基因工程第三章基因工程的载体ppt课件.ppt

第三章 基因工程的载体,Chapter 3 Gene Cloning Vector,载体 （Vector） 基因克隆载体(gene cloning vector): 能承载外源基因，将其带入受体细胞得以稳定维持的DNA 分子。,载体的功能（Function of Vector）运送外源基因高效转入受体细胞。为外源基因提供复制能力或整合能力。为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。,克隆载体的结构特征(Character of Vector),(1) 针对受体细胞的可转移性；(2) 自主复制功能；(3)显著的筛选标记；(4)特定的多克隆位点；(5)安全性；,克隆载体具备的条件：,载体分类：1）根据构建克隆载体所用的DNA 来源分为：质粒载体病毒或噬菌体载体质粒DNA与病毒或噬菌体DNA 组成的载体质粒DNA与染色体DNA 片段组成的载体等。,2）根据应用对象分：原核生物克隆载体植物克隆载体动物克隆载体3）按照功能分：克隆载体:克隆一个基因或DNA片断表达载体:用于一个基因的蛋白表达整合载体:把一个基因插入到染色体组中,1 质粒克隆载体2 病毒（噬菌体）克隆载体3 染色体定位整合克隆载体4 人工染色体克隆载体5 特殊用途克隆载体,1 质粒克隆载体,1.1 与构建克隆载体相关的质粒性质1.2 质粒载体必须具备的基本条件1.3 质粒克隆载体的构建,质粒载体以质粒DNA 分子为基础构建的克隆载体，含有质粒的复制起始位点，能够按质粒复制的形式进行复制。 1.1.1 质粒组成与构型1.1.2 质粒DNA大小1.1.3 质粒DNA的复制1.1.4 质粒的不亲和型1.1.5 质粒迁移1.1.6 显性质粒和隐蔽质粒,1.1 与构建克隆载体相关的质粒性质,1.1.1 质粒组成与构型质粒(plasmid)是一种寓于宿主细胞中染色体外的裸露DNA 分子，一个质粒就是一个DNA分子。数量：每种质粒在相应的宿主细胞内保持相对稳定的拷贝数，少者几个，多者上百个。存在广泛：许多细菌、乳酸杆菌、蓝藻、酵母等生物中均发现含有质粒。,DNA构型：在宿主细胞内，质粒一般以ccc-DNA 的形式存在。体外在理化因子作用下，质粒可能成为开环 DNA和线形DNA 分子。,1.1.2 质粒DNA大小质粒DNA 分子小的不足2kb，大的可达100 kb以上，多数在10kb 左右。,1.1.3 质粒DNA的复制质粒含有复制起始位点，能在宿主细胞内进行自我复制。,COP因子：决定质粒的拷贝数，指挥细胞合成阻遏物，当质粒复制到一定的拷贝时，阻遏物的量也积累到足以阻止质粒的复制。Rep基因：指挥宿主细胞合成一种调节蛋白，促进质粒的复制。Par基因：保证细胞分裂时质粒正确分配到子细胞。,“严紧型” 质粒（Stringent Plasmid）：低拷贝数，每个宿主细胞仅含1-3份的拷贝。“松弛型” 质粒（Relaxed Plasmid） ：高拷贝数的，每个宿主细胞可达到10-60份拷贝。,1.1.4 质粒的不亲和性（plasmid incompatibility）质粒的不亲和性，也称不相容性: 在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同一宿主细胞中稳定地共存。,大肠杆菌质粒现已鉴别出25个以上的不亲和群。它们之间是相容的，而同一个不亲和群内的质粒是不相容的。,1.1.5 质粒迁移(Plasmid Mobilization)通过接合作用,质粒可以转移到新的宿主细胞中。Tra基因：指令宿主细胞合成菌毛和细胞表面物，促使宿主细胞与受体细胞表面结合，实现遗传物质的转移。,分为两种： 接合型质粒(Conjugative Plasmid)：含有自我复制基因、接合转移Tra基因，拷贝数少，分子大。非接合型质粒(non-Conjugative Plasmid)：能够自我复制，但不含Tra基因，这类质粒不能从一个细胞自我转移到另一个细胞；较安全，且拷贝数多，分子小，适于构建克隆载体。,1.1.6 显性质粒和隐蔽质粒显性质粒：也称表达型质粒，质粒携带一些除与自身复制和转移相关的基因外，还有别的基因使得宿主细胞出现新性状。隐蔽质粒：宿主细胞含有某种质粒，但无异样性状表现。,显性质粒的相关基因：抗性基因：抗菌素抗性基因，Apr，Tcr，产毒素基因：大肠杆菌素基因（Col-质粒）。降解基因：降解重金属、有机物和农药等。致瘤基因：诱导某些组织形成肿瘤，如Ti质粒，Ri质粒。,1 质粒克隆载体,1.1 与构建克隆载体相关的质粒性质1.2 质粒载体必须具备的基本条件1.3 质粒克隆载体的构建,(1) 能自主复制，即本身是复制子(2) 具有多种限制酶的单一切割位点，即多克隆位点，并在此位点中插入外源基因片段，不影响本身的复制功能； (3) 在基因组中有1-2个筛选标记，为寄主细胞提供易于检测的表型特征。 (4) 分子量要小，多拷贝，易于操作。；(5)构建不同用途的质粒载体时，可以根据特殊需要组装各种元件（小DNA片段）。,1.2 质粒载体必须具备的基本条件,天然质粒：没有经过以基因克隆为目标的体外修饰改造的质粒。,局限性：分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适,如何识别载体上的各种元件及其功能：,1.3.1 大肠杆菌质粒载体pBR322及其衍生载体的构1.3.3 农杆菌Ti质粒载体的构建1.3.5 酵母2um质粒克隆载体,1.3 质粒克隆载体的构建,1.3.1 大肠杆菌质粒克隆载体pBR322及其衍生载体的构建,（1）pBR322： p-plsmid，B R分别为该质粒的两位主要构建者F.Bolivar和R.L.Rodriguez姓氏的头一个字母，“322”为实验编号。含有双抗基因（Apr，Tcr）和Col E1复制起始子。,优点： 具有较小的分子量，4363bp。 具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。含有24种单一的限制性内切酶识别位点，且BamHI、SalI和PstI等几个酶切位点分别处于四环素和氨苄青霉素抗性基因上，当将外源DNA片段插入到这些位点时，可用抗生素基因的失活来筛选重组体。 具较高的拷贝数，经过扩增之后，每个细胞中可累积1000-3000个拷贝。,BR322质粒载体的筛选,插入失活筛选法,(2) 衍生pUC质粒载体,由美国加利福尼亚大学（University of California）J.Messing和J.Vieria于1987年构建。包括如下四个组成部分：i) 来自pBR322质粒的复制起点(ori)；ii) 氨苄青霉素抗性基因(ampr) ；,iii) 大肠杆菌-半乳糖酶基因(lacZ)的启动子及其编码-肽链的DNA序列，此结构特称为lacZ基因；iiii) 位于lacZ基因中的靠近5-端的一段多克隆位点（multiple cloning sites, MCS）区段。,UC 18-19多克隆位点,表达性载体（Expression Vector）：,根据宿主细胞的不同，表达蛋白质的载体大致可分为：原核生物表达载体和真核生物表达载体。由于真核生物种类繁多，又分为酵母表达载体，植物表达载体，昆虫类表达载体和哺乳类表达载体等等。,原核生物表达性载体（Prokaryotic Expression Vector）：,pGEX Vector (GST tag Expressoin Vector):,pGEX Vector MCS region：,pET Vector (S tag Expressoin Vector):,pET Vector MCS region：,真核核生物表达性载体（Eukaryotic Expression Vector）：,pcDNA3.1 mammalian Expression Vector:,pcDNA3.1 Vector MCS region：,pEGFP-C1 mammalian Expression Vector:,GFP and REP Expression Vector:,pMSC puro Retroviral Vector Map:,Retroviral Vector:,1.3.1 大肠杆菌质粒载体pBR322及其衍生载体的构建1.3.3 农杆菌Ti质粒载体的构建1.3.5 酵母2um质粒克隆载体,1.3 质粒克隆载体的构建（Construction of Plasmid Vector）:,致癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)含一种内源质粒，当农杆菌同植物接触时，这种质粒会引发植物在创伤部位组织增生而形成植物肿瘤 (冠瘿瘤)，称此质粒为Ti 质粒(tumor inducing plasmid)。,1.3.3 农杆菌Ti质粒载体的构建,上： 电镜下的根癌农杆菌下： 冠瘿瘤,Ti质粒是双链环状DNA 分子，约200kb，分四个区：1） T-DNA(transfer DNA)： 25kb，进入植物细胞区域含有多种基因，其表达产物破坏植物细胞内源激素的平衡，干扰细胞分裂从而引发植物肿瘤。,T-DNA 左右两边界(LB，RB)各有一个25bp长的正向重复序列(LTS 和RTS)，对T-DNA 的转移和整合是不可缺少的。,2） Vir区：位于T-DNA 上游的一组基因，表达产物能激活T-DNA 向植物细胞转移，引发植物肿瘤，显示细菌的致病性。3) Con区：含有tra基因，农杆菌之间转移接合4) Oir区：调控质粒的自主复制,农杆菌Ti质粒载体的构建,与大肠杆菌的质粒载体不同，构建的Ti质粒载体不真正用于细菌，而是用于植物细胞，农杆菌只起着中间介导的作用。构建共整合质粒载体和双元载体,共整合质粒载体,将外源基因克隆在大肠杆菌-农杆菌穿梭质粒的T-DNA区内；,双元整合载体,1.3.1 大肠杆菌质粒载体pBR322及其衍生载体的构建1.3.3 农杆菌Ti质粒载体的构建1.3.5 酵母2um质粒克隆载体,1.3 质粒克隆载体的构建（Construction of Plasmid Vector）,1.3.5 酵母2m 质粒载体酵母是一种最简单的单细胞异养真核生物，可以像细菌一样进行基因操作，能够在廉价的培养基上生长，可高密度发酵。酵母又具有真核生物的特性，具有对外源基因翻译后进行蛋白质加工和修饰的功能。几乎所有的酿酒酵母菌中都存在2m质粒。利用2m质粒和其染色体组分与细菌质粒pBR322构建酵母质粒载体，能分别在细菌和酵母菌中进行复制，又称为穿梭载体。,2m复制起点,YEP载体（游离型）,质粒克隆载体的用途,用于保存和扩增片段小于2kb的目的基因。构建基因组文库和cDNA文库。可用于目的基因的测序。作为核酸杂交时探针的来源。,回顾,plasmid,质粒载体必须具备的基本条件,UC18/19质粒载体,BR322质粒载体,Ti质粒,UC18/19质粒载体的组成特点、结构图。,插入失活,-互补,T-DNA,1 质粒克隆载体2 病毒（噬菌体）克隆载体3 染色体定位整合克隆载体4 人工染色体克隆载体5 特殊用途克隆载体,病毒由DNA(或RNA)和外壳蛋白组成，经包装后成为病毒颗粒。通过感染，病毒颗粒进入宿主细胞，利用宿主细胞的合成系统进行DNA(或RNA)复制和壳蛋白的合成，实现病毒颗粒的增殖。,2 病毒（噬菌体）克隆载体,噬菌体克隆载体M13克隆载体Cosmid 克隆载体CaMV克隆载体TMV克隆载体SV40克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体,2.1.1 噬菌体性质噬菌体由DNA和外壳蛋白组成，分为头部和尾部。,2.1 噬菌体克隆载体,（1） DNA ：DNA 在噬菌体中以线状双链DNA 分子存在，全长48 502bp。 COS 位点(cohesive end site):左右两端各有12 个核苷酸组成的5凸出黏性末端，而且两者的核苷酸序列互补。,（2）基因组DNA的结构,含50个以上的基因，各司其职。,A W B C D E F Z U V G H M L K I J b2,cI cro cII O P Q S R,att int xis gam red cIII N,COS,COS,头部基因 尾部基因 功能不明区,溶源化 重组 早期控制 阻遏 DNA合成 晚期 溶菌,约有20kb生长非必须区段,cI基因：溶源过程控制基因。,噬菌体的基因组结构,（1）噬菌体是一种温和噬菌体，对大肠杆菌具有很高的感染能力，以溶源状态可保存在大肠杆菌中。（2）能承载比较大外源DNA：DNA 上约有20kb 的区域对噬菌体的生长不是绝对需要的，可以缺失或被外源DNA 片段取代。( 3) DNA上有56种限制酶识别位点（见附录3-1），便于多种外源DNA片段的克隆。,2.1.2 选用噬菌体作为克隆载体的依据, 限制性内切核酸酶切位点的改造点突变或甲基化酶处理等方法使必需区内的酶的识别序列失效，避免外源DNA 片段插入必需区；,2.1.3 构建噬菌体克隆载体, 在非必需区插入选择标记基因；, 建立重组DNA分子体外包装系统。重组DNA分子经过体外包装称噬菌体颗粒后才能有效转导受体细胞。,置换型载体,可被外源DNA置换的噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体。,2.1.4 噬菌体载体的类型,只有DNA的长度大于野生型噬菌体DNA长度的75而不超过其105时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降，因此要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。,插入型载体：,有一类只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，这类噬菌体载体称插入型载体。仅保留了EcoR的单一切点可插入长度为10kb的外源DNA.切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选,主要用于建立cDNA文库。也用于克隆外源目的基因。,2.1.5 噬菌体克隆载体的应用,2) 组装,1)连接,3) 侵染,置换载体,2 病毒（噬菌体）克隆载体,噬菌体克隆载体单链DNA噬菌体载体M13 Cosmid 克隆载体噬菌质粒载体CaMV克隆载体TMV克隆载体SV40克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体,2.2 单链DNA噬菌体载体M13、f1、fd。2.2.1 优越性：1) 单链DNA噬菌体的复制，是以双链环形的DNA为媒介的，这种复制形式 的 DNA简称RFDNA；2) 不论是RFDNA还是ssDNA都能感染大肠杆菌；3) 单链DNA噬菌体颗粒的大小，是受其DNA制约，不存在包装限制问题；4) 容易测定外源DNA片断的插入取向；5) 可产生含外源片断的单链DNA分子。,2.2.2 M13噬菌体的特点外型丝状，环状单链DNA (6407bp)，M13至少11个编码基因，M13 DNA不插入到宿主基因组中, 不裂解细菌，但抑制宿主生长。,+,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,+,-,单链结合蛋白,RF型DNA,复制约200copy,+,+,+,+,+,以-链DNA为模板合成+链DNA,滚环方式复制,M13的侵染循环,2.2.3 构建M13噬菌体载体,插入选择标记基因在选择标记基因区内组装合适的多克隆位点。,M13克隆载体分子结构图,2.2.4 M13 克隆载体的应用,适合用于制备克隆基因的单链DNA。用于制备测序用单链DNA模板、特异的单链DNA探针，定位诱变等。,2 病毒（噬菌体）克隆载体,噬菌体克隆载体M13克隆载体Cosmid 克隆载体噬菌质粒载体CaMV克隆载体TMV克隆载体SV40克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体,cosmid载体：也称粘粒、柯斯载体。这是一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由噬菌体的cos 末端及质粒重组而成的载体。该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。,2.3 Cosmid(考/柯斯)克隆载体,Cosmid(考/柯斯)克隆载体,特征:1) 具有质粒的性质，含有大肠杆菌内源质粒复制起始位点、克隆位点和选择标记基因等基本构件，可在细菌中保存和大量复制。2)含有Cosmid 位点，可进行体外包装；3) Cosmid载体一般在10kb 以下，能承载比较大的外源DNA 片段。,2.4 噬菌质粒载体，简称噬菌粒1）组成：噬菌粒是由单链噬菌体和质粒载体DNA融合而成。质粒ColE1的ori抗生素抗性标记M13或f1噬菌体复制起点如pUC118噬菌粒载体就是将野生型M13的基因间隔区插入质粒载体pUC18构建而成的。,2）噬菌粒优点：载体本身分子小，约为3000bp，便于分离和操作；克隆外源DNA的容量为10kb，而M13噬菌体载体是克隆300400bp；两种复制方式 噬菌粒在寄主细胞内以质粒形式存在，复制产生双链DNA。当用辅助噬菌体M13感染宿主细胞后，噬菌质粒的复制就转变成如同M13噬菌体一样的滚环复制，产生单链DNA。用途：可用于制备单链或双链DNA，克隆和表达外源基因。,2 病毒（噬菌体）克隆载体,噬菌体克隆载体M13克隆载体Cosmid 克隆载体噬菌粒载体CaMV克隆载体TMV克隆载体SV40克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体,CaMV花椰菜花斑病病毒克隆载体,含1个约8kb的环状双链DNA分子；用于十字花科和少数非十字花科的植物基因转移；其感染对植物有害，不能直接做载体；,CaMV 35S启动子基因载体系统,构建的含强启动子35S RNA启动子的载体可在植物细胞内高效表达基因。,CaMV 35S启动子,植物根部特异性表达,植物地上部特异性表达,用于构建植物载体的植物病毒：双链DNA 病毒：花椰菜花叶病毒(CaMV)，单链DNA 病毒：蕃茄金黄花叶病毒(TGMV)、非洲木薯花叶病毒(ACMV)、玉米线条病毒(MSV)、小麦矮缩病毒(WDV)，RNA 病毒：雀麦草花叶病毒(BMV)、大麦条纹花叶病毒(BSMV)、蕃茄丛矮病毒(TBSV)、马铃薯X 病毒(PVX)、烟草花叶病毒(TMV)、烟草蚀刻病毒(TEV)、李痘病毒(PPV)等。,动物病毒识别宿主细胞，某些动物病毒载体能高效整合到宿主基因组中，以及高拷贝和强启动子等，有利于真核外源基因的克隆与表达。目前利用许多哺乳动物病毒如SV40、腺病毒、痘病毒、逆转录病毒等改造后的衍生物作为基因载体。,用于构建动物载体的动物病毒：,猿猴病毒-40(SV-40)载体优点： 5243 bp共价闭合环状分子 感染率高，几乎100寄主细胞能被感染 能提供完整的真核基因转录所需的成分 侵染性具有寄主特异性,反转录病毒克隆载体,反转录病毒是一类含RNA的病毒，进入受体细胞后，RNA反转录成DNA，通过两端由数百bp组成的长末端重复序列，整合到染色体上，成为原病毒。,反转录病毒整合入宿主DNA中的分子机制，其本质是转座。,昆虫病毒载体优点：高克隆容量，克隆外源DNA片段大小可高达100kb；高表达效率，外源DNA的表达量达到细胞蛋白质总量的25左右，甚至更多；具有安全性，仅感染无脊椎动物，并不引起人和乳动物,腺病毒克隆载体 双链DNA病毒，基因组36kb,单链取代,腺病毒载体的优点：宿主范围广, 对人致病性低在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因与人类基因同源不整合到染色体中，无插入致突变性能同时表达多个基因,1 质粒克隆载体2 病毒（噬菌体）克隆载体3 染色体定位整合克隆载体4 人工染色体克隆载体5 特殊用途克隆载体,质粒载体或病毒载体携带的外源DNA 分子在宿主细胞中的复制有两种情况：自主复制：外源DNA产生多拷贝，但是容易丢失，导致转基因生物的不稳定性；整合到染色体DNA：能稳定维持，但是插入位点不确定，可能对受体细胞基因组的自稳系统产生干扰，导致出现有害的突变。基因定位整合平台系统可克服这两者的负面效应，已广泛应用于转基因动植物的研究。,3 染色体定位整合克隆载体,3.1 基因整合平台系统的组成整合平台定位整合载体（1）整合平台：指受体细胞基因组上给定的一个DNA 区域，是外源DNA 定位整合的位置(靶位)。整合平台可以在基因区或者在基因间隔区。,（2）定位整合载体：除了一般质粒载体必须具备的元件外，还必须含有一段或两段与整合平台DNA 区域核苷酸序列同源的DNA 片段。同源DNA 片段长度在1kb 以上。通过同源重组，定位整合载体携带的目的DNA 片段能够定位整合到整合平台DNA 区域，随受体细胞染色体DNA 的复制而复制，稳定遗传。利用基因整合平台系统转基因的方法也称为基因打靶或基因定位同源重组。,分为4 种类型：内源平台整合载体：整合平台选定在受体细胞基因组的一个DNA 区；又可分为双交换置换载体、单交换插入载体和双交换插入载体；外源平台整合载体：有两组同源DNA、整合两次。多采用双交换插入载体。,3.2 定位整合克隆载体的几种模式,与受体细胞的种属有关；和同源DNA 片段的长短有关，随着载体同源DNA 片段长度增加而提高。整合平台DNA两侧有重组酶RecBC的chi位点可提高重组率。,3.3 定位整合克隆载体的定位整合效率,噬菌粒载体,柯斯质粒载体,特点、结构特征,染色体定位整合克隆载体,回顾,噬菌体,噬菌体载体,cos ends,主要类型,包装长度,M13噬菌体载体,RF DNA,整合平台定位整合载体,1 质粒克隆载体2 病毒（噬菌体）克隆载体3 染色体定位整合克隆载体4 人工染色体克隆载体5 特殊用途克隆载体,人工染色体载体（artificial chromosome vector）：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。穿梭载体：含有第一受体(大肠杆菌)内源质粒复制起始位点 含有第二受体(如酵母菌)染色体DNA 着丝点、端粒和复制起始位点的序列，以及选择标记基因。,4.1 人工染色体克隆载体含义和特点,酵母的自主复制区ARS序列 (autonomously replicating sequence) ，在酵母染色体复制和质粒复制中均发挥复制起点的功能。,人工染色体载体在第一受体细胞内按质粒复制形式进入高拷贝复制。这种克隆载体在体外与目的DNA片段重组后，转化第二受体细胞，按染色体DNA复制的形式进行复制和传递。筛选第一受体的克隆子，用抗菌素抗性选择标记；筛选第二受体的克隆子，用与受体互补的营养缺陷型。,酵母人工染色体(YAC)的构建：含酵母染色体的DNA端粒(TEL)、DNA 复制起点(ARS)着丝粒(CEN) 选择标记(HIS 和TRP1)基因多克隆位点(MCS)的DNA 片段大肠杆菌的复制子大肠杆菌的选择标记YAC载体的装载量为350-400 kb,4.2 人工染色体克隆载体的构建,YAC的使用,细菌人造染色体( BAC)是在F质粒基础上构建的，其装载量范围在50 - 300 kb，人类人工染色体载体（HAC）哺乳动物人工染色体载体（MAC）,构建基因组文库容纳大的外源片段，用于构建人类和高等生物的基因组文库。基因治疗大的外源片段能容纳完整的基因家族，从而可能校正由多个突变位点引起的致病突变。基因功能鉴定大的外源片段包含编码区、内含子、调控区。,4.3 人工染色体克隆载体的应用,1 质粒克隆载体2 病毒（噬菌体）克隆载体3 染色体定位整合克隆载体4 人工染色体克隆载体5 特殊用途克隆载体,启动子探针型克隆载体诱导型表达克隆载体反义表达克隆载体组织特异性表达克隆载体分泌型表达克隆载体双启动子表达克隆载体串联启动子表达克隆载体含增强子表达克隆载体,5 特殊用途克隆载体,启动子是调控基因有效转录的必备元件。启动子探针载体含有质粒载体必备的元件和检测部件。检测部件有两部分组成:遗传标记基因以及克隆位点。标记基因：抗生素抗性基因和绿色荧光蛋白基因gp 等。,5.1 启动子探针载体,1）较安全的基因表达载体：由此获得的转基因生物进入自然环境中，由于不存在合适的诱导条件，不能表达外源基因产物，也不会导致环境污染和影响生态系统的平衡；2）能人为控制基因时空的表达，将为基因治疗的临床应用及基础研究提供良好的手段。种类：二价金属离子诱导启动子、红光诱导启动子、热诱导启动子和干旱诱导启动子等。,5.2 诱导型表达载体,反义核酸技术：利用人工合成或重组的与靶基因互补的一段反义DNA 或RNA 片段，特异性地与靶基因结合，能封闭其表达。用途：此技术已成为基因治疗的重要手段。将获得的致病基因反向插入表达载体，构建成反义表达载体。反义表达载体导入靶细胞后，可转录出与致病基因mRNA 互补的反义RNA，特异性地封闭致病基因的表达。,5.3 反义表达载体,高等真核生物中，一些特殊的调控序列(启动子等)可以调控基因只能在一定的组织中才进行有效的表达。已经构建乳腺组织特异性表达载体、肿瘤细胞特异性表达载体、神经组织特异性表达载体、花药特异性表达载体种子特异性表达载体等。,5.4 组织特异性表达载体,叶特异性表达,叶肉特异性表达,维管束特异表达,茎特异表达,马铃薯,花药特异性表达,根特异性表达,分泌型表达克隆载体双启动子表达克隆载体串联启动子表达克隆载体含增强子表达克隆载体,1 质粒克隆载体2 病毒（噬菌体）克隆载体3 染色体定位整合克隆载体4 人工染色体克隆载体5 特殊用途克隆载体,列举质粒载体必须具备的基本特性。举例说明什么是穿梭载体？什么是Ti质粒和T-DNA？ 为什么野生型的噬菌体DNA不宜作为基因工程载体？噬菌体与cos作载体有何区别？M13载体的主要用途？何谓YAC? 主要特性是什么? 列举主要用于植物和动物转化的质粒载体和病毒载体有哪些？什么是定位整合载体？,思考题,回顾,plasmid,质粒载体必须具备的基本条件,UC质粒载体,BR322质粒载体,phage,噬菌体,cos ends,包装长度,M13载体,RF DNA,噬菌粒载体,柯斯质粒载体,特点、结构特征,Ti质粒载体,整合平台定位整合载体,染色体定位整合克隆载体,人工染色体克隆载体,染色体的复制元件,本章重点掌握的内容兼习题,掌握载体、穿梭载体、质粒、质粒的不相容性、人工染色体载体的概念。克隆载体DNA分子具备的条件。pUC18/19质粒载体的组成、结构图、优点及质粒克隆载体用途。-DNA载体的构建、类型及其优点。柯斯质粒载体、噬菌粒载体的结构特征和特点 。什么是Ti质粒和T-DNA？ 为什么野生型的噬菌体DNA不宜作为基因工程载体？M13载体的主要用途？何谓YAC? 主要特性是什么? 列举主要用于植物和动物转化的质粒载体和病毒载体有哪些？,小 结,载体的概念、性能,plasmid,质粒载体必须具备的基本条件,UC质粒载体,Bluscript 质粒载体,phage, phage,cos ends,主要类型,包装长度,M13vector,RF DNA,噬菌粒载体,柯斯质粒载体,特点、结构特征、,花椰菜花斑病病毒DNA缺口的结构,缺口1： GA ATTT TTT AA 5 3 GC ATTT TTT AA 5 5 CGCT TAAAAAATT 3缺口2：5 GGTTGATTACTCGAGCC 5 GGTTGATTACTCGAG AA 3 3 CCAACTAATGAGCTCGGTT 5缺口3：5 TCCAATAGTCT TC TTTTT CAG 5 TCCAATAGTCT TC TTTTT G AA 3 3 AGGTTATCAGAAGAAAAACTCTT 5,根据噬菌斑的透明度或颜色来进行重组子的筛选,复习,载体的概念、性能,质粒,质粒载体必须具备的基本条件,UC质粒载体,BR322质粒载体,载体必须具备的基本条件,Ti质粒载体,2.2.2 使用Cosmid克隆载体的基本程序,1.3.6 TA克隆载体原理：在PCR 反应中，Taq 酶通常会在延伸的PCR 产物3末端加上一个非配对的碱基A。根据这一特性研制出了一种线性质粒，其5端各带一个不配对的碱基T。采用这样的质粒可将PCR 产物以TA 配对连接的方式直接进行克隆，即TA 克隆。用于TA 克隆的载体被称为T-克隆载体，它的出现使PCR 产物的克隆更加简便快捷。, 限制性内切核酸酶切位点的改造酶切除去DNA 上的部分或全部非必需区。点突变或甲基化酶处理等方法使必需区内的酶的识别序列失效，避免外源DNA 片段插入必需区；保留这种酶的1 个或2 个识别位点作为克隆位点， 插入型载体：非必需区只保留一个识别位点；替换型载体：非必需区具有两个识别位点。,2.1.3 构建噬菌体克隆载体,插入型的容纳量：11.1kb，（51.5kb-40.4kb）； 替换型的容纳量：0.7-16kb，36.4kb +4.9kb -40.4kb ；51.5kb -40.4kb +4.9kb；,此载体的大小是40.4kb，即48.5kb -5.5kb -2.6kb,重组DNA分子大小是原DNA的75%- 105%,约36.451.5kb ；,2 病毒（噬菌体）克隆载体,噬菌体克隆载体Cosmid 克隆载体M13克隆载体CaMV克隆载体TMV克隆载体SV40克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体,猿猴空泡病毒40 (Simian virus 40，SV40) 2.6.1 SV40 DNA的一般特性1）SV40 DNA为环状双链DNA（5243bp）， 与宿主细胞组蛋白H4，H2A，H2B和H3结合，组成念珠状核小体-微型染色体（mini-chromosome）。 2）SV40 DNA编码两个基因区，早期转录区和晚期转录区，分别以相反的方向转录。,2.6 SV40克隆载体,SV40基因转录图,3) SV40 DNA单识别位点限制性内切酶位点,限制性内切酶 识别位点 Kpn I 294 Nae I 343 Hpa II 346 Hae II 832 EcoR I 1782 BamH I 2533 BstX I 2759 Taq I 4739 Bgl I 5235,2.6.2 SV40-DNA的转录、复制与增殖,SV40 感染并进入细胞 DNA进入细胞核 进行早期转录，合成T抗原 启动DNA复制 晚期转录，合成包装蛋白 组装成病毒颗粒，细胞裂解-受纳细胞,2.6.3 构建SV40 克隆载体的策略和途径,策略： a) 保留完整的T-抗原基因 b) 保留复制起始点(Ori), 间隔区和终止序列 c) 替换晚期转录区基因,1) 取代型载体,2) 病毒-质粒重组克隆载体,含完整早期区段和复制起始点的病毒-质粒载体穿梭载体。,微型病毒复制子pTBC-1 只含SV40-DNA复制起点,2 病毒（噬菌体）克隆载体,噬菌体克隆载体Cosmid 克隆载体M13克隆载体CaMV克隆载体TMV克隆载体SV40克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体,2.7.1 劳斯肉瘤病毒的生物学特性 Rous Sarcoma Virus, RSV 1) RSV基因组的特点A. 基因组由4条的RNA分子构成 两条 RNA编码病毒的全部遗传信息 两条较小的RNA分子来自宿主细胞的tRNATrp,2.7 反转录病毒克隆载体,2) RSV病毒的复制与原病毒DNA的转录翻译,2.7.2 构建RSV病毒克隆载体的策略和途径1）互补的反转录病毒载体系统2）广寄主反转录病毒质粒载体3）反转录病毒表达载体,2 病毒（噬菌体）克隆载体,噬菌体克隆载体Cosmid 克隆载体M13克隆载体CaMV克隆载体TMV克隆载体SV40克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体,2.8 腺病毒克隆载体2.8.1 腺病毒的生物学特性腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb 腺病毒基因组的两端各有一段100bp的反向末端重复序列（ITR），是复制的起始位点。在两条链的5端各以共价键结合着一个被称为DNA末端蛋白（pTP）复合物（DNA-TPC）的特化的结构，与腺病毒复制密切相关。 蛋白启动（protein-priming）腺病毒的复制。自上个世纪50年代发现并成功分离腺病毒以来，已陆续发现了100余个血清型，其中人腺病毒有51种。,2.8.2 腺病毒载体的构建增加外源基因的装载容量 降低免疫原性 提高靶向性 多克隆位点和筛选标记基因,腺病毒载体的优点：宿主范围广, 对人致病性低在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因与人类基因同源不整合到染色体中，无插入致突变性能同时表达多个基因,2.8.3 应用基因治疗癌症表达真核基因研究疫苗,2 病毒（噬菌体）克隆载体,噬菌体克隆载体Cosmid 克隆载体M13克隆载体CaMV克隆载体TMV克隆载体SV40克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体,2.9.2 构建重组痘苗病毒载体 采用同源重组的方法。在外源目的基因(和报告基因)两端组装痘苗病毒的tk(胸苷激酶)基因DNA 片段或ha(血凝素)基因DNA 片段，作为重组的同源DNA 片段。如此构建的痘苗病毒克隆载体，通过与痘苗病毒基因组的tk 基因或ha 基因同源重组，将外源目的基因整合到痘苗病毒基因组上，包装后的重组痘苗病毒转导敏感的动物。,痘苗病毒载体的特点： 表达的产物具有与天然产物相近的生物活性和理化性质，较原核及酵母系统的表达产物更接近于天然； 重组痘苗病毒具有较好的免疫原性； 外源基因的插入量大； 宿主细胞广泛； 表达产物可以进行各种翻译后修饰，无需佐剂就可刺激机体产生体液免疫和细胞免疫，纯化过程相对简单，产物对外界环境相对稳定及易于保存运输； 利用痘苗病毒系统表达的外源目的的基因在实验动物中可提供保护性免疫反应。,2 病毒（噬菌体）克隆载体,噬菌体克隆载体Cosmid 克隆载体M13克隆载体CaMV克隆载体TMV克隆载体SV40克隆载体反转录病毒克隆载体腺病毒克隆载体痘苗病毒克隆载体杆状病毒表达克隆载体,2.10 昆虫杆状病毒（baculovirus） 如核型多角体病毒AC NPV ，载体的优点：表达效率高，目的基因插入的容量相对大，使用安全等 。 目前在农业基因工程上应用较多。如携带杀虫基因的病毒对农作物进行生物防治。,