园艺植物组织培养第9章ppt课件.ppt

第九章 胚培养,主要内容,9.1 胚培养的方法,9.2 胚柄在胚培养的作用和胚的早熟萌发,9.3 通过“胚拯救”获得远缘杂种,合子胚指的是由雌雄配子融合形成的合子继而发育成的胚。对合子胚进行离体培养的主要目的是获得能正常生长发育的植株。胚培养的研究已经有1个世纪的历史，在被子植物中，Hanning（1904）最早在无菌条件下进行了离体胚培养实验，他当时所培养的是两种十字花科植物-辣根菜和萝卜的成熟胚。后来，很多研究者都由成熟胚的离体培养获得了植株。Dieterich（1924）指出，在含有Knop无机盐和2.5%-5%蔗糖的半固体培养基上 ，成熟胚能正常生长，但由未成熟种子中剥离的胚不能长出成熟胚的各种结构，而是越过了正常胚胎发生过程中的若干阶段，直接长成幼苗，这种现象称作“早熟萌发”。,胚培养方法的进一步发展是受到了Laibach(1925,1929)的推动，这是因为，他首次证实了这种方法在实用上的重要价值。在宿根亚麻和奥地利亚麻的种间杂交中，Laibach发现所结的种子严重皱缩，分量很轻，不能萌发。但是，若把胚由种子中剥离出来，置于潮湿滤纸上或含有蔗糖的棉絮上，则能得到杂交植株。Laibach因此提出，在所有不能形成有生活力种子的杂交中，若把胚剥离出来置于人工培养基上，或许能够起死回生。自此以后，在由于胚的夭折不能形成有生活力种子的情况下，胚培养即被广泛用于产生杂种。,胚培养的类型：成熟胚培养：成熟胚培养是指由成熟种子中剥取的胚。成熟胚培养的目的是为了克服种子本身（特别是种皮）对胚萌发的抑制作用。成熟胚培养比较容易，在只含有无机盐、蔗糖和琼脂的培养基上就能长成植株。未成熟胚培养：未成熟胚培养指的是未成熟种子中的胚或夭折之前的远缘杂种胚。进行未成熟胚培养的目的，在前一种情况下是研究胚胎在不同发育时期的营养需求，在后一种情况下是避免杂种胚的夭折。未成熟胚往往不易剥离，而且只有在成分相当复杂的培养基上才能长成植株。未成熟胚培养的成功几率主要取决于胚的发育时期。,Monnier（1980）对由球形期开始发育的未成熟胚在活体和离体条件下的发育状况进行了比较。由他的研究可以看出，在离体条件下，胚的生长过度，但发育延迟；在双子叶植物中，一片子叶先长，而不是像在活体中那样两片子叶同时生长。另外，在离体条件下还有形成多个子叶的倾向。取决于植物的种类，胚龄的大小和培养基的组成，未成熟胚在离体培养中可能有3种不同表现：（1）继续正常的胚胎发育过程，最终形成具有萌发能力的成熟胚（2）早熟萌发，形成细弱的畸形苗（3）形成愈伤组织,9.1 合子胚培养的方法,9.1.1 选择植物材料,对用于胚培养的植物的选择，通常是有所遇到的问题既试验的目的决定的。,演示实验选胚易于剥离的植物，如豆科、十字花科植物成熟胚。,易获得大量的遗传组成一致又处于同一发育期的胚的植物。（开花和结实都十分规律的植物）,荠菜在某些方面能满足这些要求。,培养处于一定发育时期的胚：,须对刚开放的花进行人工授粉。在这类研究中，最好先制成一个对照表，列出胚胎发育期和授粉后天数的相应关系。,培养即将衰亡的胚：,从即将夭折的种子中获得植株，则必须在夭折开始之前，将种子剥离下来进行培养。,9.1.2 消毒,合子胚受珠被、子房的双重保护，只需对胚珠、子房消毒即可，然后在无菌的条件下剥出合子胚直接置于培养基上进行培养。,9.1.3胚的剥离,把胚从周围组织中剥离出来,子房,种子,胚珠,胚,小种子或胚很小必须借助解剖镜进行,先把消过毒的蒴果（图10. 2A）放在几滴无菌培养基中。,然后切开胎座区域，用镊子将外壁的两半撑开，露出胚珠（图10. 2B)。,由胎座上取下的1个胚珠放在载玻片的凹穴中（内有1滴培养基），然后用一把锋利的有柄刀片将胚珠纵切成两半（图10. 2D)，,鱼雷形胚或更幼龄的胚位置都局限在纵向剖开的半个胚珠之中（图10. 2D)，由于它们的绿色或由于它们透明的胚柄囊，因而透过合点清晰可见。在剥取这种未成熟胚的时候，将留下有胚的一半，仔细地剔除胚珠组织，即可把连着胚柄的整个胚取出。,在剥取较老的胚时，在胚珠上无胚的一侧切一小口（图10. 2C)，用一根钝头解剖针轻压珠被，即可把完整的胚挤出到周围的液体中。整个操作过程（特别是在剥取未成熟胚时）必须小心进行，以免使胚受伤。,注意： 在剥取更小的胚时，要避免它们在操作过程中干掉。,9.1.4培养,胚乳看护培养,在人工培养基上幼龄胚通常很难培养。尽管培养基已经有了不少改进，但胚的夭折若发生在发育的极早期，要想拯救杂种仍有很大困难。,放在胚乳旁边,在进行未成熟胚离体培养的时候，如果在其周围培养基上存在着来自同一物种另一种子的离体胚乳，对胚的生长会有明显的促进作用。,放在胚乳上,在某些属间杂交中，若把杂种未成熟胚放在事先培养的大麦胚乳上培养，能够显著提高获得杂种植株的频率。 例如：在大麦和黑麦属间杂交中，采用这种方法30%-40%的杂种未成熟胚可以发育成苗，而用传统的胚培养法则只有1%。,嵌入胚乳中,把杂种离体幼胚嵌人到由双亲之一或第三个物种的正常发育的胚珠取出来的胚乳中，然后把二者一起放在人工培养基上培养。,9.1.5对培养基和培养条件的要求,Raghavan把胚胎发育过程分为两个时期,异养期：在这个发育早期，胚依赖于由胚乳及周围的母体组织中吸取养分。,自养期：在这个时期胚在代谢上亦能由基本的无机盐和糖合成为生长所需的物质，因而在营养上已相当独立。,胚由异养转入自养是胚发育的一个关键时期，但这个时期出现的早晚因物种而异。,在荠菜中，胚在球形期以前肯定是异养的，只有到心形晚期它们才转为自养。就是在这两个时期之内，培养中的胚对外源营养的要求也会随着胚龄的增加而渐趋简单。,为使胚正常生长，在培养过程中必须把它们由一种培养基转入另一种培养基。,Monnier(1976,1978)介绍了一种新的培养方法，用这种方法可以使50 m长（球形早期）的荠菜胚在同一个培养皿中无须变动原来的位置即完成全部发育过程，直至萌发。,用于胚培养的无机盐配方很多，互不相同，对其中每种成分的作用并无精确的评价。Monnier (1976)在研究各种标准的无机盐溶液（包括Knop,Heller,MS培养基等）对荠菜胚培养的作用时发现，在一定的培养基上，未成熟胚的生长和存活之间并不存在相关性。,1. 无机盐,在MS培养基中，未成熟胚的生长情况虽然最好，但存活率却很低。在Knop培养基中，虽然它的毒性最小，但胚的生长情况很差。,为此他变动了ms培养基中每一种盐分的浓度，以研究这类变动的效果。在这些实验的基础上，他推出了一种新的培养基，在这种培养基上，胚的生长与在MS培养基上一样理想，同时存活率也很高。与MS培养基中的无机成分相比，在Monnier培养基中K十和Ca+的浓度较高，而NH4+的水平较低。,据Umbeck和Norstog(1979)报道，培养基中的NH4+对于大麦未成熟胚的正常生长和分化是必需的。当以NO3-作为无机氮的惟一来源时，500 m长的大麦胚在培养中只能略有生长，而这主要是由于细胞伸长造成的。盾片等的分化则需要有4.3-8.6 mmol/L NH4+的存在。在曼陀罗和紫花曼陀罗中，特别是对未成熟胚的培养来说，NH4+是必需的，或是一种较好的无机氮；另一方面，黄麻的胚则绝对需要硝态氮。,2. 碳水化合物和培养基的渗透压,蔗糖被认为是最好的碳源。蔗糖的作用有二：提供能源调节渗透压，对未成熟胚的培养这个作用更重要。成熟胚在含2蔗糖的培养基中就能长得很好，但幼龄胚则要求较高水平的碳水化合物。适于原胚的蔗糖浓度一般为812，随着培养时间的增加，必须转移到蔗糖水平逐步降低的培养基中。,Raghavan和Torrey认为，胚在离体条件下的生长和分化在很大程度上并不依赖于渗透压的大小，而主要取决于某些生长调节物质的存在与否。高渗透压阻止离体未成熟胚早熟萌发的作用可以用ABA有效地取代。高渗透压的这种有利影响是否是通过它对内源激素库的作用而表现出来的，还有待今后的实验予以说明。,在培养基中加入氨基酸，无论是单一的还是复合的，都能刺激胚的生长。 单一氨基酸以谷氨酰胺（Gln）最好，天冬酰胺（Asn）对促进胚的生长也很有效。,3. 氨基酸和维生素,复合氨基酸的作用好于单一氨基酸，可能是氨基酸之间存在着一种协同作用。 复合氨基酸中一水解酪蛋白（CH）最好，但胚对CH浓度的敏感程度因物种而异，如毛曼陀罗和曼陀罗的胚在400mg/LCH培养基上生长的最好，50mg/LCH能促进紫花曼陀罗胚的生长，但100mg/L时则有毒害作用。,虽然各种维生素一直被用于胚培养中，但它们的存在并非总是必要的。在有些情况下，维生素甚至可能对形态发生过程表现抑制作用。因而，最好是只有在通过试验验证了它们的必要性之后，再在培养基中加入维生素。,椰子汁（CM）,4. 天然的植物浸提物,Van Overbeek等（1942）发现，在一种含有1葡萄糖、1%琼脂、无机盐、甘氨酸、硫胺素、抗坏血酸、烟酸、维生素B6、腺嘌呤、琥珀酸和泛酸的培养基上，曼陀罗鱼雷形期以后的胚能形成正常的幼苗。但心形胚和更幼龄的胚则不能发育。,鉴于未成熟胚在胚珠中是被胚乳包围着的，Van Overbeek等（1942)在上述培养基中添加了不经高压灭菌的椰子汁（CM，椰子的液体胚乳），以期培养更幼龄的胚。在这种改良培养基上，这些作者得以由小至150-200 m长（心形期）和幼至授粉后10d的胚获得了正常的幼苗。,在椰子汁中存在的这些促进生长的因子被称为“胚因子”。“胚因子”的发现是胚培养史上的一个转折点，此后在若干物种中幼胚培养都获得了成功。,为了找到一种适当的物质以能取代椰子汁进行紫花曼陀罗心形期以前幼胚(G150 pm长）的培养，Matsubara(1962）曾试验过很多种天然物质，其中包括水解酪蛋白、干酵母、银杏胚乳和若干种被子植物种子得到的浸提物，其中羽扇豆幼龄种子和佛手瓜成熟种子的酒精浸提物与椰子汁效果相同。,Kent和Brink (1947 )报道，海枣和香蕉浸提物、小麦面筋水解物、牛奶、番茄汁，能够促进大麦未成熟胚的生长和抑制它们的早熟萌发。,为了由胚和胚段诱导愈伤组织，通常都需在培养基中加入生长素或细胞分裂素，或二者都加。然而，除了在某些植物中为了打破休眠以外，没有证据表明离体的成熟的或未成熟的胚的正常发育需要生长调节物质。实际上，生长素对于胚的生长通常表现抑制作用。,5. 生长调节物质,Monnier(1978)建议，在胚培养基中不应加人植物激素，以免引起结构异常。他认为胚对大多数生长调节物质都是自主的。在这点上至少对GA3来说已在菜豆上得到了清楚的证明，其中胚柄可以满足离体胚对激素的需要。,6. 培养基的pH,不同植物胚或胚的不同发育阶段对pH要求不同。 如紫花曼陀罗心形早期的胚培养最适pH值为5.07.5，荠菜的胚培养最适pH值为5.47.5。,7. 培养条件,温度：多数在25-30之间生长良好。光： 一般认为光对于胚的生长不很重要。,9.2.1 胚柄在胚培养中的作用,胚柄是一个短命的结构，长在原胚的胚根一端，一般是当胚达到球形期时胚柄发育到最大限度。有的研究表明胚柄积极参与幼胚的发育过程。,9.2 胚柄在胚培养中的作用和胚的早熟萌发,较老的胚无论有无完整的胚柄在培养中都能正常的生长，幼胚若去掉胚柄就会显著降低形成小植株的频率。胚柄在胚培养中的作用：产生生长调节物质，特别是GA3。去掉胚柄会引起胚的损伤。,由于胚柄既小又易受损伤，很难把它与胚一起剥离出来，因而在一般情况下培养的胚都不具完整的胚柄。然而有些研究指出，在培养中胚柄的存在对于幼胚的存活是个关键因素。,Cionini等（1976)看到，在红花菜豆中虽然较老的胚(500 pm或更长）无论有无完整的胚柄在培养中都能正常生长，然而在幼胚培养中，去掉胚柄就会显著降低形成小植株的频率。,Yeung和Sussex(1979)指出，和无胚柄的胚培养相比，若胚柄完整地连在胚上，或虽与胚分离但在培养基上与胚紧紧相靠，则会显著刺激胚的进一步发育。,按照这些作者的看法胚柄促进生长的活性在胚的心形早期达到高潮。在所试验过的各种生长调节物质中，浓度为5 mg/L的赤霉素最能有效地取代胚柄的作用。这个发现与Alpi等（1975)的实验结果一致。 Alpi指出，在红花菜豆中，心形期时胚柄中赤霉素的活性比胚本身中约高30倍。子叶形成之后，胚柄开始解体，其中赤霉素的水平急剧下降，但在胚本身中赤霉素的水平增高。,9.2.2 胚的早熟萌发,胚的发育过程：分裂和分化期 ：细胞分裂但很少生长；分化各种主 要组织。生长期 ：细胞体积迅速增大并分裂成熟期 ：很少发生或不发生细胞分裂或体积增大， 合成并贮存各种贮藏休眠期 ：发育停滞萌发期 ：细胞体积重新增大并发生分裂；胚生长,在胚培养或发育过程中未经完成正常的胚胎发育过程而形成幼苗的现象叫做早熟萌发。,离体的未成熟胚在培养基上不仅能越过休眠期，而且还常常终止进行此后的胚胎途径的发育，它们并不表现晚期胚胎发生过程所特有的正常生物合成活性，相反的它们长成幼小的幼苗，而且这些幼苗只具有那些当胚离体时已具有的结构。,在胚培养过程中，应抑制早熟萌发。,抑制早熟萌发的外界因子,高渗透压：培养基中加入CH；或培养基中高浓度的蔗糖（1218）,低氧压,高温,高光强,脱落酸,GA3可诱发某些植物未成熟胚的早熟萌发。,目的是克服受精后障碍，获得有萌发能力的杂种胚。方式有三种：杂种幼胚在人工培养基上培养杂种幼胚的胚乳看护培养杂种幼胚的愈伤组织培养,9.3 通过“胚拯救”获得远缘杂种,杂种幼胚在人工培养基上培养,把杂种胚在开始夭折之前剥离出来，置于一种适当的人工培养基上培养，则杂种胚表现出正常的生长潜力，最终长成杂种植株。,杂种幼胚的胚乳看护培养,如果胚的夭折发生在发育的极早期，人工培养基很难取代天然胚乳的作用，采用第一种方法拯救杂种仍会遇到很大困难，在这种情况下，则可以尝试胚乳的看护培养。,杂种幼胚的愈伤组织培养,在以上两种方法皆难凑效的情况下，则可尝试杂种幼胚愈伤组织培养法，即先把杂种幼胚诱导成愈伤组织，经过或短或长的继代培养之后，再诱导杂种愈伤组织分化植株。,杂种幼胚愈伤组织培养获得杂种植株的程序：1.有性杂交2.杂种幼胚培养3.杂种愈伤组织形成和继代4.愈伤组织增殖与茎芽分化5.愈伤组织继续边增殖边分化，再生植株边增 殖边壮苗6.杂种愈伤组织细胞染色体加倍7.杂种试管苗染色体加倍8.炼苗和移栽9.再生植株,9.4胚分化不全的种子在培养中的形态发生,胚分化不全的种子:在很多显花植物（属于19个科）中，在植株上已发育充分的种子其胚内并无胚根、胚芽和子叶的分化。,在菟葵（毛茛科）中，种子在脱落时所含的胚为梨形，只包含几百个细胞，有一个长的胚柄。待种子落到地面之后，胚通过种子内生长，最后才具备了一个成熟的双子叶植物胚的一般形态。,在兰花以及在列当科的若干根寄生成员中，种子中的胚也是尚未分化的；但在这些植物中，胚不能发生种子内生长现象，球形胚不经进一步胚胎分化即直接形成幼苗。,在这类植物的胚中，靠近珠孔的一端称做“胚根极”，背离珠孔的一端称做“胚芽极”。在兰花和这些列当科植物中，胚的两极中都只有一极参与种苗的发育。,在兰花种子萌发期间，胚的胚芽极增大，形成一个类似小球体的结构，称做原球茎。起初原球茎不含叶绿素，以后逐渐转绿。达到一定大小之后，原球茎分化出根和茎。在兰花中整个幼苗就是以这种方式，只是通过胚的胚芽极的分裂而形成的。在各种兰花的种子培养中，幼苗发育的方式几乎全是这样。,与兰花不同，在属于列当科的根寄生植物中，幼苗一般只是通过胚的胚根极的活动形成的。,Kadry等研究发现，在列当科植物Orobanchecrenata中，种子萌发时胚的胚根极形成一个“胚根柱”，其顶端能穿入寄主的根。留在寄主根外的那部分胚根柱进行增殖，形成一团不规则的组织，称做小块茎，从中分化出茎。,但Kumar等指出，若改变培养基成分，这类寄生植物幼苗发育的方式可由单极性变为双极性。在补加CM或酵母浸出物的TB培养基上，萌发是单极性的（幼苗只是由胚根极的活动形成的）。在TB培养基中，若加入IAA (0.1 mg/L)，激动素(0.5-10 mg/L)，GA3(5-30 mg/I.)或Strigol(0.01g/L)，幼苗发育的方式即变为双极性的：胚芽极分化成一个茎芽，胚根极长出根。,在TB培养基中，若以葡萄糖、甘露糖或棉子糖取代蔗糖，也会促进双极性萌发。在补加GA3(7.5 mg/L）的TB培养基上双极性幼苗发育方式的频率最高。,菟丝子属（Cuscuta）植物的成熟胚具有一个明显的胚芽，但没有胚根。无论是在冤丝子的胚胎发生过程中还是在成熟胚中，都不存在原表皮层、根分生组织或下胚轴。当种子在活体中萌发时，由胚芽形成一个茎，但胚的胚根端在萌发开始后4-5d逐渐死掉。因此在这种植物中完全没有根系。,Truscott(1966)在菟丝子成熟胚和未成熟胚的培养中，为了试验能否人工诱发生根，曾在培养基中加人了各种生长物质，如腺嘌呤、激动素和GA3，或复合营养物质如CM或CH，然而，所有这些处理没有一个能诱发生根。Truscott由此断定，菟丝子不具生根潜力。,Swamy报道兰属植物的合子休眠期为2个月。但也有人报道，兰属合子的休眠期为30天。,兰科植物的胚只保持在球形胚阶段而不再进一步发育。球形胚的大小及细胞数目，则因种类不同而异。如天麻的球形胚，仅有十几个细胞，而建兰的球形胚有几十个细胞。这些细胞中，都贮藏了丰富的脂滴。,兰花胚发育特点：,兰属植物的胚乳不发育，但有些种胚柄发达。在墨兰胚的发育中观察到有3-8条胚柄。这些胚柄是单细胞的，长度可与胚体的长度相等。当种子成熟时，胚柄已消失。,兰属植物的种子数量很大，个体很小。一枚兰花果实中的种子数量从1300-4 000 000粒之多。种子的长度从0.25-1.2mm。种子的形状多样化，有椭圆形、纺锤形、圆球形等等。种皮有薄有厚，有的种皮透明，有的则呈深棕色。种子内含有丰富的贮藏物。兰属中许多种的种子呈两头稍尖的细长的纺锤形、种子内含有32的脂肪，1的糖。,兰科植物中的附生种，其种子一般容易萌发，而地生种则较困难。生长在热带地区的附生种，种子萌发率高，萌发所需时间短；而生长在温带地的地生种，如春兰、蕙兰等则自然的萌发率极低，萌发时间长达半年或9个月之久，成为所谓萌发困难的种。,造成萌发困难的原因，可能是多方面的：（l）种子的小胚分化不完全；（2）没有胚乳，缺乏萌发时所需要的营养来源；（3）种皮的透水性差，不易吸水膨胀，促使胚中的酶分解；（4）种皮里可能存在某些抑制种子萌发的物质。,由于自然萌发的频率极低，所以杂交所得到的种子还需要进行人工培养，才能获得幼苗。,生长习性不同的附生兰和地生兰的种子在无菌培养后，萌发过程中的形态发生也存在着差异。,附生种的种子萌发初始，都形成白色的圆球形的原球茎。随着原球茎体积的增大，其上出现毛状假根，继而原球体转变为绿色，但原球茎不伸长，在原球茎顶端出现芽。整个外观与荸荠颇为相似。顶端的芽，长大分化出茎和叶。,地生种的种子萌发时，种子中的胚突破种皮后，开始白色圆球形，但很快就伸长，成为长柱形，是为地下茎或根状茎。在根状茎表面有间隔地长出一丛丛毛状假根。根状茎的顶芽分化出芽、转移到分化培养基上培养，可长成幼苗。,温暖,春暖花开,妈妈的嘱托,蝴蝶的爱情,恭喜发财,纯洁的爱,蝴蝶兰的胚培养技术及其快速繁殖研究王慧瑜 ,张晓申 ,杨录军等,蝴蝶兰属热带气生兰，多产于热带亚洲，其株型美观、色彩艳丽、花期持久，在热带兰中有“兰花皇后”之美称，是兰科植物中栽培最广泛、最普及的种类之一，它属单茎性气生兰，植株极少发育侧枝，常规情况下种子发育不完全，极难萌发。因此世界上多采用组织培养来繁殖种苗。胚培养技术比较简单，为此我们对蝴蝶兰胚培养技术和快速繁殖进行了系统的研究，为我国的蝴蝶兰的大规模工厂化生产提供参考。,1 材料与方法,1. 1 材料,3 个蝴蝶兰杂交品种。即红花1号,粉红1号,条纹1号。,1. 2 方法,1. 2. 1 外植体消毒,将蝴蝶兰杂交种的果荚，以70 %的酒精表面消毒15s后置于10%次氯酸钠溶液中消毒15 min，再用0. 1 %的氯化汞消毒5 min ，再用无菌水冲洗56 次。,2. 2 接种 超净工作台上，用无菌手术刀将果荚前后两端各切去一部分以不露出胚为好。然后用手术刀把中间部分切开，用无菌镊子夹出其中的胚，浸入小半瓶无菌水中，使之扩散均匀。最后用吸管将胚带水吸出接种在培养基上。每瓶胚量不能太多。,2. 3 培养条件 培养基采用1/ 2MS ,VW，改良KC 和改良N6 ,进行播种胚培养试验。培养温度2528,每日光照10h12h，光照强度1600 lx2000 lx。,2. 1 胚在不同培养基上发芽、生长情况 分别以1/ 2MS ，VW，改良KC 和改良N6 为培养基，加入5 %香蕉汁，将红花1号，粉红1 号，条纹1 号金黄色胚无菌播种后，进行观察，从表可以看出，在4 种培养基上胚生长情况不一样，在改良KC 培养基中胚的萌发情况和成苗率都最好。无菌播种一周后，胚由金黄色转为淡黄色。这是由于胚吸水膨胀，撑破种皮形成淡黄色胚，然后胚由淡黄色转为绿色，2个月后形成第一个芽鞘。,2. 2 不同成熟度种子胚对发芽的影响 在培养中发现,荚果内种子胚的颜色为乳白色和淡白色，播种后发芽率为30左右,并且生长也很慢，部分胚自然变黑、老化死亡。果荚内种子胚颜色为乳黄色和淡黄色的，播种后发芽率在50左右，生长较慢，部分胚变黑、老化死亡。果荚内种子胚颜色为金黄色时，播种后发芽率在85 %以上，生长较快，成苗率也较高。可见，荚果的成熟度对种子胚播种后的发芽成苗有很大影响。,2. 3 小苗的转接和移栽 把胚培养的小苗转接23 次，就可以长到4 cm高，具有34 片叶的出瓶苗。转接培养基以改良KC，附加香蕉汁15 %，活性炭0.4 % ，蔗糖3 %，试管苗生长良好。试管苗移栽以35 月份内为好，将试管苗取出，用自来水清洗其根部的培养基，将根部放于70 %甲基托布津药液中消毒4 h (小时)，药液浓度为1500 倍，晾干后放于背荫处准备定植。,定植材料为水苔，定植后半个月，每两周施肥一次。管理要求是：温度18 28 ，前两周湿度80 %90 %为宜，后渐渐保持在70 %左右。蝴蝶兰对光的要求是15002000 lx，采用加盖2 层60 %的遮阳网为好，移栽后2年内可以开花。,9.5 胚愈伤组织的形态发生潜力,和由成熟器官如叶片、茎或根所产生的愈伤组织相比，已知胚愈伤组织具有高度的再生能力，特别是在禾谷类植物中，这种差别非常明显。,Dale和Deambrogio (1979）培养了大麦的顶端分生组织、中胚轴、叶鞘、未成熟胚和成熟胚，其中由根和胚做外植体产生的愈伤组织长得最好，但只有未成熟胚愈伤组织能进行茎的分化。,蔡体树等（1989)曾对34种基因型的小麦未成熟胚对离体培养的反应进行了比较，结果表明，94的供试基因型愈伤组织诱导频率都可达到80以上，不同基因型幼胚愈伤组织诱导频率之间不存在显著差异。然而，愈伤组织分化频率则因基因型的不同而不同，变动在060之间，平均为32.70，此外，他们的研究还表明，虽然最适于培养的未成熟胚的大小为1 mm左右，但小至0. 3 mm的未成熟胚仍能以几乎100的频率形成愈伤组织，60左右的愈伤组织能分化出再生植株，只是所需的时间比1 mm左右的胚较长。,枇杷幼胚培养与体胚诱导植株再生沈庆斌，赖钟雄，蔡汉权等,1 材料与方法11 供试材料“解放钟”与“长红3号”采自福建农林大学果树园，“早钟”采自福建省农科院“国家枇杷种质资源保持圃”。,12 幼胚培养 于2003年1月26日取枇杷成年结果树上的幼果，此时“解放钟”与“长红3号”的幼胚发育阶段介于鱼雷形胚与子叶形胚初期之间，长15 mm；“早钟”处于子叶形胚初期阶段。长37 mm，经常规方法消毒后，挑取幼胚作为外植体，操作时避免对幼胚的损伤。基本培养基为MS培养基，蔗糖浓度为20 gL，琼脂浓度为7 gL，pH 58，培养条件为暗培养(251)。,影响枇杷幼胚愈伤组织的诱导因素有AgNO3与生长调节剂： 设置了6种培养基(M1M6)，比较AgNO3 与2,4-D对枇杷幼胚培养的影响。每瓶接3个幼胚，每种培养基接30个，重复2次。M1M6培养基成分如下：Ml：MS+2,4-D2；M2：MS+2,4-D1；M3:MS+2,4-D1+KT0.5；M4：MS+2,4-D1+KT0.5+AgNO35；M5：MS+2,4-D1+BA0.5；M6：MS+2,4-D2+BA0.1+ AgNO35。(AgNO3 与生长调节剂浓度单位为mg L),13 枇杷胚性愈伤组织筛选 对所诱导的各种不同类型愈伤组织进行筛选，剔除生长势弱、褐变严重的愈伤组织，继代保持生长势强、无褐变的愈伤组织，并对该类型愈伤组织进行初步胚性检测。,1.4 影响枇杷胚性愈伤组织的继代因素1.4.1 AgNO3 与生长调节剂 在M7M12 6种培养基上连续继代枇杷胚性愈伤组织，比较AgNO3与2,4-D对枇杷胚性愈伤组织的影响。每瓶接3块愈伤组织切块，每种培养基接30块。M7M12培养基成分如下：M7：MS+2,4-D1+KT0.25；M8：MS+2,4-D1+KT0.25+ AgNO3 5；M9：MS+2,4-D1+BA0.25；M10：MS+2,4-Dl+BA0.25+ AgNO3 ；M11 ：MS+2,4-D0.5+KT0.25；Ml2：MS+2,4-DO.5+BA0.25。,1.4.2 蔗糖浓度比较 附加20、50 gL不同浓度蔗糖，2,4-D1，KT 0.25培养基对枇杷胚性愈伤组织的继代影响。每瓶接3块愈伤组织切块，每种培养基接30块。1.4.3 光照强度比较 强光照(1100 Lx)、弱光照(300 Lx)、暗培养3种培养条件，附加2,4-D1，KT0.25培养基对枇杷胚性愈伤组织的继代影响。,结果表明：附加2 mgL 2,4-D的MS培养基可高频率诱导枇杷幼胚愈伤组织；采用附加1 mgL 2,4-D、0.25 mgL KT的MS培养基与附加1 mgL 2，4-D、0.25 mgL KT和5 mgL AgNO3的MS培养基交替暗培养，可长期保持枇杷愈伤组织胚性；枇杷具有很强的体胚发生能力和很高的成苗率。,9.6 胚培养在农业中的应用,9.6.1 通过“胚拯救”获得远缘杂种,9.6.2 植物的繁殖,9.6.3 种子生活力的快速测定 由于通过胚培养可以打破种子休眠，因而也可以利用这项技术进行种子生活力的快速测定。和一般用于种子生活力测定的染色方法相比，离体胚的萌发被认为是一个更可靠和更精确的测定方法。,9.6.4 缩短育种周期 在有些情况下，园艺植物如落叶树的育种工作，会因种子休眠期太长而延误。通过胚的离体培养，可使休眠期缩短。例如，Randolph和Cox(1943）通过胚培养使鸢尾的生活周期由2-3年缩短到1年以下。,Nickell (1951)报道，垂枝山楂子（苹果属）的离体胚在培养中48 h内即开始萌发，4周之内即能形成适于移栽的幼苗，5个月之后幼苗就能长到大约1 m高。而种在土中的种子需要9个月才能萌发。 在桃和李的某些杂种中，通过胚培养得到的植株开花早，每株花数多，在这些方面都优于通过种子沙藏处理产生的植株。,9.6.5 获得单倍体植株 Kasha和Kao(1970)发现，在四倍体栽培大麦和四倍体球茎大麦的种间杂交中，几乎所有后代植株都是双单倍体。与此相似，把这两个物种的双单倍体杂交，后代中出现了单倍体。在形态上和细胞学上，这些后代都与栽培大麦相似。细胞学研究表明，在这些杂交中双受精正常发生，但在杂种胚的早期发育过程中，球茎大麦染色体被选择性地淘汰了，因而所形成的胚只含有栽培大麦的染色体。在这些杂交中，胚通常在授粉后10d夭折。为了得到完整的植株，必须把未成熟胚剥离，在人工培养基上培养。,