基因工程 第一章 核酸的制备ppt课件.ppt

第一章 核酸的制备,Chapter 1 Preparation of nucleic acid,核酸：遗传信息的储存物质,脱氧核糖核酸：deoxyribonucleic acid, DNA核糖核酸：ribonucleic acid, RNA区别：,第一节 天然DNA的制备（Preparation of DNA）,一、DNA的组成与结构（ Composition and Structure of DNA）:,A phosphate group linked by a phosphodiester bond to a pentose (a five-carbon sugar molecule)that in turn is linked to a nitrogen- and carbon-containing ring structure commonly referred to as a “base”.,Base,Pentose,Phosphate Group,Nucleotide,主要碱基的化学结构：,结构：,DNA,DNA,解链温度（Tm，melting point）,DNA分子杂交(Hybridization of DNA strands from different sources),环状DNA（Circular DNA）,超螺旋DNA（supercoiled DNA ，SC-DNA）；共价闭合环状DNA（Covalently closed circular DNA，cccDNA）；开环DNA（open circle DNA，oc-DNA）；线形DNA（linear DNA，L-DNA）,二、天然DNA的提取（Purification of DNA）,(一)生物材料的准备（Preparation of Material）：1.DNA的保存：1.1.70%的乙醇（ Ethanol ）1.2.TE溶液（Tris-Cl 10 mmol/L pH 8.0， EDTA 1 mmol/L ）1.3.低温,2.大肠杆菌（E. coli）常见抗生素（Antibiotics）的使用：2.1 氨苄青霉素（ampicillin，Ap）：抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成，50150 g/mL（水溶液）；2.2 链霉素（streptomycin，Sm）：与细菌核糖体30S亚单位结合，抑制细菌蛋白质(酶)的合成,使细菌不能正常生长或者代谢而死亡， 2550 g/mL（水溶液）；2.3 四环素（tetracycline，Tc）：与细菌核蛋白体的30S亚单位结合，干扰核糖体上密码子与反密码子的相互作用，从而阻止氨酰基tRNA同核蛋白体结合， 5 mg/mL（乙醇溶液）；2.4 氯霉素（chloramphenicol，Cm）：与细菌核蛋白体50S亚基结合，抑制肽酰基转移酶，从而抑制蛋白质合成， 20 g/mL（乙醇溶液）；2.5 卡那霉素（knamycin，Km）：与细菌核蛋白体蛋白基结合，并与较小的RNA亚基编译区的特定碱基结合，从而抑制蛋白质合成， 2550 g/mL（水溶液）；,(二)裂解细胞（Cell lysis）：1.化学方法：1.1 CTAB裂解法：CTAB（cetyltriethy ammonium bromide，十六烷基三甲基溴化铵），阳离子去污剂，与核酸形成复合物，在高盐溶液（ 0.7 mol/L NaCl）中稳定，在低盐溶液（ 0.3 mol/L NaCl ）中沉淀。1.2 SDS裂解法：SDS（sodium dodecyl sulfate，十二烷基磺酸钠），阴离子去垢剂，蛋白质变性剂，有效沉淀多糖，与K离子形成絮状沉淀，广泛用于质粒（plasmid）DNA的提取，蛋白质的分离纯化。,2.酶裂解方法：2.2 蛋白酶K（Proteinase K）裂解法：用于水解蛋白质，特别是与DNA结合紧密的组蛋白（Histone），广泛用于动物组织基因组DNA的提取，通常与SDS，Tris-Cl及EDTA共同裂解细胞。2.3溶菌酶（lysozyme）裂解法：通常用于细菌裂解，提取质粒DNA，其原理是破坏细菌细胞壁的肽聚糖支架，通过低渗透压使细胞胀裂，引起细胞裂解。作用条件温和，pH 6.07.0，室温25 。,（三）DNA的分离和抽提,1.酚-氯仿抽提法：苯酚（ phenol ）-氯仿（ chloroform ）-异戊醇（isoamyl alcohol ）比例：25:24:1，苯酚：蛋白质变性剂；氯仿：蛋白质变性剂；并使变性的蛋白质从水相层分离；异戊醇：防止产生泡沫。,2. 氯化铯密度梯度离心法(CsCl density gradient centrifugation)；3. 固相萃取法(solid phase extraction, SPE)；,离心技术在基因工程中的应用（Application of Centrifugation techniques ）,（四）DNA的纯化（purification）和浓缩（condense）,1. DNA的纯化：1.1 Rnase处理，去除RNA；1.2 离子交换层析法；1.3 氯化铯密度梯度离心法；1.4 琼脂糖电泳洗脱法；,琼脂糖电泳（Agarose gel electrophoresis）,1.安放好制胶模具（梳子和胶槽）,2.琼脂糖凝胶浇灌并冷凝,3.移走梳子，暴露出上样孔,4.琼脂糖胶放置在电泳缓冲液中,5. 上样，通电流，直至DNA迁移到适当位置,6. 在紫外光（UV）下观察DNA电泳情况,DNA电泳完毕后的琼脂糖凝胶,在紫外光（UV）下观察DNA电泳情况,不同凝胶的DNA电泳情况,琼脂糖凝胶（agarose）,聚丙烯酰胺凝胶凝胶（PAGE）,电泳仪（电源和电泳槽）,离子交换柱层析纯化DNA,2. DNA的浓缩：2.1 乙醇（Ethanol）沉淀法；2.2 正丁醇（ butyl alcohol ）抽提法；2.3聚乙二醇（PEG6000）浓缩法；,第三节 人工合成核酸片段,二、核酸的酶法合成PCR反应（Polymerase Chain Reaction, 聚合酶链式反应）： 模仿细胞内发生的DNA复制过程，在体外有酶催化合成特异性DNA片段。,PCR技术简史,1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，以及70年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，Khorana的设想被人们遗忘了,PCR技术简史,1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖,1. PCR的基本原理(Mechanism of PCR ),类似于DNA的体内复制。其原理是通过高温变性模板、引物与模板退火、引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以几何级数倍增。,5,Primer 1,5,Primer 2,5,5,Template DNA,（3）PCR的基本反应步骤,变性95C,延伸72C,退火Tm-5C,PCR反应,标准的PCR反应条件：,10X缓冲液（Buffer）10 L4种dNTP混合物 各200umol/L引物（Primer） 各10100pmol模板DNA （Template） 0.12gTaq DNA聚合酶 0.5 2.5UMg2+ 1.5mmol/L,PCR反应,70-75,90-94,37-60,PCR循环,PCR反应,重复13步2530轮,目的DNA片段扩增100万倍以上,DNA双螺旋,DNA单链与引物复性,DNA变性形成2条单链,子链延伸DNA加倍,37-60 ,90-95,70-75 ,PCR 扩增,No. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target12243841653266420220=1,048,57630230=1.07X107,1 cycle = 2 Amplicon,2 cycle = 4 Amplicon,3 cycle = 8 Amplicon,4 cycle = 16 Amplicon,5 cycle = 32 Amplicon,6 cycle = 64 Amplicon,7 cycle = 128 Amplicon,PCR反应特点,灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位） 细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，24 小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNA,（1）Taq DNA聚合酶（2） Pwo DNA 聚合酶（3）Tth DNA 聚合酶（4）C.therm 聚合酶,4.2.1 耐热性DNA聚合酶,（1）Taq DNA聚合酶1986年从一种75热泉中的细菌 (Thermus aquaricus)中分离纯化出来的。 95kDa，单分子酶， 75 活性最强。具有 5-3 合成活性和 5-3 外切活性 , 无 3-5 外切活性。95 时半衰期为 40 分钟。启动 PCR 反应的能力很强，聚合速度快，在 72 的聚合速度为每秒 30-100 碱基。由于没有 3-5 外切活性，在扩增过程中有 8.9-11x10 -5 的错配率。,（2） Pwo DNA 聚合酶来自 古细菌Pyrococcus woesei，由德国宝灵曼公司开发（BM）， 90kDa ，100 的半衰期大于 2 小时，具有 3-5 外切活性，出错率低，使用较多的的且具有高保真度的 PCR 酶。,（3）Tth DNA 聚合酶来自嗜热热细菌（Thermus thermophilus） ，由 Promega 公司开发成商品。 94kDa ，95 的半衰期为 20 分钟。在 Mg2+ 存在条件下以 DNA 为模板合成 DNA ，而在 Mn2+ 存在下可以 RNA 为模板合成 cDNA 。因此可在高温下做 RT-PCR （反转录PCR）反应， 避免 RNA 反转录过程中形成的二级结构。,（4）C.therm 聚合酶 来自Carboxydothermus hudrogenoformans，以Mg2+为辅助因子的逆转录酶，最适温度适60-70 ， 同时也具有3-5外切酶校对活性，用于RT-PCR 反应。,4.2.2 靶DNA/模板,单、双链DNA均可。纯度：不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。使用浓度：一般100ng DNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。其两端20-30bp序列用以一对引物的设计。,引物长度1830bp，过短则降低特异性，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增，同时也增加引物合成的成本。避免引物内部或引物之间存在互补序列（3个碱基），避免序列内有较长的回文结构，减少引物二聚体的形成以及引物内部二级结构的形成。G/C和A/T碱基均匀分布，G+C含量在4060%之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶连续排列。,4.2.3 PCR引物,引物3末端碱基应与模板DNA严格配对，并且3末端为G、C时引发效率较高。引物5末端碱基可不与模板DNA匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性核酸内切酶的识别序列、ATG起始密码子或启动子序列等)，便于克隆和表达。引物用核酸序列保守区内设计并具有特异性，引物的碱基顺序不能与非扩增区有同源性。,4.2.4 PCR原材料,dNTP 脱氧核苷三磷酸四种dNTP浓度应相等要求：浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量,4.2.5 PCR缓冲液,成分：10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8室温下)，50 mmol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2。Mg2+：是DNA聚合酶的激活剂，0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降； Mg2+过高影响反应特异性,4.2.6 PCR循环的温度和时间,温度:90-95 模板变性，复性（37-60 ），温度由引物长度和GC含量决定；70-75 引物在模板上延伸反应时间变性30 s，如果模板 G+C 含量高，变性时间可适当延长。复性30 s。延伸1kb 1 min充足，由扩增产物的大小决定。 循环次数 2535 次。,25 L PCR反应体系：模板DNA 1 L （10100ng）引物1 1 L （10 mol/L）引物2 1 L （10 mol/L）dNTP（ 10 mmol/L ） 1 L （20 mmol/L）10 PCR反应的缓冲液 2.5 L Taq酶 0.5 L （ 1U/l）ddH2O 补至25 L,4.3 PCR扩增DNA片段的方法,常规程序,PCR反应的程序： 温度（） 时间（分钟）(1) 95 3-5 (2) 95 0.5(3) 60 0.5(4) 72 1(5) 72 10,2530个循环,PCR反应的操作注意事项：1）加样操作必须在冰上进行；2）加样的顺序：（1）从大到小；（2）先加药品再酶：PCR反应结果异常及解决办法：1）无带；2）杂带多；3）DNA降解。,PCR中应注意的事项,防止污染试剂小量分装吸头及EP管一次性使用器皿及工作区域要分开，无菌操作 设立对照：阳性对照： 阳性模板阴性对照： 阴性模板试剂对照： 除模板外的所有组分,4.4 PCR技术应用4.4.1 PCR技术的主要类型,反向PCR 锚定PCR不对称PCR 原位PCRRT-PCR 重组PCR差异显示PCR免疫PCR实时定量PCR多重PCR,1)反向PCR (reverse PCR),方法：对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。用途：探索邻接已知DNA片段的未知序列；建立基因组步移文库。,已知序列,未知序列,未知序列,连接酶,2）不对称PCR (asymmetric PCR) 目的：扩增产生特异长度的单链DNA。 方法：采用两种不同浓度的引物，最佳比例一 般是0.010.5M。 用途：制备核酸序列测定的模板 制备杂交探针 基因组DNA结构功能的研究,高浓度引物,低浓度引物,3）RTPCR:方法：以反转录的cDNA作模板所进行的PCR反应,用途：测定基因表达的强度和鉴定已转录序列是否发生突变, 克隆mRNA的5和3末端序列,以及从非常少量的mRNA样品构建大容量的cDNA文库。,逆转录酶,聚合酶,mRNA,cDNA,杂化双链,PCR扩增,4）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上引物的PCR称，其结果是产生多个PCR产物，用于检测特定基因序列的存在或缺失。,电泳,引物,5）实时定量PCR技术,实时定量PCR（也称TaqMan PCR, FQ-PCR）是美国PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出来的一种新的核酸定量技术，该技术是在常规PCR基础上加入荧光标记探针来实现其定量功能的。,利用设计好的引物，将不同基因，或基因的不同区域连接起来。,6）融合PCR技术,引物（Primer）,基因A,基因B,4.4.2 PCR技术应用,研究基因克隆，分子检测，DNA测序，分析突变，分子进化诊断细菌、病毒、寄生虫检测，诊断法医犯罪现场标本分析医学临床医疗诊断、胎儿性别鉴定、癌症治疗的监控其他,第四节 DNA序列测定（DNA Sequencing）,一、DNA序列测定： 通过各种方法得知DNA一级结构各种碱基的排列顺序，是详细分析基因结构和功能的基础。二、双脱氧链终止法： 利用DNA聚合酶合成单链DNA模板互补链的性质进行测序。在dNTP中掺入一定比例的ddNTP，使延伸随机终止，并通过毛细管电泳分离各DNA片段。,ddNTP,经PAGE分离，描出来的DNA的片段,