细胞生物学 线粒体和叶绿体ppt课件.pptx

第一节 线粒体与氧化磷酸化 第二节 叶绿体与光合作用 第三节 线粒体和叶绿体的半自主性及其起源,本章主要内容,第一节 线粒体与氧化磷酸化一、线粒体的基本形态及动态特征（一）线粒体的形态、分布及数目呈颗粒或短线状，直径为0.31.0 m,长度为1.53.0 m.分布与细胞内的能量需求密切相关；线粒体的数目同样呈现动态变化并接受调控与细 胞类型相关，随着细胞分化而变化。,第一节 线粒体与氧化磷酸化,动、植物细胞中均可观察到频繁的线粒体融合与分裂现象，这被认为是线粒体形态调控的基本方式，也是线粒体数目调控的基础。,（二）线粒体的融合与分裂,5.1.1.3 线粒体融合与分裂的分子及细胞学基础,线粒体融合与分裂的分子基础：,融合与分裂依赖于特定的基因和蛋白质的调控。融合所必需的基因最早发,现于果蝇，取名Fzo,（fuzzy onion 模糊地葱头） Fzo基因编码一,个跨膜的GTPase（鸟苷三磷酸酶），定位在线粒体外膜上，介导线粒体的融合。,“模糊的葱头”与跨膜大分子GTPase（Fzo）的模式结构：（WT）野生型果蝇精细胞发育过程中,线粒体融合形成的大体积球形线粒体。（fzo）突变体中聚集但不融合的小线粒体。（OM）线粒,体外膜；（IMS）膜间隙；（IM）线粒体内膜。Bar = 2微米。,（三）线粒体融合与分裂的分子及细胞生物学基础,1.分裂的分子生物学基础, 线粒体分裂依赖特定的基因和蛋白质来调控, 线粒体分裂需要发动蛋白（dynamin）, dynamin类蛋白是一类大分子GTPase,发动蛋白（dynamin）组装和驱动线粒体分裂的模式图,2. 线粒体融合与分裂的细胞生物学基础, 线粒体分裂环（mitochondrial division ring）, 分裂的三个阶段：早期；中期；后期,Nishida K et al. PNAS 2003;100:2146-2151,电子显微镜下观察到的线粒体分裂装置：（a）研究线粒体和叶绿体分裂装置的经典实验,材料，红藻细胞的荧光显微照片（DNA特异性探针DAPI染色）及细胞内线粒体与叶绿体分,裂模式图。红藻细胞含一个线粒体和一个叶绿体。在细胞增值过程中，叶绿体（红色自发,荧光）率先启动分裂，随后线粒体启动分裂，最后细胞核分裂。红色的环状结构示线粒体,和叶绿体的分裂环。（b）电子显微镜下观察到的分裂环平环切面。在3张连续切面（黑白,叠加后生成的图片（彩色）上，可以同时观察到线粒体分裂环（大箭头）及叶绿体分裂环,（小箭头）。（c）线粒体分裂环的垂环切面。在分裂环的断面上，可以观察到电子密度,较高的外环（大箭头）及电子密度相对较低的内环（小箭头）。,二、线粒体的超微结构,（一） 外膜,（二） 内膜,（三） 膜间隙,（四） 线粒体基质,二、线粒体的超微结构,人淋巴细胞线粒体（A）、拟南芥幼叶线粒体（B）,的超微结构及超微结构模式图,三、线粒体的立体结构,（一）外膜单位膜结构，厚约6 nm。外膜中蛋白质和脂质约各占50%，外膜上分布的孔蛋白构成的桶状通道，可根据细胞的状态可逆性地开闭，能够可以通过相对大分分质量的分子。由于外膜的通透性很高，膜间隙中的离子环境几乎与胞质相同。 外膜的标志酶是单胺氧化酶,（二）内膜单位膜结构， 厚68 nm。内膜有很高的蛋白质/ 脂质比（质量比31），缺乏胆固醇，富含心磷脂，这种组成决定了内膜的不透性。线粒体内膜是氧化磷酸化的关键场所，内膜向内延伸形成嵴，嵴上存在许多规则排列的颗粒，称为线粒体基粒即ATP 合酶，内膜的标志酶是细胞色素氧化酶。,（三）膜间隙宽约68 nm。膜间隙内的液态介质含有可溶性的酶、底物和辅助因子。腺苷酸激酶是膜间隙的标志酶，可催化ATP 分子末端磷酸基团转移到AMP生成ADP。,（四）线粒体基质富含可溶性蛋白质的胶状物质。催化线粒体重要生化反应，如三羧酸循环、脂肪酸氧化、氨基酸降解等还含有DNA、RNA、核糖体以及转录、翻译所必需的重要分子。,（一）氧化磷酸化的分子结构基础,超声波,线粒体,亚线粒体小泡或颗粒,胰蛋白酶,颗粒解离，只能传递电子，而不能发生磷酸化,颗粒重新装配上,电子传递和氧化磷酸化,电子传递的组分位于线粒体的内膜，颗粒是氧化磷酸化偶联的因子,线粒体内膜在超声波作用,下形成亚线粒体小泡,ATP合酶分子结构模式图,ATP 合酶的分子由球形的头部和基部组成，头部朝向线粒体基质，规则性地排布在内膜下并以基部与内膜相连。,ATP 合酶的头部被称为偶联因子1（F1），由5 种类型的9 个亚基组成，形成一个“橘瓣”状结构,其中只有 亚基具有催化ATP 合成或水解的活性。F1 的功能 是催化ATP 合成， 亚基的一个结构域构成穿过F1 的中央轴。 亚基协助 亚 基附着到ATP 合酶的基部结构F0 上。与 亚基结合形成“转子” ，旋转于3 3 的中央，调节3 个 亚基催化位点的开放和关闭。,ATP 合酶的基部结构被称作F0， F0 是一个疏水性的蛋白复合体，嵌合于线粒体内膜，由a、b、c 3 种亚基组成跨膜的质子通道。多拷贝的c 亚基形成一个环状结构。a 亚基和b 亚基形成的二聚体成的环的外侧。 同时，a 亚基、b 亚基及F1 的 亚基共同组成“定子” ，也称外周柄。,结合变构机制 质子驱动ATP合成的过程, 质子梯度的作用是使ATP从酶分子上解脱下来。 ATP 合酶上3个催化亚基以3 种不同的构象存在，从而使它们对核苷酸具有不同的亲和性; ATP 通过旋转催化而生成。旋转的动力来自于 F0 质子通道中的质子跨膜运动。,（二）质子驱动力线粒体内膜上的电子传递为膜间隙与基质间的质子电化学梯度提供了基础。质子则借助高能电子释放的能量被不断地定向转运到膜间隙。ATP合酶在质子流的推动下实现分子内“转子”的转动，驱动ATP的生成。,线粒体产能（ATP）原理, 电子传递的过程中，内,膜上的电子传递复合物,将基质中的质子转运至,膜间隙，形成ATP 合酶,工作所需的质子梯度, 能量转换实质上 是把质,子驱动力转换为ATP 分,子中的高能磷酸键,三羧酸循环,第一阶段丙酮酸、脂肪酸的生成第一阶段丙酮酸氧化脱羧生成乙酰辅酶A第三阶段乙酰CoA进入三羧酸循环彻底氧化 乙酰CoA+草酰乙酸 柠檬酸 + CoA-SH 柠檬酸 异柠檬酸（第1次氧化脱羧） 异柠檬酸+NAD+ -酮戊二酸 +CO2+NADH+H+-酮戊二酸 + CoA-SH+ NAD+琥珀酰CoA + CO2 + NADH+H+（第2次） 琥珀酰CoA + GDP + Pi 琥珀酸+ GTP + CoA-SH（底物磷酸化） 琥珀酸 + FAD 延胡索酸 +FADH2延胡索酸 + H2O 苹果酸 苹果酸 + NAD+ 草酰乙酸 + NADH+H+2,草酰乙酰生柠檬, 顺乌异柠 酮, 琥酰琥珀延胡索, 苹果落回草丛中.,（三）电子传递链由电子载体组成的电子传递序列被称为电子传递链（electron transport chain），也称作呼吸链（respiratory chain）。参与呼吸链的载体有：黄素蛋白、细胞色素、泛醌、铁硫蛋白和铜原子,复合物：NADH-CoQ 还原酶（NADH 脱氢酶）,复合物：琥珀酸-CoQ 还原酶（琥珀酸脱氢酶）,复合物：细胞色素氧化酶（Cyt c 氧化酶）,在医学上，由线粒体功能障碍引起的疾病被称为线粒体病（mitochondrial disease）。 已知的人类线粒体病有100 多种，常见的有脑坏死、心肌病、肿瘤、不育、帕金森综合征等。克山病亦称地方性心肌病 硒是谷胱甘肽过氧化物酶的一个组成成份，该酶的主要作用是还原脂质过氧化物，清除氧自由基从而保护了细胞膜的完整性Leigh 综合征 亚急性坏死性脑脊髓病 线粒体基因突变导致的线粒体病呈单纯的母系遗传氧自由基的过度积累 农业生产中广为利用的细胞质雄性不育 。,四、线粒体与疾病,四、线粒体与疾病,mtDNA,mtDNA突变,编码呼吸链复合体蛋白的部分多肽链,影响氧化磷酸化,ATP生成减少,致病,聋,盲,痴呆,肌无力,糖尿病等,第二节 叶绿体与光合作用,一、叶绿体的基本形态及动态特征 （一）叶绿体的形态、分布及数目在高等植物的叶肉 细胞中，叶绿体呈凸透镜或铁饼状，直径为510 m， 厚24 m。分布在细胞质膜与液泡间薄层的细胞质中，呈平层排列。通常情况下，高等植物的叶肉细胞含20200 个叶绿体。,叶绿体的形态、分布及数目,叶绿体通过位移避开强光的行 为称为躲避响应在光照 较弱的情况下，叶绿体会汇集到细胞的受光面，这种行 为称作积聚响应叶绿体在细胞内位置和分布受到动态的调控称为叶绿体定位,高等植物成熟叶片叶绿体体积与数目相对保持稳定，但细胞内的叶绿体仍呈现动,态特征：叶绿体在细胞内的位置与分布受光照影响，且叶绿体定位（chloroplast,ositioning）借助微丝骨架的作用，在拟南芥叶肉细胞中，微丝结合蛋白CHUP1,（chloroplast unusual positioning 1）为叶绿体正常定位所必需。,光照强度对叶绿体分布,及位置响应的示意图：,野生型（WT）拟南芥叶,片呈深绿色。对叶片的,一部分（整体遮光，中,部留出一条缝）强光照,射1h后，被照射的部分,变成浅绿色，这是由于,细胞叶绿体位置和分布,发生了变化，以减少强,光的伤害。在叶绿体定,位异常的突变体,（chup1）中，光照对,叶绿体的位置与分布失,去影响。,叶绿体的分化与去分化,叶绿体仅存在于绿色组织中，分化于幼叶的形成和生长阶段。在形态上表现为体积,的增大、内膜的形成和叶绿色的积累；而在生化与分子生物学上，则体现为叶绿体,功能必需的酶、蛋白质、大分子的合成、运输及定位。叶绿体正常工作需要数千基,因的表达。拟南芥编码叶绿体蛋白酶的基因（var1和var2）发生突变后，叶绿体发,育异常，叶片出现白斑，白化叶或叶白化部分的质体形成白色体。,（二）叶绿体的分化和去分化叶绿体是原质体的一种分化方式；叶绿体的分化表现为形态上和在生化和分子生物学上；在特定情况下，叶绿体的分化是可逆的，叶绿体可去分化再次形成原质体。,（三）叶绿体的分裂质体和叶绿体通过分裂而实现增殖。分化中的叶绿体称为前叶绿体叶绿体的分裂与线粒体分裂具有相同的细胞动力学机制。也由外环与内环组成，分裂环的缢缩是叶绿体分裂的细胞动力学基础,叶绿体分裂必需的dynamin相关蛋白被称为ARC5该蛋白出现于缢陷处，推动叶绿体深,电子显微镜下观察到的红藻（a，b）及被子植物天竺葵（c）的叶绿体分裂环。在扫描电子显,微镜下，红藻叶绿体分裂环的外环（a中双箭头指示）为一环形索状结构，位于叶绿体表面，,随着叶绿体分裂的进行而变粗。在叶绿体的垂环切面上，分裂环的一对横切面出现在叶绿体,的缢缩处，呈较高电子密度（b中双箭头指示）。将分裂环的切面放大（b中下图）后，在外,环切面（大箭头）的下面可以清楚地区分辨出形状宽扁的内环（小箭头）断面。外环与内环,的断面之间由叶绿体膜相隔。高等植物的分裂环在超微结构上与红藻相同。随着分裂的进行,（I III），分裂环外环（c中箭头指示）变粗，截面积增大（c中右图分别为左图的局部,放大）。CP：叶绿体；MP：线粒体；N：细胞核。Bar = 0.5微米（a，b上，c左），0.1微米,（b下，c右）,二、叶绿体的超微结构,（一）叶绿体膜外膜、内膜和膜间隙构成；外 膜通透性大，含有孔蛋白，允许相对分子质量高达104 的分子通过；而内膜则通透性较低，仅允许O2、CO2 和H2O 分子自由通过。叶绿体内膜上有很多转运蛋白，选择性转运较大分子。,（二）类囊体叶绿体内部由内膜衍生而来的封闭的扁平膜囊，称 类囊体。类囊体囊内的空间称为类囊体腔（thylakoid lumen）在叶绿体中，许多圆饼状的类囊体有序叠置成 基粒（grana）。该膜囊系统独立于基质，在电化学梯度的建立和ATP 的合成中起重要作用。 类囊体膜富含具有半乳糖的糖脂和极少的磷脂。糖脂中的脂肪酸主要是不饱和的亚麻酸质双分子层流动性非常大，有益于光合作用过程中类囊体膜上的PS、Cytb6f 复合物、PS及CF0-CF1 ATP 合酶复合物在膜上的侧向移动。,（三）叶绿体基质叶绿体内膜与类囊体之间的液态胶体物质，称为叶绿体基质。基质的主要成分是可溶性蛋白质和其他代谢活跃物质，其中丰度最高的蛋白质为核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/ 加氧酶(ribulose-1,5-biphosphate carboxylase/oxygenase，简称Rubisco)。Rubisco 是光合作用中的一个重要的酶系统，亦是自然界含量最丰富的蛋白质。基质中还存在叶绿体DNA、核糖体、脂滴、植物铁蛋白和淀粉粒等物质。,叶绿体与线粒体形态结构比较, 叶绿体内膜并不向内折叠成嵴；, 内膜不含电子传递链；除了膜间隙、基质外，,还有类囊体；, 捕光系统、电子传递链和ATP合成酶都位于类,囊体膜上。,三、光合作用（一）原初反应光合色素分子被光能激发而引起第一个光化学反应的过程。1.光合色素叶绿素、类胡萝卜素和藻胆素。2.光化学反应光化学反应是指反应中心色素分子吸收光能而引发的氧化还原反应。,光合作用原初反应的能量吸收、传递与转换图解,三、光合作用, 依赖光的反应（light dependent,reaction）或称“光 反应”（light,reaction）, 在类囊体膜上进行；包括原初反,应；电子传递和光合磷酸化, 碳同化反应（carbon assimilation,reaction）或称固碳反应（carbon,fixation reaction）, 在叶绿体基质中进行；光反应产物,（ATP 和NADPH ）驱动CO2 还原,成糖的分子反应过程,（二）电子传递和光合磷酸化,1、电子传递, 光系统（photosystem, PS）：指光合作用,中光吸收的功能单位，由叶绿素、类胡萝卜素、脂,质和蛋白质组成。, PS和PSI： 叶绿体的类囊体膜上存在的两个,不同光系统。它们的反应中心相继催化光驱动的电,子从H2O到NADP+的流动。,（二）电子传递和光合磷酸化1.电子传递光合电子传递链（photosynthetic electron transfer chain）由一系列的电子载体构成。电子载体包括细胞色素、黄素蛋白、醌、铁氧还蛋白，分别组装在膜蛋白复合物PS、PS Cyt b6f 复合物,（1）PSII的结构与功能 PS由反应中心复合物和捕光复合物（LHC）组成。其功能是利用光能在类囊体膜腔面一侧裂解水并在基质侧还原质体醌，使类囊体膜的两侧形成质子梯度。,Cytb6f复合物的结构与功能, 结构：含有一个Cyt b6、,一个Fe-S 和一个Cyt f, 功能：将电子从PS传,递到PS，引起H+ 的跨,膜转移,（3）PSI的结构与功能PS由反应中心复合物和PS捕光复合物（LHC）组成，其功能是利用吸收的光能或传递来的激发能在类囊体膜的基质侧将NADP+ 还原为NADPH。,2.光合磷酸化,由光照所引起的的电子传递与磷酸化作用相偶联而生成ATP的过程称为光合磷酸化（photophosphorilation）（1）CF0-CF1ATP 合酶 （2）光合磷酸化的类型 光合磷酸化依电子传递的方式不同分为：非循环光合磷酸化 Noncyclic photophosphorylation循环光合磷酸化 cyclic photophosphorylation,2. 光合磷酸化类型（循环）,非循环式光合磷酸化,叶绿体类囊体膜中进行的电子传递和H跨膜转移,（3）光合磷酸化的作用机制,（4）ATP 合成机制,光合碳同化,卡尔文循环：,1、羧化阶段,2、还原阶段,3、RuBP再生阶段,卡尔文循环,（三）光合碳同化,本质：将光反应产物ATP和NADPH中的活跃化学,能转换为糖分子中高稳定型化学能的过程。这一,过程不直接需要光(在叶绿体基质中进行)。,1、卡尔文循环（C3途径）,C3途径是所有植物进行光合碳同化所共有的基本途径，,包括3个主要阶段：,（1）羧化阶段：CO2的受体为核酮糖-1，5-二磷酸,（ribulose-1,5-biphosphate, RuBP）。,RuBP,+,CO2,RuBP羧化酶/加氧酶,2甘油酸-3-磷酸,（2）还原阶段：,甘油酸-3-磷酸,甘油酸-3-磷酸激酶,甘油酸-1,3-二磷酸,NADPH NADP+,甘油酸-1,3-二磷酸,甘油醛-3-磷酸脱氢酶,甘油醛-3-磷酸,1、卡尔文循环（C3途径）,（3）RuBP再生阶段：,RuBP作为卡尔文循环的起始物和CO2的接受体，,需要得到不断的再生，以维持循环的连续进行。,核酮糖-5-磷酸,核酮糖-5-磷酸激酶,核酮糖-1,5-二磷酸,（RuBP）,C4植物的碳同化,2. C4 途径 存在于一些热带或亚热带起源的植物(C4 植物)中，如甘蔗、玉米、 高粱等。 该途径固定CO2 的最初产物为草酰乙酸( 四碳化合物)，因而被称为C4 途径。与C3不同 ，CO2 在叶肉细胞中与磷酸烯醇式丙酮酸PEP反应生成草酰乙酸（在PEP 羧化酶作用下）。草酰乙酸不稳定，迅速被还原为苹果酸，被转运到维管束鞘细胞，苹果酸被分解释放出CO2 ，进入卡尔文循环。,2. C4 途径,C4途径：又称哈奇-斯莱克(Hatch-Slack)途径，CO2受体为PEP,（磷酸烯醇式丙酮酸），最初产物为草酰乙酸(OAA) 。,叶肉细胞,维管束鞘细胞,3.景天酸代谢途径 (CAM途径),CAM途径与C4,途径有许,多相似之,处，只是,将CO2的固,定和还原,在时间上,分开了。,景天科、仙人,掌科、凤,梨科、兰,科,3. 景天酸代谢,景天酸代谢途径（CAM途径）：夜间固定CO2产生苹果酸，白,天苹果酸脱羧释放CO2，进行CO2固定。,http:/plantphys.info/plant_physiology/c4cam.shtml,第三节. 线粒体和叶绿体,的半自主性及其起源,第三节 线粒体和叶绿体的半自主性及其起源,一、线粒体和叶绿体的半自主性 （semiautonomous）（一）线粒体和叶绿体DNA 绝大多数真核细胞的线粒体DNA (mitochondrial NA，mtDNA) 呈双链环状；线粒体需要通过频繁 的融合与分裂共享细胞内的遗传信息；被子植物 的mtDNA 呈现出丰富的分子多态性。 叶绿体DNA（cpDNA） 或称质体DNA（ptDNA） 亦呈环状，分子大小依物种的不同呈现较大差异，在 2002 500 kb 之间； mtDNA 和cpDNA 均以半保留方式进行复制。其复制受细胞核的控制。复制所需的 DNA 聚合酶、解旋酶等均由核基因组编码。,一、线粒体和叶绿体的半自主性,半自主性细胞器：,自身含有遗传表达系统(自主性)；但编码的遗传,信息十分有限，其RNA转录、蛋白质翻译、自身构建,和功能发挥等必须依赖核基因组编码的遗传信息(自,主性有限)。,线粒体和叶绿体DNA,线粒体和叶绿体的蛋白质,线粒体、叶绿体基因组与细胞核的关系,线粒体和线粒体和叶绿体的蛋白质的蛋白质,（二）线粒体和叶绿体中的蛋白质mtDNA和cpDNA 也称为线粒体基因组（mito- chondrial genome ）和叶绿体基因组chloroplast genome。借助自身的酶系统，被转录和翻译成相应的物质。线粒体和叶绿体基因组编码的蛋白质在线粒体和叶绿体的生命活动中是重要和不可缺少的；但这些蛋白质还远远不足以支撑线粒体和叶绿体的基本功能，更多的蛋白质来源于核基因组编码，在细胞质中合成后被运往线粒体和叶绿体。,（三）线粒体、叶绿体基因组与细胞核的关系线粒体和叶绿体的生命活动受到细胞核以及它们自身基因组的双重调控；细胞核与线粒体、叶绿体之间通过“共进化” 的方式建立了精确有效的分子协作机制。细胞核与线粒体、叶绿体之间在遗传信息和基因表达调控等层次上建立的分子协作机制被称为核质互作，若三者中任何基因单方面突变 ，个体出现异常表型称为线粒体和叶绿体的基因表达过程中，一些基因的个别碱基需要接受必要的修饰方可翻译出正确的蛋白质，这种修饰成RNA编辑。RNA editing,不同真核生物线粒体基因组（DNA）大小及其表达产物,（三）线粒体、叶绿体基因组与细胞核的关系, 线粒体和叶绿体的生命活动受到细胞核以及它们自身基,因组的双重调控；,核质冲突：细胞核或线粒体、叶绿体基因单方面发生突,变，引起细胞中的分子协作机制出现严重障碍时，细胞,或真核生物个体通常会表现出一些异常的表型。,二、线粒体和叶绿体的起源 （一）基因组与细菌基因组具有明显的相似性 （二）具备独立、完整的蛋白质合成系统 （三）分裂方式与细菌相似 （四）膜的特性 （五）其他佐证,二、线粒体和叶绿体的起源,内共生起源学说（endosymbiosis hypothesis)：,1970年，Margulis：, 真核细胞的祖先：是一种体积较大、不需氧具有吞噬,能力的细胞，通过糖酵解获取能量；, 线粒体的祖先：是一种革兰氏阴性细菌，具备三羧酸,循环所需的酶和电子传递链系统，可行有氧呼吸；, 叶绿体的祖先：是原核生物的蓝细菌（即蓝藻）。,5.3.3 线粒体和,叶绿体的起源,内共生起源学说：,比较线粒体、叶绿体与,各种细菌在核糖体RNA,序列上的差异后认为：,线粒体起源于一种紫色,非硫菌；,叶绿体起源于蓝细菌。,左图：灰胞藻Glaucocystis,右图：蓝藻小体Cyanophora,内共生起源学说证据很多,1.,2.,3.,4.,5.,6.,7.,8.,9.,基因组大小、形态与结构与细,菌相似；,具完整的蛋白质合成系统；,内外膜进化来源差异大；,裂殖增殖；,独立性，能在异源细胞内长期,生存；,线粒体祖先可能来源于反硝化,副球菌或紫色非硫光合细菌；,蓝小体发现介于叶绿体和,胞内共生蓝藻；,核起源？,线粒体叶绿体基因有内含子？,非共生起源学说证据较少,非内共生学说原生质内陷学说,又称细胞内分化学说。认为线粒体的发生是质膜内陷,的结果。有几种模型,其中Uzzell的模型认为：在进化,的最初阶段,原核细胞基因组进行复制,并不伴有细胞,分裂,而是在基因组附近的质膜内陷形成双层膜,将分,离的基因组包围在这些双层膜的结构中,从而形成结,构可能相似的原始的细胞核和线粒体、叶绿体等细胞,器。后来在进化的过程中,增强分化,核膜失去了呼吸,和光合作用,线粒体成了细胞的呼吸器官,这一学说解,释了核膜的演化渐进的过程。,Thanks for yourattention!,