《现代分子生物学》第七章原核生物基因表达调控ppt课件.ppt

第七章 原核生物基因表达调控,机体可以在基因表达过程（DNA到蛋白质）的任何阶段进行调控，一般以转录水平上的调控为主。,第一节 基因表达调控的基本概念,1. 反式作用因子与顺式作用元件基因表达的产物(蛋白质或RNA)从合成的场所扩散到目标场所而发挥作用的过程称为反式作用（trans-acting），此基因表达产物被称为反式作用因子（trans-acting factor） 。,反式作用因子通常为蛋白质或RNA，其特征为可以从合成地扩散到目标场所发挥作用。,顺式作用元件（cis-acting factor）是指对基因表达有调节活性的DNA序列，其活性只影响与其自身同处在一个DNA分子上的基因。顺式作用元件通常不编码蛋白质，多位于基因旁侧或内含子中。顺式作用（cis-acting）的概念用于任一不转变为任何其他形式的DNA序列，它只在原位发挥DNA序列的作用，仅影响与其物理上相连的DNA序列的活性。基因活性的调控主要通过反式作用因子（通常是蛋白质）和顺式作用元件（通常在DNA上）相互作用而实现。,2. 结构基因和调节基因结构基因（structural gene）是编码蛋白质或RNA的任何基因。结构基因编码大量的功能各异的蛋白质，如组成细胞和组织的结构蛋白和酶等。调节基因（regulator gene）仅指参与其他基因表达调控的RNA和蛋白质的编码基因。调节基因编码的调节物通过与DNA上的特定位点结合而控制受调节基因的转录是基因表达调控的关键。,3. 启动子和终止子位于转录单位开始和结束位置上的DNA序列，称为启动子（promoter）和终止子（terminator）。两者都是典型的顺式作用元件，能受同一类反式作用因子RNA聚合酶的识别。,4.操纵基因和阻抑蛋白操纵基因（operator）是与启动子相邻的顺式作用位点，是阻抑蛋白的靶点。阻抑蛋白（repressor）是调节基因的产物，与操纵基因的结合可以阻止受调节基因的表达。当阻抑蛋白与操纵基因结合时，就会阻止RNA聚合酶启动转录，基因的表达就被关闭。在无阻抑蛋白时，RNA聚合酶可以识别受调节基因的启动子，使这种基因得到表达。,5. 转录因子转录因子（transcription factor ）是转录起始过程中RNA聚合酶所需要的辅助因子。转录因子是参与正调控的反式作用因子，在无转录因子时，RNA聚合酶不能起始转录。转录因子通常识别位于基因上游启动子附近的顺式作用元件。,操纵子（operon)顺式作用元件（cis-acting element）结构基因（ structural genes）调节基因（regulator genes）。反式作用因子（trans-acting factor）。诱导物（inducer）和效应物（effectors）可诱导的基因和组成型基因控制位点（controlling site）诱导（induction）,第二节 转录水平的调控,原核生物的基因调控可以发生在转录和翻译等不同阶段，但也是以转录水平为主。原核生物许多功能相关的结构基因，特别是编码同一代谢途径的酶的基因，一般成簇排列，能受单一启动子的共同控制，结果是整簇基因或者都表达或者都不表达。,1961年，Jacob和Monod提出了细菌基因表达调控的模型操纵子学说，解释了原核生物的基因表达在转录水平上是如何调控的。操纵子（operon）就是由操纵基因（operator）以及相邻的若干结构基因所组成的功能单位。操纵子还包括一个结合RNA聚合酶的启动子。,操纵基因是位于操纵子前端部分的顺式控制元件，它能和阻抑蛋白结合，控制结构基因的转录。阻抑蛋白是调节基因的表达产物，是参与操纵子调节的反式作用因子。原核生物操纵子中的全部结构基因从同一个启动子开始转录成单个mRNA分子。,细菌应答某种特定物质出现而合成特定酶的过程，称为诱导作用（induction）。大肠杆菌乳糖操纵子是这种机制最好的范例。如果某种小分子物质能够促使细菌产生酶将其自身分解，这种小分子物质就叫做诱导物（inducer）。,一、诱导作用和阻抑作用,异丙基硫代-D-糖苷（IPTG）虽然不能被-半乳糖苷酶分解，但它是乳糖操纵子非常有效的诱导物。这种能诱导酶合成，但不能被酶分解的分子称为义务诱导物（gratutious inducer）。义务诱导物由于能在细胞内保持原型不变，因此很有用处，而真正的诱导物会被代谢分解掉。,细菌快速应答环境营养成分的变化的能力不仅表现在分解新底物方面，而且也用来关闭突然在培养基中的化合物的内源性合成，这种效应就是所谓的阻抑作用（repression）。大肠杆菌色氨酸操纵子即是阻抑作用的例子。如果某种小分子物质能够阻止细菌产生合成其自身的酶，这种小分子物质叫做辅阻抑物（corepressor）。,诱导作用和阻抑作用都能对细菌的代谢能力进行调控。前者调节细菌使用某种物质的能力，后者调节合成特定代谢中间产物的能力。每种调节的诱发剂都是小分子物质，或为酶的底物，或为酶所催化合成的产物。诱导物或辅阻抑物的作用是高度特异的，仅有特定的或密切相关的分子能发挥作用。但这些小分子并不直接与其调控的目标酶分子相互作用而实现其调控功能。,正调控和负调控,正调控负调控诱导(induction)阻遏(repression)诱导物(inductor)阻遏物(repressor)辅阻遏物(corepressor) 使阻遏蛋白具有活性或使活性蛋白失去活性的物质称。,未发现,二、乳糖操纵子,1 乳糖操纵子与负控诱导系统乳糖操纵子（lactose operon，lac ）的三个结构基因成簇排列，编码参与-半乳糖苷（如乳糖）分解代谢所需的三种蛋白质：lacZ编码-半乳糖苷酶，lacY编码-半乳糖苷透性酶，lacA编码-半乳糖苷转乙酰基酶。,lacI基因（调节基因）正好与结构基因相邻，但它不与结构基因属于同一转录单位，它有自己独立的转录单位，含有自己的启动子和终止子。lacI编码可扩散的产物，理论上它不必位于结构基因附近。将lacI基因转移到其他任何地方都能很好地发挥作用，因此lacI的表达产物属于反式作用因子。,lacI基因的表达产物称为乳糖操纵子阻抑蛋白（lac repressor）。它的功能是阻止结构基因的表达。因此，乳糖操纵子的调控属于负调控。阻抑蛋白与lacZYA基因簇开始处的操纵基因（O lac）结合，阻止RNA聚合酶在启动子的转录起始而发挥作用。实际是一个抗解链蛋白，阻止形成开放结构。,Operator mutations are constitutive because the operator is unable to bind repressor protein；this allows RNA polymerase to have unrestrained access to the promoter .The Oc mutations are cis-acting ，because they affect only the contiguous set of structural genes.,Mutations that inactivate the lacI gene operon to be constitutively expressed,because the mutant repressor protein cannot bind to the operator.,阻抑蛋白的作用机制,1. 阻抑蛋白及其靶DNA序列的对称性阻抑蛋白识别位点的共有特点就是具有对称性。靠近对称轴的一对反向重复序列在阻抑蛋白结合过程中起主要作用。阻抑蛋白的结构也具有对称性。,阻遏蛋白的结构：N端159aa头部片段：为HTH，与操纵基因DNA的大沟结合；核心区：有6个折叠，诱导物就结合在两个核心区之间的裂缝中；C端为两组亮氨酸拉链，形成四聚体。,2. 阻抑蛋白结构与功能的关系乳糖操纵子的阻抑蛋白为两个二聚体结合在一起形成的四聚体结构。四个亚基的螺旋连在一起，维持四聚体结构。,每个二聚体都有两个头段，两个头段在一起结合一个操纵基因序列。这使整个阻抑蛋白能够同时结合操纵基因的两个位点。,完整的四聚体阻抑蛋白能够同时与操纵基因结合，亲和力较不完整的阻抑蛋白高很多。,与诱导物结合可直接引起阻抑蛋白构象发生改变，使两个二聚体的头段不再同时与DNA结合，使多亚基阻抑蛋白失去优势，降低了与操纵基因结合的亲和力。,3. 阻抑蛋白对RNA聚合酶功能的影响阻抑蛋白和RNA聚合酶可同时与DNA结合，而且阻抑蛋白与DNA的结合能够增强RNA聚合酶结合DNA的能力，但是结合着的RNA聚合酶不能起始转录。加入诱导物以后，释放出阻抑蛋白，被关闭的复合物转变为开放的复合物，起始转录。,诱导物的结合解离模型,诱导物和阻遏蛋白结合的模型,乳糖操纵子同样存在正调控。在没有诱导物存在的情况下，存在lac操纵子的本底水平的表达。,2 cAMP对乳糖操纵子转录的激活作用,细菌在富含葡萄糖的培养基上生长的时候，葡萄糖可以抑制-半乳糖苷酶表达的一个很重要的因素是葡萄糖降低了细菌体内cAMP的水平。生化和遗传学实验证明，cAMP可以结合到启动子的某个部位而激活操纵子的转录。,在细菌中，cAMP与CAP（catabolite activator protein，CAP）二聚体结合形成二元复合物共同发挥作用。只有cAMP存在时，CAP才有活性。CAP是一个正调控因子，在依赖CAP的启动子上起始转录必须有CAP参与。cAMP下降，CAP就不能与控制区结合，RNA聚合酶就不能启动转录。,CAP激活转录有两种方式：第一种方式是直接作用于RNA聚合酶。CAP直接作用于RNA聚合酶的亚基，而且CAP必须与RNA聚合酶在同一个面上才有活性。另一种是作用于DNA改变其结构，以协助RNA聚合酶的结合。在CAP-DNA复合物中，DNA呈弯曲状态，弯曲点位于二重对称的中心。CAP结合以后，DNA双螺旋结构有很大的变化。,CAP Binding Bends DNAv,This DNA bending results in more efficient RNA polymerase binding,C,A,B,Summary,A: RNA polymeraseB: lac repressor C: CRP-cAMP,协调调节,当阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用；,如无CAP存在，即使无阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。,单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利用葡萄糖。,葡萄糖对 lac 操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic repression)。,三、色氨酸操纵子,色氨酸操作子与负控阻遏系统,色氨酸操纵子的阻抑蛋白通过结合多个操纵基因，控制散在分布的、三套不相连的结构基因。第一套基因是结构基因簇tryEDCBA，控制从分支酸（chorismic acid）合成色氨酸的酶的合成。第二套是aroH基因，aroH基因编码在芳香族氨基酸生物合成共同通路中催化起始反应的三种酶中的一种。第三套基因是trpR调节基因，trpR调节基因被自身产物阻抑蛋白阻抑，阻抑会降低自身的合成。,特点: (1) trpR(89)和trpABCDE(25)不连锁； (2) 操纵基因在启动子内 (3) 有衰减子(attenuator) (4) 启动子和结构基因不直接相连，二者被 前导顺序(Leader)所隔开,Trp操纵基因序列长21bp，是trp阻抑蛋白的作用位点。,操纵子的其它调控形式,一半乳糖操纵子（gal operon）1.结构2.特点： (1)双启动子； (2)双操纵基因； (3) 无35序列； (4) OE在CAP位点内，OI在 gene E内 Gal 既可为碳源，同时UDPGal 又是合成细菌细胞壁的重要前体,gal 操纵子的结构,Glu和Gal对Gal操纵子的调节,当没有葡萄糖的条件下有Gal存在时，gal R（位于62）编码的阻遏物失活，CAP结合在-4723区域，RNA Pol结合在-10S1区，CAP和RNA Pol直接相互作用，使P1顺利转录；当无Gal时Gal R结合在Gal OE上，Gal OE具有回文顺序（TT GTG TAA AC|GATTCCACTAA）供CAP结合。它离启动子有一段距离，当Gal R结合在gal OE上时不大可能像lac操纵子中lac阻遏那样去阻碍RNA Pol的结合，它阻断S1的转录可能的两种方式；或是影响到cAMP-CAP和RNA聚合酶的作用而阻断；或通过干扰cAMP-CAP与DNA的相互作用来阻断。在Glu存在的情况下，cAMP -CAP含量少，当Gal存在，而无Gal R时，P1不能启动而P2启动，RNA聚合酶结合-10 S2顺序上，-10 S2（TATGCTA）和-10 S1（TATGGTT）顺序相似，从S2开始转录gal E而不转录另外的2个基因gal T和gal K。这是由于Gal既可以作为碳源，同时UDP-Gal又是合成细胞壁的重要前体，因此无论Glu是否存在，只要有Gal，gal E总可以得到转录。,在Glu存在的情况下，若无Gal存在，Gal R可结合在gal OE和OI上，并相互作用形成环。S2位点阻遏作用和SI的阻遏机制完全不同，在上述条件下，即使有Gal R存在，P2仍不受阻遏开始转录（组成型），但由于OI上也有Gal R的结合并且成环，故转录只进行20碱基便停止，这个过程如何发生尚不清楚。cAMP-CAP的存在对P1可以激活是正调控，而对P2都是抑制，是负调控，其机制还没有搞清楚；Gal R这个阻遏物对P1和P2两个启动子都是负调节，但在cAMP-CAP含量少时P2仍可转录，其机制也不清楚。,二阿拉伯糖操纵子(ara O),1. 结构:具有正负调节功能的操纵子2.特点： (1) AraC有双功能 a.纯C结合araO1,阻遏；b. C+Ara C ind,结合于araI，诱导，正调节(2) araC本身也受操纵调节；(3) AraC有三个结合位点(O1,O2和araI)(4) 是调节子(regulon)(5)双向转录；(6)Pc和O1重叠；(7)C 自身调节,ara 操纵子的结构,araI,第三节 转录后加工的调控,一、经mRNA切割进行的调控细菌mRNA大多是多顺反子，几乎都以转录出的最初形式进行翻译，而无需切割成单个基因的mRNA。T7噬菌体的早期和晚期基因转录成多顺反子mRNA，然后在几个切点切割释放出各个基因的mRNA。,二、细菌rRNA前体切割形成rRNA大肠杆菌有7个操纵子编码rRNA，这7个操纵子被命名为rrnAG。所有rrn操纵子的组织结构相同，都含有三种rRNA分子，顺序为16S23S5S。每一个操纵子都被转录成一个RNA前体，然后切割形成成熟的rRNA分子。,第四节 翻译水平的调控,一、 翻译过程中的自体调控1. 阻抑蛋白对翻译起始的调控 阻抑蛋白通过与mRNA的特定区域结合，抑制核糖体对翻译起始区的识别。这种调控最常见的形式是，调控蛋白与含有起始密码子AUG的序列直接结合，从而阻止核糖体的结合。,2. mRNA二级结构对翻译的调控翻译一个顺反子需要二级结构的改变。mRNA上有多个核糖体存在时，第一个顺反子的翻译会破坏mRNA原有的二级结构，使核糖体能够与下一个顺反子的翻译起始区域结合。,3. 基因表达装置蛋白质合成的自体调控细菌编码核糖体蛋白质、蛋白质合成因子和RNA聚合酶亚基等蛋白质的基因混合组成几个操纵子。每个操纵子都含有数个基因。这些操纵子的表达都受操纵子自身的一些基因产物的调控。操纵子自身编码的蛋白质的富集会抑制其自身及一些相关基因产物的进一步合成。一种蛋白质或RNA调控其自身的表达，即为自体调控。,二、 弱化作用弱化作用（attennuation）是Charles Yanofsky等在研究色氨酸操纵子的过程中发现的一种新的基因表达调控方式。弱化作用是翻译过程控制RNA聚合酶通读弱化子能力的一种调控机制。,Yanofsky等发现在缺失了启动子和trpE基因（编码色氨酸操纵子的第一个酶）之间序列的突变体中，trp mRNA的水平有所增加。进一步的分析发现，trp mRNA的5-端有一162个核苷酸的前导序列。缺失造成trp mRNA水平增加的序列位于前导序列内，trpE基因起始密码子上游3060碱基的位置。,随后的研究发现，当大肠杆菌体内色氨酸的含量较高时，非突变体产生了一个仅含有130个核苷酸leader的转录物。而在色氨酸缺乏时，菌体则会包含整个leader序列的由7000个核苷酸组成的trp mRNA。Yanofsky等得出结论，色氨酸操纵子的表达受一个可调控的终止子弱化子（attenuator）的控制。而弱化子（attenuator）是位于转录单位开始区的一种内部终止子。,弱化子转录终止对色氨酸含量做出应答的机制可能和前导序列（leader sequence）有关。前导序列含有一个核糖体结合位点，其AUG密码子后有一短的编码序列，它含有两个连续的色氨酸密码子。,细胞中有色氨酸存在时，核糖体顺利地译出整个前导肽而在终止密码子UGA处停下来。终止子发夹结构能够形成，实现了转录的终止。当细胞中的色氨酸用尽时，核糖体停顿在两个色氨酸密码子上，不能形成带有发夹结构的终止子，于是转录继续进行下去。,Low Trp,High Trp,Trp 高时,Trp 低时,mRNA,O,P,trpR,调节区,结构基因,RNA聚合酶,RNA聚合酶,?,（一）转录衰减,色氨酸操纵子,前导序列,第10、11密码子为trp密码子,14aa前导肽编码区:,包含序列1,形成发夹结构能力强弱： 序列1/2序列2/3序列3/4,UUUU 3,前导肽,前导mRNA,1.当色氨酸浓度高时,转录衰减机制,衰减子结构就是终止子可使转录,RNA聚合酶,终止,前导肽,前导mRNA,RNA聚合酶,2.当色氨酸浓度低时,Trp合成酶系相关结构基因被转录,序列3、4不能形成衰减子结构,弱化作用的特点是外部事件控制内部终止所需要的发夹结构的形成。另外很重要的一个方面是转录和翻译过程是前后相连（closely coupled）的。弱化子的弱化作用与阻抑作用无关，缺失弱化子后，基础水平转录和去阻抑转录都增强。,调控机制,阻遏型操纵子及衰减机制。衰减子位于结构基因E和操纵基因O之间的L基因中。L基因的部分转录产物编码14个氨基酸，其中含两个相邻的色氨酸密码子，这两个相邻的色氨酸密码子及原核生物中转录和翻译的偶联是产生衰减的基础。调控作用将环境中的色氨酸消耗完，然后开始自身合成。,Control of Gene Expression in the Trp Operon,The enzyme catalyzing the first step in the pathway is inhibited by Trp (feedback control).In the presence of Trp, a repressor protein binds to an operator upstream of the Trp operon and shuts off transcriptionAttenuation. There is a 160 base pair region in the Trp mRNA that causes transcription to terminate prematurely if Trp is present.,原核生物转录的整体调控模式,由成群的操纵子组成的基因转录调控网络称为调节子。通过组成调节子调控网络，对若干操纵子及若干蛋白质的合成进行协同调控，从而达到整体调控的目的。,典型的整体调控模式是SOS反应，这是由一组与DNA损伤修复有关的酶和蛋白质基因组成。在正常情况下，这些基因均被LexA阻遏蛋白封闭。当有紫外线照射时，细菌体内的RecA蛋白水解酶被激活，催化LexA阻遏蛋白裂解失活，从而导致与DNA损伤修复有关的基因表达。,当细菌DNA遭到破坏时，细菌细胞内会启动一个被称为SOS的诱导型DNA修复系统。 SOS修复系统受到LexA阻遏蛋白的抑制，平时该蛋白表达水平很低。 SOS体系的诱导表达过程其实就是LexA阻遏蛋白从这个基因的上游调控区移开的过程。,SOS反应,紫外线,与DNA 损伤修复有关的酶和蛋白质,DNA,SOS 修复只是SOS反应的一部分,RecA在SOS反应中起核心作用,RecA与LexA组成调控环路,RecA受LexA的部分抑制,三、 小RNA分子调节翻译,RNA也可以作为反式作用调节因子参与基因表达的调控。RNA调节物的靶分子为单链核酸序列。RNA调节物与目标分子互补，形成双链区，通过改变靶分子的二级结构来控制靶分子的活性。,RNA调节物与阻抑操纵子的蛋白质的不同点是RNA没有变构的性质，不能受其他小分子影响而改变识别靶分子的能力。它的调节作用随着其产生而产生，随着其消失而失去。反义RNA就是一种RNA调节物。反义RNA与mRNA上核糖体结合位点结合，使核糖体不能结合，使翻译不能起始。,RNA聚合酶转录起始亚基的替换 T4噬菌体的时序调节依赖本身携带的蛋白对宿主的核心酶加以修饰,改变其和亚基的结合能力,乘机将本身编码的蛋白取代原来的亚基,从而改变RNA聚合酶的识别能力。DNA重排对转录起始的调控翻译的延伸调控 稀有密码子的调控 mRNA二级结构对翻译延伸的调控翻译的终止调控(一) 严谨反应(strigent response) 空转反应（idling reaction） 松驰型突变（relaxed(rel)mutants） 应急因子（stringent factor）(二) mRNA稳定性对翻译的调控,（一）因子决定RNA聚合酶识别特异性,（二）操纵子模型的普遍性,（三）阻遏蛋白与阻遏机制的普遍性（四）以负性调控为主,正性调控为辅,