欢迎来到三一办公! | 帮助中心 三一办公31ppt.com(应用文档模板下载平台)
三一办公
全部分类
  • 办公文档>
  • PPT模板>
  • 建筑/施工/环境>
  • 毕业设计>
  • 工程图纸>
  • 教育教学>
  • 素材源码>
  • 生活休闲>
  • 临时分类>
  • ImageVerifierCode 换一换
    首页 三一办公 > 资源分类 > PPT文档下载  

    第二章菌种选育课件.ppt

    • 资源ID:1869683       资源大小:7.46MB        全文页数:118页
    • 资源格式: PPT        下载积分:16金币
    快捷下载 游客一键下载
    会员登录下载
    三方登录下载: 微信开放平台登录 QQ登录  
    下载资源需要16金币
    邮箱/手机:
    温馨提示:
    用户名和密码都是您填写的邮箱或者手机号,方便查询和重复下载(系统自动生成)
    支付方式: 支付宝    微信支付   
    验证码:   换一换

    加入VIP免费专享
     
    账号:
    密码:
    验证码:   换一换
      忘记密码?
        
    友情提示
    2、PDF文件下载后,可能会被浏览器默认打开,此种情况可以点击浏览器菜单,保存网页到桌面,就可以正常下载了。
    3、本站不支持迅雷下载,请使用电脑自带的IE浏览器,或者360浏览器、谷歌浏览器下载即可。
    4、本站资源下载后的文档和图纸-无水印,预览文档经过压缩,下载后原文更清晰。
    5、试题试卷类文档,如果标题没有明确说明有答案则都视为没有答案,请知晓。

    第二章菌种选育课件.ppt

    第二章 菌种选育,主讲:李昌灵,放线菌(链霉素四环素;红霉素等),真菌(青霉素、头孢等),一些产芽孢的细菌,植物或动物来源,一、抗生素生产有关的微生物,抗生素是次级代谢产物,需要生物体进行复杂的代谢,目前发现的生物来源如下:,第一节 菌种的来源,二、氨基酸生产有关的微生物,代谢控制发酵:用人工诱变的方法,有意识地改变微生物的代谢途径,最大限度地积累产物,这种发酵形象地称为代谢控制发酵,最早在氨基酸发酵中得到成功应用。,50, 60年代以氨基酸发酵为代表的代谢控制发酵,是发酵工业发展历史上的一个转折点:,微生物(包括动、植物细胞)几乎可以生产我们所需的一切产品,但是涉及到工业化生产对于某一种特定的产品,只有特定的微生物才具有大量表达的潜力。,礼来(Eli lilly),花了10年的时间从40万株微生物中,发现了三种有潜力的新抗生素。,例:,已工业化产品生产菌的介绍,第二节 自然界中有目的微生物分离的原则,一、菌种分离的一般过程,土样的采取, 预处理, 培养, 菌落的选择, 产品的鉴定,如何使样品中所含微生物的可能性大,如何在后续的操作中使这种可能性实现,目的:高效地获取一株高产目的产物的微生物,问题:,自然界中有目的微生物分离的原则,二、采样时要注意的问题,气候、水分、空气,来源要广,结合产品的特点,标签:地点、时间、气候等,富集的三种方案:,定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件,进行培养。,三、目的微生物富集的一些基本方法,富集的目的:,让目的微生物在种群中占优势,使筛选变得可能。,当不可能采用定向培养时,则可设计在一个分 类学中考虑,,不能提供任何有助于筛选产生菌的信息,这 时只能通过随机分离的办法,定向培养的富集方法,1、底物,2、pH条件,3、培养时间,4、培养温度,等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段,培养(固体、液体;分批连续)后使目的微生物在种群中占优势。,四、菌落的选出,从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基,利用简单、快速的鉴定方法,如抗生素(P35),从形态的角度,菌落的外观形态,是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长,从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,实例:碱性纤维素酶产生菌的筛选(国家七五攻关项目),采样(造纸厂),80度30分钟处理,文献:产生菌为中性牙孢杆菌,嗜碱牙孢杆菌、放线菌及霉菌,0.0075%曲利本蓝1%CMC(羧甲基纤维素),pH10.5培养34天,选择有凹陷圈的菌落,从285个土样中获得62株,26株为组成型,36株为诱导型,例:醛肟水解酶的筛选,-Journal of biotechnology 94(2002), 65-72,培养基中含0.05% of Z-PAOx,每隔2-3天移去一半培养物,补充新鲜培养基,不断分析样品,2-3个月后Z-PAOx降低后,稀释分离条菌落,抗生素产生菌的筛选过程,(一)样品的采集土壤的营养:有机氮多-放线菌、细菌 有机氮少、酸性-真菌土壤深度: 放线菌和细菌-0-1m( 80%在0-10cm ) 真菌-0-0.3m未开垦过的土壤最佳南方地区土壤中的放线菌种类比北方多采样季节一春秋天为宜,三、微生物的分离,、放线菌,2.1 概念,在形态上具有分枝状菌丝、菌落形态与霉菌相似,以孢子进行繁殖。,“介于细菌与丝状真菌之间又接近细菌的一类丝状原核生物”,近代生物学技术,放线菌实际上是属于细菌范畴内的原核微生物,只不过其细胞形态为分枝状菌丝。,放线菌是具有菌丝、以孢子进行繁殖、革兰氏染色阳性的一类原核微生物,属于真细菌范畴。,2.2 形态与结构,单细胞,大多由分枝发达的菌丝组成;菌丝直径与杆菌类似,约1mm;细胞壁组成与细菌类似,革兰氏染色阳性(少数阴性);细胞的结构与细菌基本相同, 按形态和功能可分为营养、气生和孢子丝三种。,(1)营养菌丝,匍匐生长于培养基内,吸收营养,也称基内菌丝。一般无隔膜,直径0.2-0.8m,长度差别很大,有的可产生色素。,(2)气生菌丝,营养菌丝发育到一定阶段,伸向空间形成气生菌丝,叠生于营养菌丝上,可覆盖整个菌落表面。在光学显微镜下观察,颜色较深,直径较粗(1-1.4m),有的产色素。,(3)孢子丝,气生菌丝发育到一定阶段,其上可分化出形成孢子的菌丝,即孢子丝,又称产孢丝或繁殖菌丝。其形状和排列方式因种而异,常被作为对放线菌进行分类的依据。,(二)放线菌的分离1 样品分离前的处理除去或减少不需要微生物,增加所需要放线菌的数量。(1)化学方法 SDS-酵母浸膏处理样品,可以使细菌数量明显减少,HV平板上55%95%都是放线菌。风干的土壤与CaCO3混合后培养,放线菌的数量可以增加100倍。风干的土壤减少了细菌的数量; CaCO3有利于放线菌的生长,抑制了大多数真菌的生长。0.01M NaOH处理土壤,分离小单孢菌,1M NaOH处理土壤可以分离到诺卡氏菌和小单孢菌。其他试剂:1.4%酚、乙酸乙酯可以使细菌和真菌数量明显减少,有利于分离放线菌。,(2)物理方法温度:根据各种微生物耐热程度的不同,用高温处理样品,可以分离到不同种类的放线菌。离心:根据微生物大小对样品进行离心分离。如1600g离心20min,上清液中主要是放线菌孢子,沉淀中含有细菌和真菌孢子。膜过滤:用孔径为0.45m的滤膜可以浓缩水中的微生物,过滤后把滤膜贴在平板培养基上培养。这种方法用来分离水中的小单孢菌和高温放线菌。,2 分离方法(1)培养基 分离放线菌多采用合成培养基(精氨酸培养基、高氏一号培养基、察氏培养基)和有机培养基(如Waksman培养基和Bennett培养基)(2)抗生素的加入 培养基中加入抗真菌抗生素和抗细菌抗生素,可以抑制真菌和细菌的生长,对放线菌进行浓缩。,(3)分离放线菌的方法稀释法:无菌水稀释样品,然后涂布平板。喷土法:用喷土机或其他方法把风干碾细的土样直接喷在分离平板上。滤膜法:将0.22-0.45 m的滤膜放在分离培养基的平板上,接种培养,放线菌菌丝可以穿过滤膜长到培养基中,而细菌在滤膜表面生长,去掉滤膜,培养基中的放线菌菌丝继续培养长出菌落。(4)培养温度:一般25-30度,或者32-37度,培养7-14天;高温放线菌需要45-50度培养1-2天,海水中分离放线菌用20度培养6周左右。,产纤维素酶放线菌的分离与筛选,纤维素酶是一种复合酶,主要由外切-葡聚糖酶、内切-葡聚糖酶(又称CMCase)和-葡萄糖苷酶等组成,还有很高活力的木聚糖酶活力。,采集土样 朽木、烂稻草、烂稻草表层土、锯木、锯木表层土、落叶表层土。选择性培养基(改良查氏培养基):CMC-Na 15 g、NaNO3 2 g、NaCl 2 g、MgSO4 0.5 g、FeSO4 0.1 g、刚果红 0.2 g、琼脂20 g、蒸馏水 1000 mL、pH自然;,(三)其他微生物的分离1 真菌的分离 用PDA培养基、Martin培养基、察氏培养基等,pH5.5-6.5,24-28度培养5-14天,在培养基中加入抗细菌类抗生素抑制细菌的生长。2 细菌的分离 采用牛肉膏蛋白胨培养基等,pH7.2-7.6,温度28-37度培养1-7天,培养基中加入一定量的抗真菌抗生素抑制真菌的生长。,3 海洋微生物的分离 根据微生物在海洋中的生存环境设计分离方法、分离培养基和培养条件。一般海深100米内分离出链霉菌,1000米左右分离的大多数是小单孢菌,3000-5000米范围内没有分离出放线菌。4 极端微生物的分离 根据极端微生物的生长繁殖条件,如高温、低温、高盐、高碱、高压,来设计分离和培养条件。,产青蒿素内生菌的分离与筛选,目前使用青篙素进行治疗每个疗程的费用是8美元到10美元,对这些地区的贫困患者来说过于昂贵,主要瓶颈在于青篙的收获量不足。,采集青蒿植株,分别取根、茎和叶的小块,约0.15cm0.15cm大小,75%酒精漂洗(2030s)无菌水冲洗0.2%升汞漂洗(1020s)无菌水冲洗数次或直接取内层无污样,分置于PDA、牛肉膏蛋白胨和高氏一号脂培养基平板,2530下避光培养。培养520d,分别待平板上长出菌落,用划线、稀释以及直接用无菌小剪刀取尖端菌丝等分离方法,经过分离、筛选、纯化的反复过程,直至得到纯化的具有产抗疟疾药物青蒿素或其结构类似物的内生菌菌株。,四、抗生素的初筛发酵和抗菌活性的测定,(一)抗生素的初筛发酵培养基2 培养条件固体平板发酵:便于大量筛选抗生素产生菌液体振荡培养:溶氧较好,有利于放线菌的生长和抗生素合成。,(二)抗菌活性的测定 初筛发酵液样品有全发酵液、上清液和菌丝提取液3种用于测定抗菌活性。,抗菌活性的测定方法有以下三种:杯碟法或者纸片法:将发酵液样品加到鉴定平板上的小杯中,或将纸片浸入发酵液样品中,取出后放在鉴定平板上,37度培养1天,测量抑菌圈直径的大小。琼脂块法:将固体发酵平板上用打孔器打成的圆块转移到长好的试验菌的平板上,在37度培养1天,测量抑菌圈直径的大小。,平板划线法:先将放线菌在平板上划线培养,培养5天后再把试验菌在放线菌的两侧垂直划线,37度培养1天,观察放线菌两侧试验菌被抑制的长度。,五、抗生素的早期鉴别,1 纸层析和纸电泳:根据抗生素样品在纸上的迁移率,鉴别已知抗生素和发现新的抗生素。2 颜色反应:有的抗生素层析之后与显色剂反应,表现出特有的颜色反应。3 紫外吸收光谱:4 抗菌谱,六、抗细菌药物的筛选模型和方法,(一)以试验菌为对象的筛选方法(常规方法) 利用很多种微生物作为鉴定菌的琼脂扩散法是一种经典的筛选方法。目前主要筛选耐药细菌和厌氧菌。1 抗生素耐药突变株的使用2 超敏菌株的使用:用传统的琼脂扩散法直接检测发酵液中所存在的少量抗生素,获得新的抗生素的可能性较大3 利用厌氧菌作为试验株 双层琼脂平板法,拟杆菌属、梭杆菌属等厌氧菌,治疗厌氧致病菌。,(二)以作用机理为依据的筛选方法(定靶筛选)1 细菌细胞壁合成抑制剂的筛选 作用于细胞壁的抗生素对人体细胞没有毒害作用,有较好的选择性毒性。(1)观察细胞形态变异 细菌尤其是G+发生各种形态变化,例如细菌变长、部分突起、形成原生质球等,表明待测样品中含有抑制细胞壁合成的物质。(2)支原体模型 支原体没有细胞壁,所以对抑制细胞壁合成的抗生素不敏感。,(3)D-丙氨酸二肽合成抑制剂的筛选 当D-丙氨酸二肽的合成被待测样品抑制时,加入大量的D-丙氨酸或D-丙氨酸-D-丙氨酸可以使二肽合成反应继续进行,细菌继续生长繁殖,待测样品的抗菌活性被抵消,从而筛选出了环丝氨酸。,(4)羧肽酶抑制剂的筛选 -内酰胺类抗生素作用于细菌黏肽合成的最后步骤-交联反应。短肽交联是由转肽酶催化的,同时伴随有末端D-丙氨酸的释放。另外D-丙氨酸也可以在DD-羧肽酶的作用下去除,该酶的活性可以通过二乙酰基-L-赖氨酸-D-丙氨酸-D-丙氨酸作为底物,检测释放的D-丙氨酸来定量分析。,2 细菌蛋白质合成抑制剂的筛选 在各种真细菌细胞的蛋白质合成中,延伸因子Tu是必不可少,但是它与哺乳动物细胞中功能相似的因子显著不同,因而与延伸因子Tu结合的抗生素可以抑制许多细菌的生长。,4 细菌DNA回旋酶抑制剂的筛选 DNA回旋酶是细菌维持DNA超螺旋状态的一种特有的酶,可以将松弛DNA转变为负超螺旋DNA。回旋酶抑制剂的筛选方法:从E. coli中提取DNA回旋酶,将松弛DNA转变为负超螺旋DNA,用琼脂糖凝胶电泳进行检测,测定待测样品对回旋酶的抑制作用。,(三)以耐药机制为依据的筛选模型细菌的四种耐药机制细菌产生一种或多种水解酶或钝化酶,水解惑修饰进入细菌细胞内的抗生素,使之失去生物活性;抗生素的作用靶点由于发生突变或者被细菌的某种酶修饰而使抗生素无法发挥作用,或者亲和力下降;细菌细胞膜的透性或者其他性质发生改变; 细菌有一种依赖能量的主动转运机制,能够把进入细胞的抗生素排出体外。,1 -内酰胺酶抑制剂的筛选-内酰胺酶(青霉素酶和头孢菌素酶)水解-内酰胺抗生素,比如青霉素和头孢菌素,打开-内酰胺键,使抗生素丧失抗菌活性。,(1)耐药菌株平板法 用产生青霉素酶菌株的发酵液与待测样品(如放线菌发酵液)混合,加入一定量的青霉素,不含待测样品的平板作为对照,用纸片法测定发应混合物中残留的青霉素来检测酶抑制剂的活性。(2)通过颜色反应来检测-内酰胺酶抑制剂 利用产色的头孢菌素nitrocefin的独特性质来寻找-内酰胺酶抑制剂。 在-内酰胺酶的作用下, -内酰胺环的酰胺键被打开,由黄色变成红色,因而从颜色的变化可以判断样品中是否含有酶抑制剂。,2 氨基环醇类抗生素钝化酶抑制剂的筛选由三种不同类型的钝化酶:氨基环醇类抗生素磷酸化酶(APH)将抗生素进行磷酸化,使其失去活性氨基环醇类抗生素乙酰转移酶(AAC)将乙酰辅酶A的乙酰基转移到抗生素的氨基上,使其失去活性氨基环醇类抗生素核苷转移酶(AAD)将ATP的核苷转移到抗生素的羟基上,使其失去活性,3 氯霉素乙酰转移酶抑制剂的筛选 细菌耐氯霉素是因为耐药菌产生氯霉素乙酰转移酶,使得氯霉素分子上羟基乙酰化。方法:样品+氯霉素乙酰转移酶混合反应 加入氯霉素混合反应用枯草杆菌测定氯霉素的残留活性。以没有样品抑制剂作为对照。,一、用试验菌直接筛选酵母类:白色假丝酵母、普通假丝酵母、啤酒酵母等丝状真菌类:产黄青霉、黑曲霉、烟曲霉、米曲霉等,七、抗真菌抗生素的筛选模型,二、作用于真菌细胞壁抗生素的筛选真菌和动物细胞的区别: 细胞壁及其成分:几丁质、-1,3-葡聚糖和甘露聚糖1 观察真菌细胞的形态变异:假原生质球2真菌细胞壁多糖合成酶抑制剂的筛选-1,3-葡聚糖合成酶抑制剂方法: -1,3-葡聚糖合成酶、待测样品、UDP-14C-葡萄糖,缓冲液中反应后用纸层析法和放射性同位素测定样品抑制剂的作用。,甘露聚糖合成酶抑制剂方法:甘露聚糖合成酶、待测样品、GDP-14C-甘露糖,缓冲液中反应后用纸层析法和放射性同位素测定样品抑制剂的作用。几丁质合成酶抑制剂方法:几丁质合成酶、待测样品、UDP-14C-N-乙酰葡萄糖胺,缓冲液中反应后用纸层析法和放射性同位素测定样品抑制剂的作用。,一、微生物的特性,有些微生物能在厌氧的条件下生长,有些微生物能够利用简单的有机物和无机物满足自身的生长,有些微生物能进行复杂的代谢,有些微生物能利用较复杂的化合物,有些微生物能在极端的环境下生长,第三节 菌株选育、分子改造,二:工业化菌种的要求,能够利用廉价的原料,简单的培养基,大量高效地合成产物,有关合成产物的途径尽可能地简单,或者说菌种改造的可操作性要强,遗传性能要相对稳定,不易感染它种微生物或噬菌体,产生菌及其产物的毒性必须考虑(在分类学上最好与致病菌无关),生产特性要符合工艺要求,菌株改良的作用:自然界筛选到的菌株,合成抗生素的能力很低,如果不进行菌种改良,则没有进行工业生产的价值。生产上正在用的菌株,为了不断提高提高产量、降低成本,也需要不断进行菌株改良。改变菌种的某些遗传特性,使之适合于工业生产,例如选育抗噬菌体的菌株、能利用廉价原料或需要氧气少的菌株、不分泌色素的菌株便于后提取中产品的质量。,生物进化过程中微生物形成完善的代谢调节机制,不会有代谢产物的积累,解除或突破微生物的代谢调节控制,目的产物积累,微生物育种的目的,方法:突变、体内重组、体外重组(基因工程),工业微生物育种,菌株选育、分子改造目的,提高生产能力,提高产品质量,开发新产品,解决生产实际问题,防止菌种退化,发酵工业的发展的决定因素:,工艺的改进设备的改进优良菌种的获得(关键),基因突变:,自然选育、诱变育种,基因重组:,杂交、原生质体融合、基因工程,基因的直接进化:,点突变、易错PCR、同序法DNA Shuffling等,菌株选育、分子改造的方法:,一、自然选育(Nature breeding)自然选育:是指微生物细胞群体不通过人工处理而利用菌种的自发突变进行的育种方法。但是微生物自发突变的几率10-8-10-9,正突变的几率更低,所以这种方法虽然可能筛选到一些生产能力高的菌株,但效率低、进展慢,效果不明显。二、诱变育种(Mutation breeding)诱变育种:用不同的诱变剂处理微生物群体,以诱发各种遗传物质的改变,然后采用简便、快速和高效的筛选方法从中选出所需要的突变株。 这种方法在工业微生物育种中用的最早、也很有效,是目前育种的常用方法。,用各种物理、化学的因素人工诱发基因突变进行的筛选,称为诱变育种,诱变剂:能够提高生物体突变频率的物质称为诱变剂,诱变剂,物理:紫外,快中子、X射线等,化学:硫酸二乙酯,亚硝基胍等,(二)、诱变剂处理过程中几个有关的问题,化学诱变剂使用过程的安全性,诱变剂量的选择,诱变剂的选择,出发菌株的选择,(一)、诱变剂的作用原理(略),亚硝酸:0.07MNa2HPO4亚硝基胍:1MNaOH,(三)诱变育种的一般步骤 (p38),(四)筛选的方法,随机筛选,形态,理性化筛选,从产物形成的生理生化途径着手,进行有的放矢的筛选。如结构类似物抗性、营养缺陷型等,筛选而产生的这些特性,称为遗传标记。,结构类似物:在化学和空间结构上和代谢的中间物(终产物)相似,因而在代谢调节方面可以代替代谢中间物(终产物)的功能,但细胞不能以其作为自身的营养物质。,突变菌株的筛选,待菌落代谢产物活性最高或者菌落长到合适大小时,转移到指示菌平板上,根据抑菌圈大小挑选高产菌株进行摇瓶发酵复筛。,1、高产突变株的筛选,HD:高丝氨酸脱氢酶,黄色短杆菌中赖氨酸的合成调节机制,HT:高丝氨酸转乙酰酶,AK:天冬氨酸激酶,结构类似物抗性:Lys的类似物AEC、Thr的类似物AHV,营养缺陷型:如Thr缺陷型,黄色短杆菌F9-50的诱变谱系,Bervibacterium flavum As 1.495 (leu-) lys.HCl 2.1 g/l,F6-16 (leu -, Thr - ) 20.8 g/l,F9-50 (leu -, Thr -, AEC r) 33.5 g/l,一个基因内部遗传结构或DNA序列的任何改变,基因突变:,基因突变是重要的生物学现象,它是一切生物变化的根源,连同基因转移、重组一起提供了推动生物进化的遗传多变性。,基因突变,DNA损伤修复机制,突变,自发突变,诱变,环境因素的影响,DNA复制过程的偶然错误等而导致,一般频率较低,通常为10-8-10-9 。,某些物理、化学因素对生物体的DNA进行直接作用,突变以较高的频率产生。,前突可以通过DNA复制而成为真正的突变,也可以重新变为原来的结构,这取决于修复作用和其它多种因素。,基因突变,诱发因素主要可以分为:细胞外因素、细胞内因素和DNA分子内部因素三个层次。,细胞外的诱发因素,自然环境或人工条件下的物理和化学因素,物理:自然或人造的紫外线、射线、X射线、快中子、激光以及加热等都能成为基因突变的物理因素。 化学:自然人造的化学诱变因素有低剂量的金属离子、高分子化合物、生物碱药物、染料及微生物产生的H2O2、碱基类似物、烷化剂及亚硝酸盐等。,诱发因素,细胞内的诱发因素,生物体细胞的代谢活动会产生一些诱变物质,如过氧化氢、咖啡碱和重氮丝氨酸等,它们是引起自发突变的内源诱变剂。 在许多微生物的陈旧培养物中易出现自发突变株,可能就是这类原因。,DNA分子内部因素,DNA分子中的碱基存在着互变异构效应,2.3常见的微生物突变类型,2.3.1 营养缺陷型(auxotroph),一种缺乏合成其生存所必须的营养物(包括氨基酸、维生素、碱基等)的突变型,只有从周围环境或培养基中获得这些营养或其前体物(precursor)才能生长。,营养缺陷型是微生物遗传学研究中重要的选择标记和育种的重要手段,表型判断的标准:,在基本培养基上能否生长,表型,基因型,营养缺陷型(auxotroph),影印平板(Replica plating)法是Lederberg夫妇在1952年建立,在选择培养基(一般为基本培养基)上不生长,负选择标记,突变株不能通过选择平板直接获得,营养缺陷型(auxotroph)特点:,营养缺陷型的表示方法:,表现型:,所需营养物的前三个英文小写斜体字母表示:hisC(组氨酸缺陷型,其中的大写字母C同一表型中不同基因的突变),基因型:,同上,但第一个字母大写,且不用斜体:HisC,在具体使用时多用hisC-和hisC+,分别表示缺陷型和野生型。,2.3.2抗药性突变型(resistant mutant),基因突变使菌株对某种或某几种药物,特别是抗生素,产生抗性。,特点:,正选择标记(突变株可直接从抗性平板上获得-在加有相应抗生素的平板上,只有抗性突变能生长。所以很容易分离得到。),表示方法:,所抗药物的前三个小写斜体英文字母加上“r”表示strr 和 strs 分别表示对链霉素的抗性和敏感性,2.3.2条件致死突变型(conditional lethal mutant),在某一条件下具有致死效应,而在另一条件下没有致死效应的突变型。,常用的条件致死突变是温度敏感突变,用ts(temperaturesensitive)表示,这类突变在高温下(如42)是致死的,但可以在低温(如25-30)下得到这种突变。,特点:,负选择标记,这类突变型常被用来分离生长繁殖必需的突变基因,2.3.4形态突变型(morphological mutant),造成形态改变的突变型,特点:,非选择性突变突变株和野生型菌株均可生长,但可从形态特征上进行区分。,举例:,产蛋白酶缺陷突变株的筛选,菌落颜色变化,半乳糖苷酶基因的插入失活,使重组子菌落为白色而与兰色的非重组子分开。,形成芽孢缺陷菌株,细胞水平上的形态突变,突变株的检出更加困难。,2.3.5其它突变类型,毒力、生产某种代谢产物的发酵能力的变化等在实际应用中具有重要意义突变类型一般都不具有很明显或可直接检测到的表型。其突变株的获得往往需要较大的工作量。,2.3.5其它突变类型,毒力、生产某种代谢产物的发酵能力的变化等在实际应用中具有重要意义突变类型一般都不具有很明显或可直接检测到的表型。其突变株的获得往往需要较大的工作量。,2、形态突变株的筛选利用形态突变进行筛选在青霉素、制霉菌素、四环素的育种中取得了良好的效果。别洛霉素产生菌球团链霉菌用吖啶橙诱变后出现无黑素和不产孢子的菌株,其中有的产量提高200倍。 一般形态剧烈变化的突变株多数是低产量菌株,高产突变株一般形态变化细微。,3、自身耐药性突变株的筛选抗生素产生菌对自身所产的抗生素的抗性越强,那么这种抗生素的产量越高,是由于突变株消除了抗生素的反馈调节。,在培养基中加入抗生素的结构类似物也可以进行筛选抗生素产生菌的筛选,机制同上。,4、营养缺陷型及回复突变株的筛选抗生素产生菌的营养缺陷型大多数低产,个别是高产菌。如头孢菌素产生菌的亮氨酸缺陷型,生产头孢菌素C能力提高3倍。5、鉴别培养基有些抗生素如蒽环类、大环内酯类、四环素类及安莎类等的生物合成皆是通过聚酮体途径。浅蓝菌素对聚酮体合成有明显的抑制作用。在蒽环类抗生素柔毛霉素的育种中,在含有适当浓度浅蓝菌素的平板上,培养后长出的菌落绝大多数因抗生素的合成被抑制而为无色,只有少数能合成抗生素的菌落为红色,其中高产变株的频率有明显的提高。,三、杂交育种 杂交育种:将两个基因型不同的的菌株的某些遗传信息通过杂交重新组合于同一个重组体中,从中分离和筛选出具有新性状的菌株。1、准性生殖:获得了青霉素产生菌产黄青霉的高产重组体菌株。2、原生质体融合:,在自然环境中,真核微生物就存在有性生殖和准性生殖等基因重组的形式。,酵母菌有性杂交,霉菌的准性杂交,3.1 真核生物的基因重组,3.2.1 酵母菌的有性杂交,酵母菌的生活史既包括二倍体、单倍体世代,又包括有性和无性世代。,二倍体,单倍体,减数分裂形成子囊孢子,每个子囊中含有四个单倍体的子囊孢子,酿酒酵母的双倍体和单倍体细胞比较,酿酒酵母,两种接合型和a (单倍体),融合,二倍体细胞(/a),酿酒酵母接合型是由自身的遗传特性决定的,受MAT活性区调控,由MAT启动子控制,基因插入该座位,那么细胞就是接合型,a基因插入则是a型,和a基因是不表达的沉默基因,只在发生接合型(单倍体)转变时用作或a基因插入的来源,3.2霉菌的生殖,霉菌的基因重组一般也可以通过有性生殖或准性生殖过程完成,准性生殖是指不经过减数分裂就能导致基因重组的生殖过程,异核体的形成、二倍体的形成以及体细胞交换和单倍体化,霉菌的有性生殖,有性孢子繁殖,两个性细胞结合产生新个体的过程,a)质配:两个性细胞结合,细胞质融合,成为双核细胞,每个核均含单倍染色体(n+n)。,b)核配:两个核融合,成为二倍体接合子核,此时核的染色体数是二倍(2n)。,c)减数分裂:具有双倍体的细胞核经过减数分裂,核中的染色体数目又恢复到单倍体状态。,接合孢子,孢囊孢子,霉菌的准性生殖,菌丝联结,形态上无区别、遗传特性有差别的体细胞之间,细胞核由一根菌丝进入另一根菌丝形成含两种或两种以上基因型的异核菌丝,异核体,核融合,杂合双倍体,有丝分裂过程中染色体之间的交换,体细胞交换及单倍体化,准性生殖与有性生殖的比较,四、基因工程在抗生素生产中的应用 构建工程菌:,三、基因的直接进化(directed evolution),突变 基因突变库的建立 筛选 基因突变库的筛选 基因复制与遗传,步骤:,在分子水平上,对目标基因直接处理,然后通过高通量的筛选方法,提高目标蛋白的性能。,工程菌不稳定的表现,工程菌不稳定的表现,质粒不稳定,表达产物不稳定,质粒丢失,重组质粒发生DNA片段脱落,提高工程菌稳定性的方法,组建合适载体,选择适当宿主,施加选择压力,主要应用:,酶学性能的提高:,pH,温度,有机溶剂,生理环境工业催化环境,底物专一性,定点突变,错位PCR,DNA Shuffling:指DNA分子的体外重排,是基因在分子水平上进行有性重组(Sexual Recombination)。,X XXX,X XX X,XX X,XXX X,XX X,X XXX,XX X,X XX X,XXX X,X XXX,XX X,X XX X,XXX X,XX X,XX X,XX XXX X X X X X XX X,Fragment Reassemble Select bestwith DNAseI fragments recombinants,Repeat for multiple cycles,DNA shuffling,部分DNA Shuffling技术的研究成果,(一)提高微生物药物的单位产量1、增加限速酶基因拷贝数提高菌种生产能力通常认为在抗生素生物合成中,某些限速酶对整个生物合成是至关重要的。限速酶在生物合成途径中起“瓶颈” 的作用,限制了终产物的产量。如果通过增加该酶基因的剂量,即可能解除或缓解此“瓶颈”效应。,二、基因工程在抗生素生产中的应用,2、引人抗性基因,增加微生物药物单位产量许多抗生素生物合成基因往往与菌种对自身抗生素耐药基因连锁存在,因此,利用高拷贝质粒的基因量效应,提高菌种对自身抗生素的抗性,增加与抗生素生物合成有关的自身抗性基因的剂量,也是提高其单位产量的途径之一。2、引人抗性基因,增加微生物药物单位产量许多抗生素生物合成基因往往与菌种对自身抗生素耐药基因连锁存在,因此,利用高拷贝质粒的基因量效应,提高菌种对自身抗生素的抗性,增加与抗生素生物合成有关的自身抗性基因的剂量,也是提高其单位产量的途径之一。,4、,(二)阻断支路代谢,增加有效组分的含量阿弗米丁是十六元大环的齐墩果二糖衍生物,具有广谱、高效抗寄生虫活性,其产生菌除虫链霉菌发酵过程中产生两类化合物,一类是一组结构非常类似的非典型的大环内酯类抗生素,其中B1组分活性最强,是人们所期有效药物。另一类是一种结构差别较大的大环内酯类抗生素寡霉素,必须从产品中除去。将传统的诱变育种技术、原生质体融合技术和基因工程技术相结合,获得了只产B1不产寡霉素的工程菌。(三)构建能产生半合成抗生素中间体的基因工程菌许多半合成抗生素的中间体是由一些天然产物通过复杂的化学反应修饰而成。通过将茄病镰刀霉的D-氨基酸氧化酶基因和缺陷假单孢菌的CPC酰化基因导入顶头孢霉,可以获得头孢菌素生物合成的中间体。,(四)构建产生新化合物的基因工程菌 由于许多微生物次级代谢产物酶系的底物特异性不强,当某种抗生素的生物合成基因克隆至另一结构相似、生物合成途径有关的抗生素产生菌中,可使其产生不同于二亲株产物的具有生物活性的新化合物,即所谓“杂合抗生素”。例如,将放线紫红素的生物合成基因导人紫红链霉菌,产生了新化合物二氢榴菌紫红素。,(五)引入血红蛋白基因,改善微生物的工业性状 血红蛋白能促进氧气扩散到细胞末端氧化酶上,使该细胞在贫氧状态下也能很好生长。 Maynolo等将血红蛋白基因转入变青链霉菌和天蓝色链霉菌中,获得了发酵需氧量明显降低的工程菌。在限氧条件下不仅使菌体生长量增加,还使天蓝色链霉菌产生的放线紫红素产量提高10倍。,5.1 菌种的衰退与复壮的概念(1)衰退(degeneration):菌种在培养或保藏过程中,由于自发突变的存在,出现某些原有优良生产性状的劣化、遗传标记的丢失等现象,称为菌种的衰退。衰退的原因:基因突变,分离现象。常见的衰退现象:菌落和细胞形态的改变; 生长速度缓慢,产孢子越来越少; 抵抗力、抗不良环境能力减弱等。代谢产物生产能力或其对宿主寄生能力下降;,5 菌种的衰退、复壮及保藏,(2) 菌种的复壮(rejuvenation):使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下,通过纯种分离和生产性能测定等方法,从衰退的群体中找出未衰退的个体,以达到恢复该菌原有典型性状的措施;广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作,以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变(正变)不断地从生产中选种菌种的复壮措施:纯种分离:(平板划线法、涂布法、倾注法、单细胞挑取法等)。 通过寄主体内生长进行复壮(如Bacillus thuringiensis的复壮) ; 淘汰已衰退的个体(采用比较激烈的理化条件进行处理,以杀死生命力较差的已衰退个体)。采用有效的菌种保藏方法。,(3)防止菌种衰退的方法: 控制传代次数(一般在DNA的复制过程中,碱基的错配率是5x10-4,自发突变的频率为10-8-10-9,采用良好的菌种保藏方法,可以减少移种和传代的数); 选择合适的培养条件; 采用不同类型的细胞进行传代(对丝状微生物而言,通常采用稳定的单核孢子进行接种); 采用有效的菌种保藏方法。,5.2、菌种保藏:(1) 目的:存活,不丢失,不污染 防止优良性状丧失 随时为生产、科研提供优良菌种(2) 原理:选用优良的纯种,(最好是休眠体,如分生孢子、芽胞等),创造降低微生物代谢活动强度,生长繁殖受抑制,难以发生突变的环境条件。(其环境要素是干燥、低温、缺氧、缺营养 以及添加保护剂等),菌 连续在培养基上(内)移种 种 生活态 传代培养保藏法 连续在活宿主上(内)移种 保 固体斜面 藏 湿法 半固体琼脂柱 方 休眠态 液体介质(蒸馏水、糖液、其它溶液) 法 干法 藏在玻璃管内 吸附在合适的载体上,(3)菌种保藏的方法,低温保藏法方法:菌种管置4冰箱保藏,定时传代 原理:低温下,微生物代谢强度明显下降 。石蜡油低温保藏法:橡皮塞取代棉塞、加石蜡油。,干燥保藏法将菌种置于土壤、细纱、滤纸、硅胶等干燥材料上保藏。如砂土管法,适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏,保藏时间几至几十年。,真空冷冻干燥法加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥。适用于各种微生物,便于大量保藏,菌种存活时间长,是目前最好的保藏方法。液氮超低温保藏法将菌种置于保护剂中,预冻后保存在液氮超低温冰箱中( -196)。适用于各种微生物的较理想的保藏方法。,菌种保藏机构的任务:广泛收集科研和生产菌种、菌株,并加以妥善保管,使之达到不死、不衰、不乱以及便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏机构: 中国微生物菌种保藏委员会(CCCCM) 美国的典型菌种保藏中心(ATCC) 英国国家典型菌种保藏所(NCTC) 法国里昂巴斯德研究所(IPL),国内外菌种保藏机构:,干法保藏菌种的方法,滴入小试管(在放入大试管干燥器中)藏在玻璃管内 封入安培瓶 菌液直接真空干燥法(L-干燥法) 冷冻真空干燥法 细粒状载体(土壤、沙粒、土壤+沙粒) 球块状载体(硅胶、瓷球)合适的载体 有机基质(曲料、麦粒) 滤纸片 薄片状载体 明胶小片(滴在蜡纸板上干燥而成) 血清蛋白小片(乙烯薄膜 ),几种常用菌种保藏方法的比较,

    注意事项

    本文(第二章菌种选育课件.ppt)为本站会员(牧羊曲112)主动上传,三一办公仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对上载内容本身不做任何修改或编辑。 若此文所含内容侵犯了您的版权或隐私,请立即通知三一办公(点击联系客服),我们立即给予删除!

    温馨提示:如果因为网速或其他原因下载失败请重新下载,重复下载不扣分。




    备案号:宁ICP备20000045号-2

    经营许可证:宁B2-20210002

    宁公网安备 64010402000987号

    三一办公
    收起
    展开