细胞生物学实验 ——步骤集ppt课件.ppt
细胞生物学实验 步骤集,PEG促细胞融合法的步骤,（1） 取鸡血2ml+2ml Alsever液，再加入6ml Alsever液，混匀后制悬液。（可在4保存）（2）取(1)1ml+4ml 0.85%的NaCl溶液，进行以下三次离心处理： .1200 r/min离心5分钟。（去上清液，再加入至5ml的0.85%NaCl液） .10001200 r/min离心5分钟。（去上清液，再加入至5ml的0.85%NaCl液） . 10001200 r/min离心7分钟。（3）将上步最后一次的沉降血球（去上清液后，约0.10.2ml），加入GKN液至12ml，使之成10%的细胞悬液。（4）取上述10%的血球悬液1ml，加入3ml GKN液，使每毫升含血球15000000个，即 。（5）取（4）1ml+0.5ml 50%的PEG液，或取（4）0.5ml+0.5ml 50%的PEG液，或取（4）0.5ml+1.0ml 50%的PEG液，混匀滴片，在常温下23分钟后，镜下观察。,【细胞凝集反应实验步骤】,1.取土豆去皮块茎2克，加10mlPBS缓冲液，浸泡24小时，浸出的粗体液中即含有可溶性土豆凝集素。2.抽取兔子静脉血（加抗凝剂）1ml，加生理盐水3ml，在1000r/min条件下，离心5分钟。重复三次离心，最后按压积红细胞体积用生理盐水配成1%的红细胞悬液。3分别用滴管吸取土豆凝集素和1%的红细胞悬液各一滴，置双凹片的左孔内，充分混匀。4同时分别用滴管吸取PBS缓冲液和1%的红细胞悬液各一滴，置双凹片右孔内，充分混匀，作对照实验。5.摇晃5-10分钟后，观察有无发生细胞凝集并置显微镜下观察。,实验步骤苏丹染色法,断头法处死小鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，用镊提起小肠将盖玻片紧贴于肠系膜，并在其下部置一载玻片，用剪连同盖玻片和其上粘的肠系膜取下，滴加甲醛钙于有标本的载玻片处，使标本润湿，固定20分钟。吸蒸馏水滴入载玻片与盖玻片之间冲洗，用滴管不断吸去液体以去除固定液。用70%乙醇溶液代替蒸馏水重复步骤2的操作，再进行一次冲洗。用苏丹染色30分钟。吸去溢出染液，擦净盖玻片表面及周边，显微镜观察。,原代细胞(脾细胞）培养步骤,1.取材： 取小白鼠一只，采用断头法处死；清水洗小鼠并浸于75%酒精中灭菌3分钟。取出转入超净洁净台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔。取出脾脏，去除其周围的脂肪组织，镊起脾脏用PBS液自上而下冲洗12次。转入无菌玻璃培养皿中，待用。2分离脾细胞： 用滴管先向上述无菌玻璃培养皿中滴入PBS液30滴，再用“L”型针头注射器在皿中吸取PBS液0.2ml，然后将其沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。 用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”针头轻刮脾脏表面挤出脾细胞，用滴管吸皿中的PBS液冲脾脏并吹散刮出的脾细胞，稍倾斜并静置12分钟。 吸取上述静置后的脾细胞悬液上清部分放入Eppendorf管，并使量至1ml，以3000转/分离心12分钟。3培养脾细胞： 超净洁净台中取塑料培养皿一个，用“枪（1ml）”加入细胞培养液2ml，并在皿盖上画上标记，待用。 取上述离心后的Eppendorf管，在超净洁净台内开盖弃去上清液，用“枪（200l）”吸取塑料皿中的培养液400ml加入弃去上清液的Eppendorf管中，用枪头吹匀管底的脾细胞，然后吸取200ml脾细胞悬液接种于上述塑料培养皿中，混匀，然后放入37、5%CO2培养箱中培养。,细胞生死状态的鉴别台盼蓝（Trypan Blue）法,（1） 试剂配制：用生理盐水配制0.4%台盼蓝染液，备用。（2） 细胞悬液制备：将生长有贴壁型细胞的培养瓶（皿）中的培养液倒入干净试管中，向培养瓶（皿）中加入0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA混合消化液l2ml,静置35min，待见到细胞变圆，彼此不连接为止，弃去混合消化液并将上述试管中的培养液倒回培养瓶中，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。（3） 染色制片：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合，2min后制成临时装片，镜检。（4） 染色结果：死细胞染成蓝色，活细胞不着色。或者，（3） 染色计数：取0.5ml细胞悬液放于干净的试管中，加1-2滴（约0.1ml）染液，混合25min，滴加少许染色后的细胞悬液于放有盖片的血球计数板的斜面上，使悬液自然充满计数板小室。注意不要使小室内有气泡产生，否则要重新滴加。在普通光镜10X物镜下计数四个大格内的细胞数，压线者数上不数下，数左不数右。（4） 根据染色结果计算活细胞率：依据死细胞染成蓝色、活细胞不着色的原则计数死细胞数和细胞总数，以如下公式计算细胞存活率：,II. 伊红Y（Eosin Y）法（1）试剂配制：用生理盐水配制0.15%伊红染液，备用。（2） 细胞悬液制备：将生长有悬浮型细胞的培养瓶（皿）稍微倾斜，用滴管轻轻吹打细胞，制成细胞悬液。（3）染色制片：取上述细胞悬液少许，然后加入其等体积量的0.15%伊红染液，混合，2min后制成临时装片，镜检或计数。（4）染色结果：死细胞染成桃红色，活细胞不着色。III. 美蓝（Methvlene Blue）染色法（1） 试剂配制：用蒸馏水配制0.1%美蓝染液，备用。（2） 染色制片：在干净的载玻片中央加一小滴0.1%美蓝染色液，然后再加一小滴酵母菌悬液，混合均匀，染色35分钟后从液滴侧面盖上盖玻片并吸去溢出的液体，制成水浸标本片，镜检或计数。（3）染色结果：死酵母菌细胞染成蓝色或淡蓝色，活酵母菌细胞不着色。,细胞生死状态的鉴别,a.平面图(中间平台分为两半，各刻有一个方格网)b.侧面图(中间平台与盖玻片之间有高度为0.1毫米的间隙),使用血球计数板直接计数时，先要测定每个小方格(或中方格)中的细胞数量，再换算成每毫升液体中细胞的数量。 每毫升液体中细胞的数 = 每个大方格中的细胞数量 10000 稀释倍数,叶绿体分离的步骤,1.选取新鲜嫩滤菠菜叶,去叶梗及粗脉,洗净擦干，称30克放于150ml 0.35M.Nacl 溶液中；2.将叶、液同装入组织捣碎机中，匀浆35分钟，转速5000r/min；3.将匀浆用纱布(6层)过滤于500ml 烧杯中；4.取滤液4ml在1000r /min 下离心2min；5.取上层清液在3000r /min下离心5 (沉淀为叶绿体和细胞核混合物)；6.将沉淀用2-3ml 0.35Mnacl 液悬浮；7.取一滴悬液滴片，加盖片后显微镜下观察；8.另取一滴悬液滴片，再滴加一滴0.01%的吖啶橙染料，混匀，盖上盖片，在荧光显微镜下观察。,小白鼠肝细胞线粒体超活染色的步骤,1 、用断头法处死小白鼠，置于解剖盘中，剪开腹腔，取小白鼠肝 组织，选取边缘较薄的肝组织0.5cm3，放入小烧杯中，用Ringer液 冲洗去血污。 2、在干净的凹面载玻片的凹穴中, 滴加1/5000詹纳斯绿B溶液，再将肝组 织块移入染液中，注意不可将组织块完全淹没，要使组织块上面部分 半露在染液外，这样细胞内的线粒体酶系可充分得到氧化，易被染色。 当组织块边缘被染成蓝绿色即成(般需染2030min)。 3、吸去染液，用眼科剪将组织块着色部分剪下重置小烧杯中，滴加 Ringer溶液0.5ml，用剪刀充分剪碎制悬液。 4、取上述细胞悬液滴片，加盖玻片，高倍镜下观察。 结果：肝细胞质中的线粒体被染成蓝绿色（黄绿色）。,小白鼠染色体标本制作步骤,取雄性小鼠以每克体重4注射秋水仙素，经1416小时后，断头法杀死小鼠，取出睾丸用生理盐水（0.9%的NaCl）洗去血污。放入装有1ml 0.3%KCl液的小烧杯中剪碎至呈乳白色。用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3%KCl液至4ml。37静置30分钟，进行低渗处理。以8001000转/分离心8分钟。弃上清液，加入2ml甲醇冰醋酸固定液（3：1），并用吸管至管底吹气，轻轻打散细胞，固定8分钟。再以8001000转/分离心8分钟。弃上清液，加1ml固定液，再制成细胞悬液，固定5分钟。取洁净的低温预冷载片，距载片1015cm高度滴下23滴细胞悬液，从载片一边向另一边轻轻吹气，并同时轻轻敲打载片，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。用滤纸擦去载片上多余液体，空气干燥或成文火干燥。,染色体标本染色与观察,用 Giemsa染色20 30分钟，细水冲洗玻片背面，去多余染液，气干。镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下观察染色体形态并计数。,人外周血染色体标本制备,(一)细胞培养 1培养基的配制： 在超净工作台中，100ml培养基含以下成分和比例： RPMI-1640 84ml 小牛血清 15ml PHA 3支 肝素钠 1ml 卡那霉素 终浓度为100单位/ml 以5% NaHCO3(无菌)或1N HCl调pH至7.2-7.4。 用刻度吸管将培养液分装入培养瓶(10ml/瓶)，4备用。 2采血：酒精消毒皮肤，肘静脉采血0.3-0.5ml，立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向10ml培养基中注入30-40滴全血，轻摇匀后置37恒温箱培养。 3培养：时间为68小时。培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。 4秋水仙素处理：终止培养前2-4小时，在培养液中加入秋水仙碱(用1ml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0.07g/ml)。 以上步骤均需无菌操作。 (二)染色体制备 1收集细胞：将培养物全部转入洁净离心管中，以1000rpm离心8-10分钟，弃上清液。 2低渗处理：向刻度离心管中加入预温37的低渗液8ml，用滴管混匀，置37恒温水浴中低渗15-25分钟。 3预固定：低渗后加入0.5mlCarnoys固定液，轻轻混匀后1000rpm离心8-10分钟。 4一固定：弃上清液，加入5ml固定液，轻轻混匀，静置20分钟。1000rpm离心，弃上清液。 5二固定、三固定：同一固定。 6制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。 7滴片：吸取细胞悬液自10-20cm高滴在一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，气干。 8染色：1:10 Giemsa染色5-10分钟，细水洗去多余染液，气干。 9镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，油镜下观察染色体形态并计数。,染色体组型实验的步骤,1. 选择染色体清晰的照相底片，用放大机制作出放大10倍的清晰照片。2. 将染色体逐一剪下，并对每个中期染色体逐一进行测量，包括每条染色体的长度和每个臂的长度。3. 根据测量数据，计算出每对染色体平均的相对长度、臂指数与着丝粒指数。4. 把相对长度与臂指数相近者配成一对。5. 参照相对长度、臂指数与着丝粒指数的数值，并根据标准顺序，编排出染色体组型图。6. 用胶水或浆糊将每条染色体依照标准顺序粘贴在实验报告纸上。,人类体细胞染色体的分类标准及其主要特征,小鼠的转基因技术录像,Procedure1. Dissection of oviducts. Recovery of fertilized eggs. Removal of cumulus cells.Procedure2. Recovery of 8-cell embryos. Removal of the zona pellucida. Construction of aggregation chimeras.Procedure3. Dissection of uteri. Recovery of blastocycsts.Procedure4. DNA injection into pronuclei to produce transgenic embryos.Procedure5. Nuclear transfer.Procedure6. Blastocyst injection of embryonic stem cells.Procedure7. Vasectomizing male mice.Procedure8. Oviduct transfer of manipulated embryos.Procedure9. Vterine transfer of manipulated embryos.Procerdure10. Recovery of 6.5 and 7.5 day embryos.Procerdure11. Dissection of midgestation 12.5 day embryos and fetal membtanes.,细胞膜通透性实验的步骤,1.取鸡血6mL，加0.85%NaCl溶液4mL，在1000r/min条件下离心5分钟。（RBC压积量不少于0.6mL）2.将上述离心的红细胞按沉淀量配成50%浓度。（总体积应不少于1.2mL）3.每组取6支试管，分别加入如下溶液各3mL：（1）0.85%NaCl溶液 （2）0.085%NaCl溶液（3）0.8 mol/L （0.32 mol/L等渗）甲醇溶液 （4） 0.8 mol/L （0.32 mol/L等渗）丙三醇溶液（5）6% （ 5%等渗）葡萄糖溶液 （6）2 % （1.5 %等渗）Triton X-1004.向上述6支试管中分别加入50%红细胞悬液1滴，轻摇混匀，观察试管中是否有溶血现象发生（观察时间1小时），记录溶血时间，并于显微镜下观察各溶液中的细胞。,【甲基绿派洛宁法实验步骤】,1取蟾蜍（蟾蜍破髓，仰位剪去下颌、舌头）制备血涂片，干燥后滴加70%的乙醇溶液固定10分钟，晾干。2滴染色液于血膜上，染15分钟。（或在染色缸中）3蒸馏水冲洗，去染液。4向染色液血膜滴加95%乙醇溶液分色、同时倾斜载片弃液体，晾干。5. 观察。,
