细胞内细胞因子染色法ppt课件.ppt

细胞内细胞因子染色法,中山医学院免疫学教研室,实验原理,细胞因子跨膜分泌阻滞剂BFA，使新产生细胞因子滞留在细胞内；破膜剂使荧光抗体可以进入细胞内，并可以检测相应细胞因子；流式细胞记数技术可以记数细胞，分析相应细胞的质和量。,方法特点,1. 单细胞水平计数 2. 简单、快捷、灵敏3. 实验结果客观,实验过程,取淋巴细胞，刺激剂作用，37孵育1小时 加入BFA继续培养5小时，用PBS洗涤。4%多聚甲醛室温固定8分钟后，PBS洗涤。,重悬细胞， 4放置几小时或过夜。加入荧光标记抗体, 4避光30分钟，洗涤。 缓冲液2重悬，流式细胞记数仪检测。 结果分析,需要的缓冲液,1. 1PBS 1升（洗细胞用）2. PBS +0.1%BSA+NaN3 0.05% 500ml(用于染色后FACS前)3. PBS+BSA+NaN3 +0.1%Saponin 250ml(封闭染色后用)4. PBS +BSA+NaN3+Saponin+5%milk 40ml,流式细胞仪（FLOW CYTOMETER，FCM）,对于处在流动状态的细胞或生物颗粒进行多参数的快速的定量和分析的技术。,检测仪器：流 式 细 胞 记 数 仪,FCM结构组成部分,液流系统; 将细胞引导至检测位点光学系统;产生并收集光学信号 电子系统;将光信号转换成电信号,使之数字化,输入计算机并分析。细胞分选系统。,FLOW CELL(流动室),荧光信号,每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号,荧光染料的特性,激发波长(EXCITING)发射波长(EMISSION),激发光源与荧光标记物,前向角散射光信号,侧向角散射光信号,检测信号,双参数点图,标本制备,标本来源:外周血、骨髓、培养细胞、组织(经尼龙网300目过滤) 制成单细胞悬液标本浓度：106/ml-外周血白细胞计数，白血病人血标本需PBS稀释抗凝剂：EDTA、肝素-若抗凝不佳，有凝块，则不可检测。溶血剂：保持细胞形态、红细胞裂解完全。反应温度：2627C，室温避光。,结 果 示 范,1.56,0.25,8.23,0.26,左图显示在抗原刺激前，CD4+和CD4-细胞中能产生IFN-的细胞占PBMC的0.25%和1.56%右图显示在抗原刺激后，CD4-细胞中能产生IFN-的增加到8.23%，提示该抗原能促进CD4-细胞分泌IFN-,