基因工程的载体和工具酶ppt课件.ppt

1,1,第二章 基因工程的载体和工具酶,第一节 载体,2,2,引 言,基因克隆的本质是使目的基因在特定的条件下得到扩增和表达，而目的基因本身无法进行复制和表达、不易进入受体细胞、不能稳定维持，所以就必须借助于“载体”及其“寄主细胞”来实现。作为基因克隆的载体必须具备以下特性：载体必须是复制子。-(在低等生物中复制的要求）具有合适的筛选标记，便于重组子的筛选。（是否为生物生存必需的？）具备多克隆位点（MCS），便于外源基因插入。自身分子量较小，拷贝数高。在宿主细胞内稳定性高。(6)无害性：对于载体（不能超片段长度限制）和宿主。,3,3,Characteristics of vectors for gene cloning,4,载体的分类,一、病毒载体和非病毒载体非病毒载体：,质粒噬菌体载体黏粒载体人工染色体,二、克隆载体和表达载体克隆载体是以保存基因为目的的载体,三、游离载体和整合载体,四、穿梭载体 P10,5,5,一、 质粒载体（plasimid vectors）,（一）质粒载体的生物学特性（二）质粒载体的制备 （三）质粒载体的改造,6,6,（一）质粒的生物学特性,（1）质粒的组成与构型质粒是独立于染色体以外的能自主复制的裸露的双链环状(少数为线形和RNA） DNA分子。,广泛从在于细菌细胞中，比病毒更简单。在霉菌、蓝藻、酵母和一些动植物细胞中也发现了质粒，目前对细菌的质粒研究得比较深入，特别是大肠杆菌的质粒。,7,7,质粒的存在形式有超螺旋、开环双螺旋和线状双螺旋三种,8,8,ocLcsc,Sc 超螺旋 Lc开环线性 Oc开环双螺旋,9,9,（一）质粒的生物学特性,（2）质粒的大小差异很大，最小的只有1kb,只能编码中等大小的2-3种蛋白质分子，最大的达到200kb。（3）质粒的生存在寄主细胞中“友好”地“借居”，离开了寄主它本身无法复制；同时质粒往往有宿主专一性，如大肠杆菌的复制起点不一定能在其它生物细胞中繁殖。有的可以在两种宿主中穿梭，可以构建出“穿梭载体”。,10,10,（一）质粒的生物学特性,（4）质粒的复制 既然质粒在宿主中能稳定维持，不会随着细胞的分裂而消失，表明质粒有自我复制和正确分配到子细胞的功能。,cop,复制基因,阻遏物,质粒不会无限制复制,11,一种质粒在宿主细胞中存在的数目称为该质粒的拷贝数。据拷贝数将质粒分为两种复制型：“严紧型”质粒（stigent plasmid）,拷贝数为1-3；“松弛型”质粒（relaxed plasmid）,拷贝数为10以上。不过即使是同一质粒，其拷贝数在不同的寄主细胞间和不同的生长环境也可能有很大的变化。,质粒的复制不需要自身编码蛋白质，利用的是细菌编码的蛋白质，这种蛋白质的半衰期较长，因此利用抑制蛋白质合成的药物（如氯霉素）可以造成质粒在细菌内的积累。,氯霉素处理细菌后，松弛型质粒的拷贝和严紧型质粒的拷贝数都会增加么？,12,（5）质粒的不亲和性 把能寄于同一细胞内的不同质粒称为亲和性质粒，不能寄于同一细胞内的质粒称为不相容性质粒或不亲和性质粒。,当质粒承载外源基因转入受体时就要考虑转入的质粒与外源质粒的亲和性。？,不亲和的机制尚没有圆满的解释，但认为与inc基因有关，inc基因调节内源质粒的复制。成熟的细胞中内源的质粒都处于稳定的饱和状态，因此，亲缘密切的质粒引入细胞中也不会复制，最后消失。,13,安全？, 质粒的转移,13,（一）质粒的生物学特性,分子量大严紧型复制,分子量小松弛型复制,是否含有接合转移基因,非转移性质粒，不含tra基因；可以为转移性质粒所带动转移。,转移性质粒，含有tra基因；能通过结合作用从一个细胞转移到另一个细胞。,在一般情况下，质粒的接合转移能力与分子大小及复制型间有一定的相关性。现归纳如下：,接合型质粒,非接合型质粒,14,（7）质粒的筛选标记 氨苄青霉素抗性ampr ，四环素抗性tetr，卡那抗性kanr，这些可以在细菌中使用，在真核生物中一般用潮霉素抗性hphr，卡那kanr也可以用作真核细胞的筛选标记。营养缺陷型的应用插入失活和互补。,（一）质粒的生物学特性,15,15,（二）质粒DNA的制备,有多种分离质粒的方法，如碱裂解法、煮沸裂解法、层析柱过滤法等。 目前一般使用碱变性法制备质粒DNA。这个方法主要包括培养收集细菌菌体，裂解细胞，将质粒DNA与染色体DNA分开及除去蛋白质和RNA。,16,16,碱变性法质粒提取的原理： 根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间，在拓扑学上的差异而发展出来的。 在pH值12.012.5范围内时，线性的DNA会被变性而共价闭合环状质粒DNA却不会分离。 通过冷却或恢复中性pH值使之复性，线性染色体形成网状结构，而cccDNA可以准确迅速复性，通过离心去除线性染色体，获得含有cccDNA的上清液，最后用乙醇沉淀，获得质粒DNA。,18,实验材料、器具及药品,实验器具微量取液器(20l,200l,1000l)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器。,实验材料含PUCm-T的E. coli DH5菌株，1.5ml塑料离心管(又称eppendorf管), 离心管架。,19,实验药品1.LB培养基配制及分装(每升用量)胰蛋白胨(Bacto-tryptone) 10g酵母提取物(Bacto-yeast extract) 5gNaCl 10gpH 7.5121，20min 高压灭菌,20,培养大肠杆菌一般用LB培养基。为了保证培养的细菌不被污染，一般会在培养基中加入抗性。一般amp r的浓度为50150ug/ml,tec r的浓度为1550ug/ml，氯霉素为20ug/ml，kan r为2550ug/ml。,为了从菌体中获得高浓度的质粒，必须控制菌体的生长状态。为此，菌种最好先通过活化、鉴定，然后扩大培养。扩大培养34小时候，可以加入？再培养10小时。,21,Solution I:Tris.HCl （pH 7.5）50 mMEDTA 10 mMSolution II: NaOH 0.2 MSDS 1 %Solution III: Final concentrationKAc 1.32 MUsing HAc to adjust pH to 4.8TE (pH 8.0) Tris.HCl （pH 8.0） 10 mM EDTA （pH 8.0） 1 mM RNase A 100 g/ml,22,solution I 重悬细菌solution II，其中的SDS破坏细胞壁、膜，使细胞内容物释放出来，NaOH 使DNA变性、碱基对打开，使宿主染色体DNA双链分开，而闭合环状的质粒DNA处于拓扑缠绕状态，两个环并不分开,碱裂解法,23,Solution III 中和后，宿主DNA由于很大，碱基还未来得及配对就在冰冷的条件下与SDS、蛋白质、高分子量的RNA等缠绕在一起沉淀下来，而质粒DNA由于很小且双链未分开，能够迅速配对重新形成超螺旋，处于溶解状态。,碱裂解法,24,质粒的沉淀：加2/3体积的异丙醇，室温下放置5分钟或两倍体积的无水（或95）乙醇混匀，冰上放置10分钟；质粒的纯化：一般采用苯酚(tris饱和酚ph7.0）/氯仿纯化质粒; 为满足较高要求，可采用氯化铯密度梯度离心,25,实验步骤,接种含pUC-mT质粒的大肠杆菌到1.5ml含有60g/ml Amp抗生素的LB 液体培养基 37摇培过夜（1012h） 12000rpm, 3min弃去上清液，倒立于滤纸之上，尽量去净上清。加100l 液，涡旋震荡，充分混匀配制适量的液加200l 液，迅速轻轻混匀（以颠倒EP管5-10次为宜）， 冰浴，5-10min，此时应有丝状物出现。,26,加150l 液，轻轻混匀， 冰浴，5min以上此时应有絮状物出现。 12000rpm, 5min取上清液，加等体积的酚-氯仿-异戊醇，涡旋振荡，使溶液呈现乳白色，5min 12000rpm, 10min取上清液，加2倍体积的冷乙醇，混匀，-20，30min 12000rpm, 10min弃去上清液，用70%乙醇清洗沉淀 干燥加20l TE溶解，4保存,27,27,问题：,）有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒不能被限制酶所切割，这几乎总是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。,28,28,大多数情况下，用酚：氯仿对溶液进行抽提可以去除小量制备物中的杂质。如果依然存在，可用离心柱层析法纯化。,29,29,）在十分偶然的情况下，个别小量制备物会出现无质粒的现象。这几乎肯定是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。,30,30,（三）质粒载体的改造,去掉不必要的DNA区段。减少限制酶的识别位点，一种酶只保留一个。（单一的限制性酶切位点）。加入易于捡出的选择性标记基因。对质粒进行安全性改造，要求质粒不能随便 转移。改造或增加基因表达的调控序列。,31,概念,酶的星号活性：在非最适条件下，有些核酸限制性内切酶识别序列的特异性便会松动，从其正确识别序列以外的其他位点切割DNA分子，这种现象称星号活性。P13,1、质粒pBR322,-plasmid的缩写BR-人名缩写，Bolivar和Rodriguez322-是实验室编号,32,32,pBR3224363,结构：（1）氨苄青霉素抗性基因（ampr或Apr） 3种限制酶单一识别位点 。（2）四环素抗性基因（tetr或Tcr）内部有7种，启动区内有2种限制酶单一识别位点 。（3）DNA复制起点（ori）,33,33,BR322质粒的优点：（1）具有较小的分子量。 4363bp，2.6106Da，（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号。 （3）具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积10003000个拷贝。（4）对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点。,pBR3224363,34,34,怎么筛选到重组子？,35,35,36,36,37,37,2、pUC质粒载体,1987年，J.Messing和J.Vieria采用MCS技术在pBR322基础上构建的结构：（1）来自于pBR322的Ori（2）氨苄青霉素的抗性基因(ampr)。 但核苷酸序列发生了变化（3） LacZ基因 编码半乳糖酶的肽链即氨基末端。（4）MCS区段,是一段用于插入外源DNA片段的特定区域，由一系列的紧密相连的限制性内切酶位点组成，而且每个限制性内切酶位点在整个载体中是唯一的。,38,38,Z Y X,I,P,O,CAP,Z Y X,I,P,O,CAP,39,39,乳糖操纵子的天然诱导物是乳糖 乳糖类似物异丙基-D -硫代半乳糖苷（IPTG） 有更强的诱导作用。 IPTG配合使用在基因工程可作蓝白斑筛选。 LacZ基因编码的乳糖苷酶 X-gal 蓝色吲哚产物,蓝白斑试验（IPTG-Xgal 试验）,5-溴-4-氯-3-吲哚-D-半乳糖苷,40,40,标志补救（-半乳糖苷酶法）,lacZ,41,41,42,43,43,（LacZ基因 N端序列）,插入片段,（LacZ基因失活）,LacZ基因 N端序列,LacZ酶,44,互补显色反应,45,请你总结一下哪些方面pUC载体优于pBR载体？,46,46,2、pUC质粒载体,与pBR322相比， pUC质粒载体优点：（1）具有更小的分子量和更高的拷贝数 如pUC8为2 750bp，pUCl8为2 686bp，控制质粒复制rop基因的缺失，平均每个细胞即可达500700个拷贝（2）适用于组织化学法检测重组体通过-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子。（3）具有多克隆位点区段（MCS）可以定向克隆防止载体自我连接。并且它的多克隆位点与M13载体的多克隆位点相同。,47,48,T载体,在分子克隆的实践中，人们发现用于PCR的耐热DNA聚合酶（Taq酶）具有一种非模版依赖的活性，这种活性可以在PCR产物的3端加上一个非配对的脱氧嘌呤嘧啶核苷（A）。根据这一特点研制出了一种质粒，其5末端各带有一个不配对的脱氧胸腺嘧啶核苷（T），采用该质粒可以将PCR产物以T-A连接的方式进行克隆，即TA克隆。这种载体叫T载体。,49,T载体是一个什么样的载体？环形的还是线性的？能够进行自我的复制么？,50,MCS,51,T-vector两条链的3端含有一个游离的TPCR过程中，普通的Taq酶可在产物的3端多加一个A,T-A克隆,52,53,53,二、 噬菌体载体（phage vectors）,（一）噬菌体载体（二） M13噬菌体载体（三）柯斯质粒载体,54,54,噬菌体是比细菌还小得多的微生物，和病毒侵犯真核细胞一样，噬菌体侵犯细菌，也可以认为它是细菌里的“寄生虫”。它本身是一种核蛋白，核心是一段DNA，结构上有一个蛋白质外壳和尾巴，尾巴上的微丝可以把噬菌体的DNA注入细菌内。,55,55,1. 噬菌体的生物学特性,溶菌周期指噬菌体将DNA注入寄主细胞后很快环化，然后进行自我复制、蛋白衣壳合成和新噬菌体颗粒的组装，最后使寄主细胞破裂而释放出大量的子代噬菌体。溶源周期中，注入寄主细胞的噬菌体DNA是整合到寄主细胞染色体上并可以随着寄主细胞的分裂而进行复制。整合了一套完整的噬菌体基因组的细菌被称为溶源性细菌。在溶源性细菌内存在的整合或非整合的噬菌体DNA被称为原噬菌体。,噬菌体,温和噬菌体，具有溶源生长周期和溶菌生长周期,烈性噬菌体,只具有溶菌生长周期,作为分子克隆我们需要使用哪种噬菌体？,56,56,侵犯细菌时，只是DNA侵入，然后利用细菌的酶来复制、转录、翻译。 入侵E.coli后，可以按裂解或建立溶原两种生活方式生存和繁殖（图1-5）。 图左示噬菌体在宿主内进行独立复制，在1个菌体内生长出100个左右的新噬菌体，并冲破（杀死）细菌释放出来，再度感染其它活菌，称为裂解。 噬菌体侵入菌体后，把自身DNA加进细菌DNA里（整合），作为细菌基因的一部分，随菌的细胞分裂而增殖，这种生活状态称为溶原（lysogen）。,噬菌体的生活周期,57,57,噬菌体的生活周期： 裂解侵入细菌-独立复制-裂解（冲破细胞膜）-再感染其他细菌。,58,58,59,59,60,60,噬菌体的结构和用途,噬菌体线性双链DNA病毒，具有末端互补的12bp（cos位点，蛋白包装识别信号），对包装的大小有要求：35kb51kb。感染细菌后粘端互补成双链环状。全长48 531bp，含50多个基因。,61,61,噬菌体基因大致分为4个区： 结构区A J19个基因，编码头、 尾部蛋白质为结构区,重组区 att（attachment）、int（intagrate）及xis（excission），调控区启动子、终止子和N、CI基因， O-R 为裂解区.,Tail,head,recombination,replication,lysis,Cos位点,Cos位点,62,62,噬菌体载体类型,置换型 （Replacement vectors）这种载体具有两个对应的酶切克隆位点，在两个位点之间的DNA区段是噬菌体的非必需序列，可以被外源插入的DNA取代。如Charon 4 载体克隆能力大，2025kb,插入型 （Insertion vectors ）这种载体仅仅有一个可供外源DNA插入的克隆位点。如：gt10 、 gt11 克隆能力小，不到10kb,噬菌体载体的类型,噬菌体载体类型,插入型载体:有单一酶切点,便于外源DNA插入,(b)gt10，插入位于cI基因内的单一的酶切位点EcoR I。插入失活导致裂解循环，形成清亮的噬菌斑，而cI野生型的为浑浊性噬菌斑，从而很容易识别重组子。,64,64,Replacement vectors（如charon4）P20,置换型载体,Lac Z,特殊性质：中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体裂解生长的能力。只有DNA的长度大于野生型噬菌体DNA长度的75而不超过其105时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降，因此要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。 而包装外源DNA的上限为25kb。,如果用SalI酶切，会有什么结果？,65,这一特殊性质作为选择标记：,重组子被包装：当EcoR切开DNA后，目的基因可以连接于左右两臂之间，形成足够长度的DNA片段而被包装。非重组子不被包装：如果没有外源DNA插入，由左右两臂直接融合起来的缺损基因，由于长度不足，不能包装。,未被EcoR I切开的原载体怎样与重组子区分开？,66,66,它们的基因组中含有一个大肠杆菌的lac5区段，其中编码着半乳糖苷酶基因lacZ。由这种载体感染的大肠杆菌lac-指示菌，涂布在补加有IPTG和Xgal的培养基平板上，会形成蓝色的噬菌斑。如果外源DNA插入到lac5区段上，阻断了-半乳糖苷酶基因lacZ的编码序列，不能合成-半乳糖苷酶，只能形成无色的噬菌斑。,67,野生的噬菌体随着DNA的复制，同时合成噬菌体衣壳蛋白和其他包装蛋白，并随时包装成噬菌体颗粒，一般不会在体内积累。,缺少了D基因的噬菌体,侵染,D、E基因与包装蛋白有关的基因,侵染,缺少了E基因的噬菌体,分别有什么现象？会不会裂解？,提取两种大肠杆菌的蛋白，其中包含了噬菌体的包装蛋白，然后使之与DNA混合，既得到完整含有外源基因的噬菌体。,包装蛋白的制备,sup-细菌,头部基因（琥珀突变型）,尾部基因（琥珀突变型）,转录复制蛋白质合成,组装尾部所需要的组分,“无头部”的提取物,组装头部所需要的组分,“无尾部”的提取物,温育,完整的噬菌体,转录复制蛋白质合成,T4噬菌体的体外包装,DNA的体外包装,体外包装的重组DNA比裸露的DNA导入受体细胞的效率高100-10000倍,69,野生型噬菌体不能在携带有P2原噬菌体的溶源菌中生长，的这种表型称为Spi+(对P2的干扰敏感)。当基因组中缺少参与重组的red和gam基因时，突变体便可以在P2溶原菌中生长，其表型称为Spi-。基因red和gam位于非必需区域内，外源DNA片段能置换基因red和gam形成重组体，其重组体能在recA+的P2溶原菌中繁殖，并且显示出Spi-的表型。因此只要选用recA+的P2溶原菌作为宿主菌，就可以对重组体进行筛选。能浸染宿主菌产生噬菌斑的即是重组分子。但这种噬菌斑小且少。,-DASH重组体的筛选,70,噬菌体的构建策略和技术路线,71,结合包装过程1通过裂解过程增殖载体、回收、纯化2酶切、载体与外源DNA3连接4体外包装 5感染/铺平板6筛选,克隆原理及步骤,72,对于一个相对简单的基因家族（如哺乳动物的珠蛋白基因）也要遍布至少70kb的基因组DNA中，而更复杂的可以遍布数十万个碱基对。这种基因的分析通常用染色体“步查”的方法来分析相互重叠的重组子。 由于染色体步查是一个十分缓慢的过程，每一步也许要花费一个月或更长时间，故用黏粒比用噬菌体更有优势。,73,73,（二）柯斯质粒载体（cosmid vectors）,柯斯质粒载体的特点,柯斯质粒是一类人工构建的含有DNA的cos序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体，cosmid是cos site carrying plasmid的缩写。柯斯质粒的大小为4-6kb，由3部分组成： A.多克隆位点区 B. 含有cos位点的DNA区 C. 复制起始位点和抗性标记区,pHC79,Ori,Marker,MCS,cos,DNA,74,74,（二） 柯斯质粒载体（cosmid vectors）,柯斯质粒载体的特性（cos site-carring plasmid）1、具有噬菌体的特性 柯斯质粒连接上适宜长度的外源DNA后可以在体外包装成噬菌体颗粒，并能高效转导寄主细胞。进入寄主细胞的DNA也能环化和复制，但是不会形成新的噬菌体颗粒，也不能发生溶菌现象。2、具有质粒载体的特性 能象质粒一样在寄主细胞内复制，且带有抗性选择标记基因，有些还带有插入失活型的多克隆位点，为重组体的筛选提供了方便。3、高容量的克隆能力 cos质粒本身很小，只有复制起点、选择标记和cos位点等构成，所以其克隆上限可达45kb左右。不过由于包装的限制，其克隆片段至少要达到30kb。,75,75,（二） 柯斯质粒载体（cosmid vectors）,柯斯质粒载体的应用,噬菌体的位点特异切割体系末端酶（terminase）体系，识别两个相距38-54kb cos位点，并进行切割，后被包装。 下面的操作中缺点是：cosmid自我重组、外源DNA片段串联 后重组。,利用柯斯载体载体进行基因克隆的一般程序,77,采用柯斯质粒作载体的困难,载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；,78,大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出3045kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二处片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；,采用柯斯质粒作载体的困难,79,80,80,（二）M13噬菌体,1、丝状噬菌体M13噬菌体的生物学特性复制与增殖（图）,是单链闭合环状噬菌体只能感染雄性细菌，外形成丝状，基因组DNA长约6.4kb，可分为10个区和507 bp基因间隔区（IS区），该区可以接受外源DNA的插入而不会影响到噬菌体的活力。这是该噬菌体能用于单链DNA载体的重要前提。,81,81,M13噬菌体的复制与增殖,“”DNA,CP,CP脱落，“”DNA复制,RFDNA,“”型复制,积累200300份,滚环复制,SSB,外溢时被包装,M13噬菌体,M13噬菌体首先吸附在F性须上，其吸附的位点看来是在性须的末端。噬菌体的基因组从性须末端进入到细胞的内部，进入细胞内部的M13（）链DNA，便起到一种模板的作用，合成出互补的（一）链 DNA。由此形成的双链形式的M13DNA，称为复制型 DNA。它按形式进行几轮复制之后，基因 的产物便在RFDNA的正链待定位点上作切割反应，形成一个缺口。这样，M13基因组的扩增活动便正式开始启动。其基本特点是利用大肠杆菌的DNA聚合酶I，以环形的MI3（一）DNA为模板合成 M13（）DNA。当DNA复制叉沿着模板DNA分子转移到复制终点时，在基因编码产物的作用下，新合成的（十）DNA便会被切除下去，并进一步环化形成单位长度的 M13基因组DNA,82,82,M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点：M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢；M13噬菌体DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13噬菌体DNA导人宿主菌中；M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RF DNA：单链DNA的酶切和连接是比较困难的。,83,M13噬菌体的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。外源片段插入位点在基因和基因之间的508bp间隔区-M13不像噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因。,84,84,2. M13噬菌体载体的构建,这类载体的突出优点在于其既可以提供单链DNA，也可以提供双链的DNA。其最大的不足在于插入大的DNA片段后表现不稳定，在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内，克隆300-400bp的片段十分稳定。, 在IS区内插入LacZ基因 在标记基因区内组装MCS区段所以能通过互补在X-Gal/ IPTG平板上识别重组体。这类载体包括了 M13mp8、9 和 M13mp18 、 19等。,85,85,亚克隆 subclone 用限制性酶切或PCR等手段从已经克隆的DNA中获得该克隆DNA的部分序列或改造过的序列，再克隆到另外的新载体中的技术。,86,在基因克隆中一直困扰着科学家的是载体的容量问题，因为很多基因的序列很长，如人的凝血因子VIII基因长180kb，肌营养不良基因长至少1800kb，这样这些基因很难作为单一片断克隆于这些载体中，如质粒载体等。 这样发展起了另外一种技术：酵母人工染色体。,四、酵母人工染色体载体系统 YAC（Yeast Artificial Chromosome）,酵母菌的着丝粒-有丝分裂和减数分裂,酵母菌的端粒-保证染色体末端完全复制,自主复制顺序-具复制起点的功能,有细菌和酵母的两种选择性标记,1987年 David Burke 构建,2.特点:最大特点是能克隆大DNA片段(平均300Kb,最大2000Kb),结构组成,1.,TRP 色氨酸合成基因URA3尿嘧啶合成基因Sup4- 酪氨酸tRNA,89,选择标记-Sup4,Sup4基因编码赭色抑制Trp-tRNA，抑制赭色表型(成为白色)。不含外源DNA片段的pYAC4载体转化酵母菌，转化子的菌落呈白色。带有插入的外源DNA片段的pYAC4重组载体，其Sup4已经失活，结果转化酵母菌后所产生的转化子形成赭色菌落。,90,YAC载体-pYAC4,主要结构： 两个可在酵母菌中利用的选择基因，URA3和TRP1(色氨酸合成基因)； 酵母菌着丝粒序列 (centromere4,CEN4)； 一个自主复制序列(ARS1)； 两个来自嗜热四膜虫 (Tetrahymenna thermophilp)的末端重复序列(TEL)，以保持重组YAC为线状结构； 在两个末端序列中间，有一段填充序列(stuff, HIS3)，以便pYAC4在细菌细胞中稳定扩增； Amp抗性及细菌质粒复制原点； 一个EcoR克隆位点，该位点位于酵母菌Sup4 tRNA基因内。,92,92,第二节 基因操作的工具酶,一、 限制性核酸内切酶及其应用二、 DNA连接酶及其应用三、 DNA聚合酶及其应用四、 修饰性工具酶,93,94,95,95,（一）限制性核酸内切酶的发现（二）限制性核酸内切酶的分类（三）限制性核酸内切酶的命名（四） II型限制性核酸内切酶的基本特性（五）限制性核酸内切酶的消化反应,一、 限制性核酸内切酶及其应用,96,96,由寄主控制的限制和修饰现象-20世纪60年代，Linn和Arber 发现,(K),大肠杆菌B,大肠杆菌K,1,1,410 4,10 4,E.O.P 成斑率efficiency of plating,外源DNA,自身DNA,（一）核酸限制性核酸内切酶的发现：切酶。,97,97,E.coliB含有EcoB核酸酶和EcoB甲基化酶 当(k)噬菌体侵染E.coliB时，由于其DNA中有EcoB核酸酶特异识别的碱基序列，被降解掉。而E.coliB的DNA中虽然也存在这种特异序列，但可在EcoB甲基化酶的作用下，催化S-腺苷甲硫氨酸（SAM）将甲基转移给限制酶识别序列的特定碱基，使之甲基化。 EcoB核酸酶不能识别已甲基化的序列。,98,98,限制修饰的酶学系统,酶切位点不被修饰,噬菌体DNA被切割,酶切位点被修饰,基因组DNA不被切割,99,99,最早分离出的限制内切酶1968年，Meselson和Yuan，大肠杆菌B和K菌株，EcoB和EcoK， 是I型的，没有实用价值。首个II型限制内切酶1970年，H.O.Smith等从Heamophilus influenzae的Rd菌株中Hind II 。使得DNA分子的体外精确切割成为可能。从此，相关研究展开。如NEB（New England Biolabs）公司的提取和克隆。目前已纯化出400多种限制性内切酶中，其中有30%是在NEB发现的 。限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ）：是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。切开的是3，5磷酸二酯键。,100,100,（二）限制性核酸内切酶的类型及其主要特性,特性1. 限制修饰活性2. 内切酶的蛋白 质结构3. 限制辅助因子4. 切割位点5. 特异性切割6. 基因克隆中,I 型双功能的酶3种不同亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸距特异性位点5端至少1000bp不是（随机）无用,II 型限制酶和修饰酶分开单一成分 Mg2+位于识别位点上 是非常有用,III 型双功能酶2种亚基ATP、Mg2+和S-腺苷甲硫氨酸特异性位点3端24-26bp处是用处不大,101,101,（三）限制性核酸内切酶的命名,1、寄主菌属名的第一个字母和种名的头两个字母组成3个斜体 字母的略语表示酶来源的菌种名称，如大肠杆菌Escherichia coli 表示为Eco , 流感嗜血菌Haemophilus influenzae 表示为 Hin；,2、用一个正体字母表示菌株的类型，比如EcoR、Hind；3、如果一种特殊的寄主菌株具有几个不同的限制修饰体系，则用罗马数字标出，比如Eco R I、 Hind III。,102,102,（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点（93%）,1、识别位点的特异性 每种酶都有其特定的DNA识别 位点，通常是由48个核苷酸组成的特定序列（靶序列）。2、识别序列的对称性 靶序列通常具有双重旋转对称 的结构，即双链的核苷酸顺序呈回文结构。3、切割位点的规范性 交错切或对称切（可形成粘性末端或平末端的DNA分子）。,103,4 bp：Sau3A GATC,1. 长度 4-8bp 常见6bp,5 bp：EcoR CCWGG Nci CCSGG,6 bp：EcoR GAATTCHind AAGCTT,7 bp：BbvC CCTCAGCPpuM RGGWCCY,8 bp： Not GCGGCCGC Sfi GGCCNNNNNGGCC,W=A or T S=C or G,（四）II型限制性核酸内切酶的基本特点（93%）,104,回文对称palindrome 切割位点在 DNA 两条链相对称的位置,2. 结构,两个特点:,以某一对核苷酸为中轴,左右同数目的核苷酸彼 此呈碱基互补这两股DNA链若按同方向阅读(5-3或3-5),其核 苷酸序列相同,105,EcoR 5-GAATTC-3 3-CTTAAG-5,Hind 5-AAGCT T-3 3-T TCGAA-5,106,不对称asymmetria 有些酶的识别序列是不对称的,AccBS CCGCTC GGCGAG BssS CTCGT G G AGCAC,107,多识别序列（简并序列degenerate sequence）,Acc GTMKAC Hind GTYRAC,GTAGACGTATACGTCGACGTCTAC,M=A or C K=G or T Y=C or T R=A or G,Acc,Hind,GTCAACGTCGACGTTAACGTTGAC,108,间断对称interrupted symmetria,AlwN CAGNNNCTG GTCNNNGAC,有些酶的识别序列呈间断对称,对称序列之间含若干个任意碱基,Dde CTNAG GANTC,109,109,几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点,110,110,与II型核酸内切酶有关的几个概念,粘性末端 cohesive ends是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。平 末 端 Blunt end在识别序列对称处同时切开DNA分子两条链，产生的平齐末端结构。则不易于重新环化。 同裂酶 isoschizomers 能识别和切割同样的核苷酸靶序列的不同来源的内切酶。不同同裂酶对位点的甲基化敏感性有差别。同尾酶 isocaudamers 识别的靶序列不同，但能产生相同粘性末端的一类限制性核酸内切酶。如BamH I 、BclI、BglII和Xho I 是一组同尾酶。注 意： 由同尾酶产生的粘性末端序列很容易重新连接，但是两种同尾酶消化产生的粘性末端重新连接形成的新片段将不能被该两种酶的任一种所识别。,111,111,平齐末端,带5P端的黏性末端,带3OH 和5P端的平末端,例如Hpa和Msp是同裂酶，识别顺序都是 5C|CGG3 3GGC|C5 如果其中有5-甲基胞嘧啶，Hpa不能够切割，MspI能切割。,112,112,经同尾酶消化的DNA末端连接示意图,5 XXXXGGATCCXXXXXX 33 XXXXCCTAGGXXXXXX 5,BamH I,5 XXXXG GATCCXXXXXX 3 3 XXXXCCTAG GXXXXXX 5,5 XXXXAGATCTXXXXXX 33 XXXXTCTAGAXXXXXX 5,Bgl II,5 XXXXA GATCTXXXXXX 3 3 XXXXTCTAG AXXXXXX 5,113,(五）II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作,大部分II 型核酸内切酶的缓冲液：,限制性核酸内切酶,Mg2+ 10mM MgCl2 或 MgAc,BSA 100g/ml ，只是少数反应需要,DTT （dithiothreitol,二硫苏糖醇） 1mM,114,低0 mM,中50 mM,高100 mM,离子强度 NaCl 0 - 150 mM,115,使用浓度不同，酶的活性不同,0.5 1 1.5 2,116,117,3 CGATGTACCTAG,Bam HI Sma I,II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：,对盐浓度要求相同的酶，原则上可以同时酶切，但应注意：,5 GCTACATG,GATCCCGGGTTCGCAT3,GGCCCAAGCGTA5,5 GCTACATGGATCCC,3 CGATGTACCTAGGG,GGGTTCGCAT3,CCCAAGCGTA5,限制性核酸内切酶,118,对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：,0.1倍体积的 5 M NaAc pH 5.4,2.5倍体积的冰冷乙醇,冰浴 5 分钟、高速冷冻离心10分钟、干燥,限制性核酸内切酶,119,影响限制性核酸内切酶活性的因素,（1）DNA样品的纯度：,蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA、SDS、NaCl等,加大酶的用量，1 mg DNA 用 10 U 酶,加大反应总体积,延长反应时间,限制性核酸内切酶,120,（2）DNA样品的甲基化程度：,大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基，受其影响的酶有Bcl I、Mbo I等，但BamH I、 Bgl II、Sau3A I不受影响。,大肠杆菌中的dcm甲基化酶在5CCAGG3或5CCTGG3序列中的胞嘧啶C5位上引入甲基，受其影响的酶有EcoR II等。,哺乳动物中的甲基化酶在5CG3序列中的C5位上引入甲基。,限制性核酸内切酶,121,（3）核酸内切酶的缓冲液性质：,在“非最适的”反应条件下（高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH值等）,有些核酸内切限制酶识别序列的特异性便会发生“松动”，从其“正确”识别序列以外的其它位点切割DNA分子，这种现象叫星号活性。用*表示。,Example：,Eco R I 在正常条件下识别并切割5GAATTC3序列，但在甘油浓度超过5%（v/v）时，也可切割5AATT3或者5PuPuATPyPy3。,限制性核酸内切酶,122,影响酶切反应的因素很多，最重要的有：DNA的纯度、浓度（不超过1.5ug/50ul)DNA的甲基化程度（大肠杆菌中含有Dam和Dcm甲基化 酶）MboI 不能酶切甲基化序列，但同功酶Sau3AI可以酶切反应的温度（通常为37 ）DNA的分子结构 核酸内切限制酶的缓冲液 （10X母液）(6）反应时间 通常为1.5小时（7）加入酶量 不超过总体积的10%,123,123,酶 切 反 应 的 基 本 步 骤,电泳,紫外分析,37 1h,加反应液,CK,M,ddH2O 约16.5 LBuffer (10X) 2.0 LDNA 0.21.0 gEnzyme 12UVolume 20.0 L,1.0kb,1.0kb,0.4kb,0.5kb,0.6kb,CK,M,T,T,124,124,（一）DNA连接酶的发现（二） DNA连接酶作用特点（三