第二章天然产物化学成分提取分离方法ppt课件.ppt

第二章,天然产物化学成分的提取分离与结构鉴定,2-1 天然产物化学成分的提取,1、 天然产物化学成分的构成特点 同种植物含有多种结构类型的化学成分 总成分含量少、种类多有效成分含量低,概 述,2、提取分离前的文献调研,一、天然产物化学成分的预试验与系统提取（一）天然产物化学成分的预试验 初步了解所含成分情况，然后再进行有计划、 有针对性的提取分离。,1.系统预试验根据各成分极性的不同，选择不同极性的溶剂，将天然产物化学成分系统的分成几个不同的部分，然后再利用显色反应或沉淀反应或结合纸色谱、薄层色谱定性判断各部分中可能含有的化合物成分类型。,2.单项预试验 生物碱：在酸性条件下与碘化铋钾显棕黄色或橘 红色沉淀。 黄酮：黄酮类化合物的乙醇溶液中加入镁粉，滴 入浓盐酸后振荡，泡沫显桃红色。 皂苷、强心苷、甾体：其乙酐溶液与浓硫酸反应 后显示各种颜色皂苷； 水溶液振荡时能产生大量 泡沫。,酚类：与三氯化铁反应显示各种颜色。糖苷类：与斐林试剂反应有砖红色沉淀生成。有机酸：与溴酚蓝反应显黄色。氨基酸、多肽：与茚三酮反应显蓝紫色。蛋白质：双缩脲反应显紫红色。,（二）天然产物化学成分的系统提取,1.系统溶剂提取选择几种不同极性的溶 剂，由低极性到高极性进行分步提取，使 各成分依其在不同极性溶剂中的溶解度不 同而得以分别提取出来。 常用的两种溶剂系统为：（1）己烷乙醚甲醇水（2）己烷二氯甲烷甲醇水,2.单一溶剂提取根据水可提取极性成分，石 油醚可提取非极性成分，醇能提取大部分成分 的特点，用一种溶剂将性质相近的组分集中在 一起提取出来。3.混合溶剂提取采用两种或两种以上混合溶 剂进行提取，有时会提高提取效率。,二、天然产物化学成分的传统提取方法,（一）溶剂提取法,提取原理:根据天然产物化学成分与溶剂间“极性相似相溶”的原理，依据各类成分溶解度的差异，选择,对所提成分溶解度大、对杂质溶解度小的溶剂，依据“浓度差”原理，将所提成分从天然材料中溶解出来。,提取依据：被提取化学成分的溶解性（极性）,提取的关键：提取溶剂的选择,溶剂的选择原则： 与所提成分不发生化学反应; 对所提成分溶解度大,对杂质溶解度小; 价廉、易得、无毒、安全、易于回收等。影响溶剂提取的因素： 化学成分的极性:被提取成分的极性是选择溶剂 的最重要依据,影响化合物极性的因素： (1) 化合物分子母核大小（碳数多少）：分子大、碳数多，极性小；分子小、碳数少，极性大。 (2) 取代基极性大小：在化合物母核相同或相近情况下，化合物极性大小主要取决于取代基极性大小。 常见基团极性；酸酚醇胺醛酮酯醚烯烷 举例：判断下列各组化合物极性大小。,提取溶剂的选择(1)溶剂的分类: 强极性溶剂水、酸水、碱水 亲水性有机溶剂甲醇、乙醇、丙酮(可与水 任意混溶) 亲脂性有机溶剂乙醚、氯仿、苯、石油醚 等(不与水混溶)（2）常用溶剂极性大小：水甲醇乙醇丙酮正丁醇乙酸乙酯乙醚氯仿苯四氯化碳正己烷石油醚。,常用的溶剂提取方法（1）浸渍法（2）渗漉法（3）煎煮法（4）回流提取法（5）连续回流提取法,（二）水蒸气蒸馏法,该法适用于具有一定挥发性，能随水蒸气蒸馏而不被破坏、难溶或不溶于水的化学成分的提取分离，例如挥发油、某些小分子生物碱（如麻黄碱、烟碱、槟榔碱）、某些小分子的酚性物质如牡丹酚等酚类、少数挥发性蒽醌苷元、香豆素苷元等，可采用水蒸气蒸馏法提取。,（三）升华法,天然产物化学成分有少量具有升华性，如茶碱、咖啡因、游离羟基蒽醌类成分、一些小分子香豆素类成分等。,升华法提取咖啡因,（四）分馏法 （利用沸点不同）,（五）吸附法（氧化铝、氧化镁、活性炭等）,（六）沉淀法,铅盐法：利用乙酸铅在水或稀醇溶液中能与许多物质 生成难溶性的铅盐。脱铅方法：硫化氢气体,（七）盐析法（提取液中加入无机盐）,（八）透析法,利用小分子物质在溶液中可通过半透膜，大分子物质不能通过的性质达到分离的方法。,三、天然产物化学成分的现代提取方法（强化溶剂提取法）,（一）超临界流体提取法(supercritical fluid ertraction, SCFE或SFE)：以超临界流体作为提取溶剂的一种提取新技术。超临界流体(supercritical fluid, SCF) :处于临界温度(Tc)、 临界压力（Pc）以上、介于气体与液体之间的流体。,SCF特点：具有液体和气体的双重特性，萃取效率高； 萃取过程几乎不用有机溶剂；萃取流体可循 环使用,节约能耗。常用的SCF有：二氧化碳、氨、乙烯、丙烷等,超声波提取就是利用其具有的机械效应、空化效应、热效应及次级效应，通过增大介质分子的运动速度、穿透力以提取天然产物化学成分的方法。,（二）超声波强化辅助提取法,（1）超声波提取是一物理过程，对天然产物的生 物活性无破坏，适宜于热敏性成分的提取。（2）超声波提取过程不需加热，提取时间短，节 省能源。（3）超声波提取过程溶剂耗量少，提取效率高。,优点：,（三）微波辅助提取（microwave-assisted extraction,MAE）法,微波提取法是利用微波能来破坏植物细胞的细胞壁和细胞膜，从而达到提取细胞内有效成分的目。,(1)微波加热的热效率较高，升温快速而均匀，显著缩短了提取时间，提高了提取效率。(2)选择性高，溶剂耗量少，适宜于热敏性成分的提取。(3)重现性好，适用范围广。(4)设备简单、投资少，操作简单、方便。,优点：,（四）酶法提取,一、根据物质溶解度差别进行分离,1、结晶,利用温度不同引起溶解度的改变而使有效成分以晶体的形式析出以达到分离物质的目的。,2、溶剂沉淀,在溶液中加入另一种溶剂以改变混合溶剂的极性，使一部分物质沉淀析出，从而实现分离。,3、调节pH,4、盐析沉淀,2-2 天然产物的分离和纯化,调节溶液的pH值，改变分子的存在状态（游离型或解离型），从而改变溶解度而实现分离。,通过加入某种沉淀试剂使之生成不溶于水的盐类沉淀析出。,二、根据物质在两相溶剂中的分配 比不同进行分离,液-液萃取法,液-液分配柱色谱法,将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上,作为固定相,填充在色谱管中,然后加入与固定相不相混溶的另一相溶剂 (流动相)冲洗色谱柱。这样,物质同样可在两相溶剂中相对作逆流移动,在移动过程中不断进行动态分配而得以分离。这种方法称之为液-液分配柱色谱法。,三、根据物质的吸附性差别进行分离,吸附的目的： 一是吸附除去杂质（常指鞣质、色素等）； 一是吸附所需物质，然后再用适当的方法进行解吸。,吸附的类型：物理吸附：也称表面吸附，因构成溶液的分子与吸附剂 表面分子的分子间的相互作用所引起的； 特点：无选择性，吸附和解吸附过程可逆，可快 速进行，故实际工作中用的最多；常见吸附剂：硅胶、氧化铝、活性炭吸附等。,化学吸附：如黄酮等酚酸性物质被碱性氧化铝的吸附， 或生物碱被酸性硅胶的吸附等； 特点：具有选择性，吸附牢固，不可逆，故用的 较少。半化学吸附：如聚酰胺对黄酮、醌类等化合物之间的氢 键吸附，力量较弱，介于物理吸附与化学 吸附之间。,活性炭： 非极性吸附剂，对非极性物质具 有较强的亲和力。硅胶和氧化铝（柱色谱）：极性吸附剂。聚酰胺： 氢键吸附，极性物质和非极性物质均可适用，可用于酚类、醌类、黄酮类、鞣质的分离。 大孔吸附树脂： 一种具有大孔结构的高分子吸附剂，分为非极性与极性两类。性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性好，所以在中药化学成分的分离中被广泛应用。,四、根据物质分子大小进行分离,透析法、凝胶过滤法：利用半透膜的膜孔或凝胶的三维网 状结构的分子筛的过滤作用；超滤法：利用分子大小不同引起的扩散速度的差别。,五、根据物质的解离程度不同进行分离,酸性、碱性及两性基团的化合物在水溶液中多呈解离状态，可以与离子交换树脂上的基团交换，从而与其它非解离性物质分开，常用的是离子交换法。,六、色谱法,1、色谱法的基本原理：利用混合物中各组分的物理性 质不同而在两相（固定相和流动相）之间的不均匀 分配进行分离的 一种方法。2、色谱法的分类(1)按流动相类型进行分类：气相色谱、液相色谱(2)按操作形式进行分类：纸色谱(PC)、薄层色谱（TLC）、柱色谱（CC）、毛细管色谱(CTC)等。,2-3 天然产物化学成分的结构鉴定与测定,一、天然产物化学成分结构鉴定的一般程序 和方法二、四大谱在天然产物化学结构鉴定方面 的应用三、立体结构的测定方法四、一些天然产物结构的光谱特征,程序,方法,纯度检验,1.检查有无均匀一致的晶型、颜色2.有无敏锐的熔点3.TLC在三种展开剂中均呈单一点4.GC或HPLC,初步推断化合物类型,1.观察样品在提取过程中的行为2.测定其相关理化常数3.结合文献调研,测定分子式计算不饱和度,1.元素定量分析及分子量测定（同位素峰度比法及HR-MS）,确定分子式2.计算不饱和度,确定分子中含有的官能团、结构片段或基本结构骨架,1.官能团定性分析2.测定并解析化合物的 有关谱学数据3.结合文献调研,判断并确定分子的构造式,1.综合分析有关谱学数据及 官能团定性定量分析结果2.与已知化合物进行多方比较,推断并确定分子的立体结构（构型、构象）,1.测定ORD或 CD2.测定NOE或2D-NMR3.进行X-射线衍射分析,1.获得样品的背景信息 2.根据样品来源和参考文献(原始文献和二手 文献)确定化合物类型 3.测定样品的物理常数,查阅有关文献手册, 初步判断样品是已知物或未知物,若是已知 物,则按已知物的程序进行鉴定;若是未知 物则按未知物的程序进行结构测定.,一、天然产物化学成分的结构鉴定与测定 的一般程序和方法,（一）已知化合物鉴定的一般程序和方法,1.纯度检验2.测样品的物理常数，与已知标准品的文献值对照， 比较是否一致或接近。3.测样品与标准品的混熔点。4.将样品与标准品在三种溶剂系统中共色谱 (PC或TLC),比较其Rf值是否一致。5.测样品的IR光谱图,与标准品的图谱或与标 准谱图进行比较。,检查纯度的方法： 外观、颜色、形态是否均一； 测定各种物理常数，如熔点、沸点、比旋光度、 折光率等，这些物理常数都能反映化合物的纯度。 如果是已知物，用已知结构的对照品进行 对照测定或测定它们的共熔点等；也可对照文献报导值（注意各种测定条件的一致性） 薄层层析（三种展开系统和三种显色方法）GC、HPLC等；,(二)未知物结构测定的一般程序与方法,1.纯度检验，物理常数测定，与文献值比对。2.进行检识反应，确定样品类型。3.进行元素定性、定量分析，测得分子量， 确定分子式。 4.测四谱并综合分析四谱数据，推导出化合物 的基本结构骨架信息。5.根据推出的结构，将所测得的四谱，特别是 NMR谱的数据进行归属分析验证。,二、四大谱在结构测定中的应用,（一）紫外 可见光谱（UV -VIS）原理：分子中电子跃迁引起的吸收，其中n-*、-* 的跃迁可因吸收紫外光及可见光所引起，吸收光谱将出现紫外区和可见光区(200700nm)。,200nm 400nm 700nm,紫外区（UV） 可见区（VIS）,应用：（1）推断化合物的骨架类型 共轭体系。（2）取代基团的位置、种类、数目的推断。（3）用于定量测定（以最大吸收波长作为检 测波长进行含量测定）。,特点： 样品用量少（只需5-10 g） 样品能回收测定； 常规紫外光谱仪价格低廉；,（二） 红外光谱（IR）,原理：分子中价键的伸缩及弯曲振动所引起的吸收而 测得的吸收图谱，称为红外吸收光谱。,4000 3600 3000 1500 1000 625cm-1,特征频率区 指纹区,特征官能团的鉴别,化合物真伪的鉴别,羟基（酚羟基、醇羟基） 36003200 cm-1 游离羟基 3600 cm-1 氢键缔合羟基 34003200 cm-1 羰基 16001800 cm-1酮 1710 cm-1酯17101735 cm-1芳环 1600、1580、1500cm-1有23个峰 双键 16201680 cm-1,两个化合物完全相同的条件 1、 特征区完全吻合 2、 指纹区也需完全一致,应用：IR对未知结构化合物的鉴定，主要是用于官能团 的确认、芳环取代类型的判断等定性分析。,特征官能团的鉴别,化合物真伪的鉴别,IR用于鉴定化合物的方法有两种：(1)与标准物谱图对照法。在相同条件下，若 两个谱图完全吻合，则两物质相同；否则 不同。(2) 标准谱图查对法。如无对照品，也可检索 有关IR数据图谱文献，如被测物结构基本 已知，可能局部构型不同，在指纹区就会 有差别。,谱图三要素：位置、强度、峰形,测定范围 波数6004000cm -1之间。 其中1600cm-1以上为化合物的特征基团区， 1000-500cm-1为指纹区。应用 主要用于定性分析，功能基的确认，芳环取代类 型的判断等。 优点：样品用量少（只需5-10 g） 任何气态、液态、固态样品均可测定； 每种化合物都有红外吸收； 常规红外光谱仪价格低廉；,红外光谱,NMR谱：化合物分子在磁场中受电磁波的辐射， 有磁距的原子核吸收一定的能量产生能级 的跃迁，即发生核磁共振，以吸收峰的 频率对吸收强度作图所得之图谱。NMR谱所提供的结构信息有：氢及碳原子的类型、数 目、相互连接方式、周围的化学环境及构型、构象等。,（三）核磁共振谱（NMR）,天然产物化学成分以有机物为主，分子结构中必然有C、H原子，它们的结合类型、化学环境不同，均可用NMR测定，是天然化合物结构测定的重要手段。, 氢核磁共振（1H-NMR)谱： 化学位移范围：在020 ppm 三大要素：化学位移(ppm)、偶合常数(J)及 峰面积。 灵敏度高，样品用量少（15 mg），测试时 间短碳核磁共振（13C-NMR)谱： 化学位移范围：在0250 ppm 要素：化学位移(ppm)灵敏度较低，样品用量较多（520 mg），测 试时间长,1. 1H-NMR（核磁共振氢谱）:信息参数：化学位移（）、峰面积、峰裂分（s 、d、t、q、m）及偶合常数（J）（1）化学位移（ppm）: 020ppm与1H核所处的化学环境（1H核周围的电子云密度）有关，其外围电子云密度及绕核旋转产生的磁屏蔽效应不同，不同类型的1H核共振信号出现的区域不同，据此可以识别。 电子云密度大，处于高场，值小 电子云密度小，处于低场，值大,0.9-C-CH3,1.8-C=C-CH3,2.1-COCH3,3.0-NCH3,3.7-OCH3,11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0,-COOH,-CHO,Ar-H,-C=C-H,常见结构的化学位移大致范围（要求熟记）,(ppm),推断化合物的结构（含1H核基团的结构）,符合 n+1 规律 ( n = 磁等同质子的数目 ),用偶合常数（J）表示。间隔的键数越少，则其值 越大，反之越小,峰裂分的数目,裂分峰间的距离,不同系统偶合常数 (J Hz) 大小,s 单峰 d 双峰 t 三重峰 q 四重峰 m 多重峰,（2）峰面积: 磁等同质子的数目与峰面积（高度）有关。,（3）峰裂分及偶和常数（J）:磁不等同的两个或两组1H核，在一定距离内因相互自旋偶合干扰使信号发生裂分，裂分峰间的距离称为偶合常数。,芳环 J邻610Hz J间 03Hz J对01Hz 双键 J顺711 Hz J反1218 Hz 饱和烃类相邻碳原子上质子偶合常数的大小 与两个氢原子之间的立体夹角有关 =60 J = 24 Hz =180 J = 910 Hz 环己烷及其类似物相邻碳原子上质子的偶合常数 Jaa 1013Hz ( =180 )Jae 25Hz ( =60 )Jee 25Hz ( =60 ),2. 13C-NMR（ 核磁共振碳谱 ）：,13C-NMR：化学位移范围为0250ppm，信息参数：分子中各种不同类型及化学环境碳核的化学位移（C）、异核偶合常数（JCH）。其中利用度最高的是化学位移。 由于碳谱的化学位移比氢谱大几十倍,因此分子结构的微小差异所引起的化学位移的不同就能在碳谱中反映出来,如果消除碳与氢的偶合,碳谱上每个碳原子都对应有一条尖锐、可分辨的谱线。,化学位移：大致范围 (C ） 0 200ppm,不同 13C 核C大小与13C 核所处的化学环境（周围电子云密度）有关,用于13C 核类型的推断,( C ppm ),150220( c=o),200 150 100 50 0,c=c Ar,5080 (c-o),饱和碳原子（060）,主要结构13C 核C的大致范围 ( 要求熟记 ),（四）质谱（MS）:,1确定分子量（高分辨质谱 可将分子量精确 到小数点后四位）, 计算分子式。2提供其他结构信息。如黄酮类，依碎片离 子峰可以确定A-环、B-环的取代模式。3与标准图谱比较用于化合物的鉴别（相同 条件下，其裂解是符合一定规律的）。4依裂解特征及碎片离子， 推定或复核未知 化合物分子的部分结构。,质谱主要离子源的电离方式及特点：,电子轰击质谱（EI-MS）：目前最常用。,但对于热敏成分（醇、糖苷、部分羧酸等）及大分子物质（多糖、肽类）难以气化成分,测不到分子离子峰亦无法测得分子量,解决措施,电离新方法,将化合物乙酰化或三甲基硅烷化（TMS化）制成热稳定性好的挥发性衍生物进行测定,(2)场解吸质谱 FD-MS(3)快原子轰击质谱 FAB-MS(4)化学电离质谱 CI-MS(5)电喷雾电离质谱 ESI-MS(6)基质辅助激光解吸电离质谱 ( MALDI-MS )(7)场致电离质谱 (FI-MS)(8)串联质谱（MS-MS）,样品不必加热汽化而直接电离的新方法,应用： 用于确定分子量； 求算分子式； 提供其他的结构信息片段；特点：样品用量少（只需510 g） 适宜测定极性偏小和中等极性的化合物； 常规质谱仪价格比较便宜，一些特殊质谱 仪很昂贵；,三、立体结构测定的方法,（一）旋光光谱(Optical rotatory dispersion)（二）圆二色光谱（ Circular Dichroism ）（三）单晶X-射线衍射谱（X-Ray diffraction Method）,（一）旋光光谱（ORD）,用不同波长的偏振光照射光学活性物质，并用波长对比旋光度10-2或分子比旋 10-2作图，得到的曲线即为旋光光谱。常见的有：（1）平坦谱线：分子中虽有不对称碳原子，但在200700nm无紫外吸收时所得的图谱，无峰和谷之分。图谱在短波处升起者为正性谱线，降低者为负性谱线。,（2）单纯Cotton效应谱线：光学活性分子中若有发色团，则产生异常的旋光光谱，出现峰和谷，得到所谓Cotton效应谱线。峰在长波部分、谷在短波部分者为正性Cotton效应谱线；反之则为负性Cotton效应谱线。（3）复合Cotton效应谱线：如ORD谱线中出现两个或更多峰与谷时，则称之为复合Cotton效应谱线。ORD谱的谱线特征与分子的立体化学结构（构型、构象）有着重要的关系。,（二）圆二色光谱(CD),旋光性物质对组成平面偏振光的左圆偏振光和右圆偏振光的摩尔吸光系数是不同的，这种现象称为圆二色性。两种摩尔吸光系数之差随入射偏振光的波长变化而变化，以或有关量为纵坐标，波长为横坐标得到的图谱称为圆二色谱。由于的绝对值很小，常用摩尔椭圆度来代替，它与摩尔吸光系数的关系是： =3300 。运用谱研究有机化合物的构型或构象，得出的结论与是一致的。比较明确，容易解析。,（三）单晶射线衍射法,测定化合物晶体对X-射线的衍射谱，再通过计算机用数学的方法解析衍射谱，再还原为分子中个原子的排列关系，最后获得每个原子在坐标系中的分布。从而给出化合物的化学结构。 X-射线衍射法不仅能测出化合物的一般结构，还能测定出化合物结构中的键长、键角、构象、绝对构型等结构细节。,四、一些天然产物结构的光谱特征,酚类化合物：UV吸收峰在280nm，IR吸收峰在 15001600cm-1、3300cm-1黄酮类化合物：UV在240285nm及300400nm区间各有 一个吸收峰，IR在15001700cm-1处有吸收峰。皂苷类：1H-NMR谱在高场有山峰形及几个甲基的尖峰 信号。香豆素类：其IR在15001600cm-1处有芳环吸收峰， 1700cm-1附近有不饱和内酯吸收峰；UV在 240260nm区间有苯环吸收峰，320nm处有 -吡喃酮环的吸收峰， 1H-NMR谱主要是芳 环质子信号。,生物碱：分子中含氮，可能是伯胺、仲胺或叔胺。 伯胺、仲胺可根据IR在3500cm-1附近的吸收峰 或1H-NMR谱相应质子信号为重水交换或变换 温度位移而确定；叔胺在IR或1H-NMR无信号。萜类： 1H-NMR谱的大多数信号在高场。糖或糖苷：糖的质子信号大多集中在 45，IR吸收峰 收峰在750920cm-1,