥,（三）切片过程中常遇问题及可能造成原因,第三节 苏木素-伊红染色方法,染色是将组织浸入染料配制的染色液中，使组织中的不同结构染上不同颜色或不同深浅的颜色，从而产生不同的折射率，便于在光镜下清楚地显示组织内部各种构造,染料是一类有色的以苯环为基础的有机化合物，它不同于一般颜料，因为它不但有颜色，更重要的是它对组织的不同成份具有不同的亲和力。构成染料至少必须有两种原子团连接于苯环上，即能使染料显色的原子团-发色团和能使染料对不同组织具有不同亲和力及加深颜色的原子团（酸、碱性基团）-助色团,分类 细胞核染料有天然染料苏木素、胭脂红及人工合成的染料结晶紫、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、焦油紫等 细胞质染料有人工合成的伊红Y、酸性复红、苦味酸、水溶性苯胺蓝等,媒染剂为有些二价或三价金属物质，如铝、铁、铜、钨等可作为中介媒体物质，使原来几乎不与组织结合或结合能力很弱的部分染料（尤其是天然染料）着色；它主要是通过增加染料对组织中某一成份的亲和能力，自身又与染料或组织发生结合而发挥作用,助染剂（促染剂）与媒染剂不同，它只加强染 料的染色能力，而自身不参与染色反应 分化剂（脱色剂、分色剂）用于退行性染色 法中脱去组织过染的染料，降低着色颜色 酸性分化剂 0.51%的盐酸酒精（95%以 下）或较稀的冰醋酸水溶液 氧化分化剂 苦味酸、铬酸、重铬酸钾、 过锰酸钾等 媒染分化剂 既能促使组织和染料结合， 又可使已经结合到组织上的染料脱离,一、苏木素-伊红染色的基本原理,苏木素和伊红染色是组织学中常规制片中最基本，也是应用最广泛的染色方法，故称常规染色（简称HE染色）,苏木素（或苏木精）是一种天然的染料，易溶于酒精而微溶于水，是较好的细胞核碱性染料，并可将细胞中不同的结构分化出各种不同的颜色；苏木素分子须经氧化形成苏木红分子，才具有真正的染色能力；同时须配合适当的媒染剂以增强它对组织的亲和力，达到染色目的 伊红（或曙红）是人工合成的煤焦油类染料，红色粉末状，易溶于水或酒精，为酸性细胞胞质染料；有伊红Y、B、BN等，常用的是伊红Y。伊红常作为苏木素的对比染色染料，染色中常需加助染剂和分化剂，使染色效果更加好,二、苏木素-伊红染液的配制,（一）苏木素染液 一种是将氧化剂（如氧化汞、高锰酸钾、过氧化氢或碘酸钠等）与媒染剂（硫酸铝铵、硫酸铝钾或硫酸铝铁等）直接混合于苏木素中配成溶液 另一种是先用媒染剂媒染组织结构，再用氧化的苏木素（自然氧化）染色，最后用媒染剂分色,Harris苏木素染液 苏木素 1g 无水酒精 10ml 硫酸铝钾（或硫酸铝铵） 20g 蒸馏水 200ml 氧化汞 0.5g,Mayer苏木素液 苏木素 1g 蒸馏水 1000ml 碘酸钠 0.2g 硫酸铝钾 50g 枸橼酸钠 1g 水合氯醛 50g,醇溶性伊红染液 伊红Y 0.5g 95%酒精 100ml 水溶性伊红染液 伊红Y 0.5-1g 蒸馏水 75ml 95%酒精 25ml 冰醋酸 12滴,（二）伊红染液,（三）分化液,去除过度染色或不需要着色的组织成份上颜色的过程，叫分色所使用的试剂配制的液体称为分化液而苏木素的分化过程中，使酸性条件转变成碱性条件，苏木素染色的结构也由红色转变成蓝色，所以这一过程又称蓝化,1氢氧化铵水溶液（pH 7.5-8.0 ） 氢氧化铵（氨水） 3ml 蒸馏水 1000ml 21%盐酸酒精溶液 盐酸 1ml 70%酒精 99ml,三、石蜡切片染色中脱蜡、水洗、 脱水和透明等的作用,石蜡 去石蜡 去二甲苯 水化 颜色 二甲苯 酒精 水 染液 透明 脱水 水分 二甲苯 酒精,四、染色程序,（一）脱蜡至水 石蜡切片 冰冻切片 1二甲苯（） 5分钟 2二甲苯（） 5分钟 3无水酒精（） 5分钟 4无水酒精（） 5分钟 595%酒精 5分钟 680%酒精 1分钟 770%酒精 1分钟 8自来水 2分钟 3分钟 9蒸馏水 1分钟 1分钟,（二）染色 石蜡切片 冰冻切片 1苏木素液 5-15分钟 1-2分钟 2自来水洗 1分钟 30秒 3酸性分化液（镜下控制） 30秒 20秒 4自来水蓝化 20分钟 20秒 5稀氨水 30秒 6. 蒸馏水 10秒 20秒 770%酒精 3分钟 3分钟 880%酒精 3分钟 3分钟 9沉淀酸化伊红乙醇液 30秒 30秒,（三）脱水、透明和封片 石蜡切片 冰冻切片 195%酒精（） 1分钟 1分钟 295%酒精（） 1分钟 1分钟 3无水酒精（） 5分钟 3分钟 4无水酒精（） 5分钟 3分钟 5无水酒精（） 5分钟 3分钟 6无水酒精+二甲苯（1:1） 5分钟 3分钟 7二甲苯（） 5分钟 3分钟 8二甲苯（） 5分钟 3分钟 9二甲苯（） 5分钟 3分钟 10中性树胶封片,五、染色注意事项,1染色前需烘烤切片，并立即进行染色 2切片脱蜡后，应保持切片在液体中，防止干燥。脱蜡温度应在25左右环境中进行，时间可适当延长 3获得好的染色效果，需选择合适的固定液和固定时间 4染色时间应根据染液的种类、新旧、组织种类、固定液种类及环境温度等而定 5苏木精染色后，分色和蓝化应在显微镜下进行，以细胞核染色清晰，而胞质等基本无色为佳,6伊红水溶液染色的切片，易被低浓度酒精脱水时洗掉。最好在脱水至95%酒精时，进行伊红乙醇液染色，然后脱水透明 795%酒精及无水酒精的脱水一定要彻底，若切片进入二甲苯时出现混浊或白色不透明，表明脱水不彻底，应重新退回到无水酒精中再脱水；如仍不透明，则应更换无水酒精 8透明时间要保证，可用石碳酸-二甲苯进行透明 9封片的盖玻片要大于切片；封片剂滴加量适宜；避免气泡。封片后应在恒温箱中烘烤10小时,谢谢大家！,