遗传毒理学——DNA损伤与修复课件.ppt

DNA损伤与修复DNA Damage and Repair,张洁Ph.D, M.D, Lecturer卫生毒理教研室Department of Toxicology苏州大学医学部放射医学与公共卫生学院Radiation Medicine & Public Health Medical College, Soochow UniversityZhangjie_,第一节 DNA的突变和损伤,1.1 突变的概念1.2 突变的类型1.3 突变的原因1.4 突变的后果,1.1 DNA突变的概念,突变：发生在DNA分子上可遗传的永久性结构变化通常称为突变。突变体：带有一个特定突变的基因、基因组、细胞或个体。,生命和生物多样性依赖于突变与突变修复之间的良好平衡。,1.2 突变的类型,1、点突变：DNA分子中一个碱基对替换另一个碱基对，也称碱基对的置换（substitution）。 转换(Transition)： 最普通的一种点突变，嘧啶 嘧啶，嘌呤 嘌呤。 A G T C 颠换(Transversion)： 另一种不常见的点突变，嘌呤 嘧啶。,AT,TA,CG,碱基替换导致mRNA中密码子的改变，多肽链中氨基酸发生影响，可能出现几种不同的效应：同义突变（synonymous mutation）:由于密码子具有兼并性，单个碱基置换后密码子所编码的是同一种氨基酸，表型不改变。 正常 同义突变,AGT CAG CAG CAG TTT TTA CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro,AGT CAG CAG CAG TTT TTG CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro,错义突变（Missense mutation）:DNA分子中的碱基置换后，形成新的密码子，从而导致所编码的氨基酸发生改变，产生活性降低、无活性或无功能的蛋白质。 正常 错义突变,AGT CAG CAG CAG TTT TTA CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro,AGT CAG CAG CAG TTT TCA CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Phe Ser Arg Asn Pro,无义突变（Nonsense mutation）:DNA分子中的碱基置换后，使编码一个氨基酸的密码子变为不编码任何氨基酸的终止密码子（UAA、UAG、UGA），肽链合成提前终止，产生短的、没有活性的多肽片段。 正常 无义突变,AGT CAG CAG CAG TTT TTA CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro,AGT CAG CAG CAG TTT TGA CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Phe 终止 Arg Asn Pro,终止密码突变（Termination codon mutation）:当DNA分子中的一个终止密码发生突变，使多肽链的合成继续进行下去，一直延长至下一个终止密码子时停止，产生延长的异常多肽链，称延长突变（elongation M）。回复突变：突变体经过第二次突变又完全的或部分的恢复为原来的基因型和表现型。 完全恢复是由于碱基顺序经过第二次突变后又变为原来的碱基顺序，故亦称真正的回复突变； 部分恢复是由于第二次突变发生在另一部位上，其结果是部分恢复原来的表现型，亦称为第二位点突变（second site mutation）或基因内校正（intragenic suppression）。,抑制基因突变（Suppressor gene mutation）：基因内部不同位置上的不同碱基发生了两次突变，其中一次抑制了另一次突变的遗传效应。 例：血红蛋白病单纯6 谷氨酸 缬氨酸 血红蛋白病，致死同时6 谷氨酸 缬氨酸 + 73 天冬氨酸 天冬酰胺 Hb Harlem，临床症状较轻，原因是73突变抑制了6的突变效应。,2、插入和缺失移码突变（frameshift mutation）：DNA编码序列中插入（增加）或缺失一个或几个碱基，其下游阅读框发生改变，导致氨基酸顺序及蛋白质异常或无活性，称为移码突变。 -插入突变：DNA分子中插入一个或几个碱基对。 -缺失突变：DNA分子中缺失一个或多个碱基对。 半胱 丝氨 谷氨 缬氨 半胱 精氨 赖氨 亮氨DNA TGC TCG CAA GTT GA TGC CGC AAG TTG 插入或缺失会造成其下游三联密码子错读，生成完全不同的肽链。,改变,读码框,缺失T,整码突变（Codon mutation）：DNA链的密码之间插入或缺失一个或几个密码子，导致肽链增加了或减少了一个或几个氨基酸，称为整码突变或称密码子插入或缺失。 如： AAG GAC CCG GCG -正常密码子顺序 AAG GAC AAA CCG GCG -插入 AAG GAC GCG -缺失,举例,-T-C-G-A-G-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-C-G-A-C-A-T-G-C-,插入,野生型基因,-T-C-G-A-C-T-G-T-A-C-G- -A-G-C-T-G-A-C-A-T-G-C-,碱基对的置换(substitution),移码突变(framesshift mutation),转换,颠换,插入,缺失,3、动态突变动态突变：邻近基因或位于基因序列中的单核苷酸重复拷贝数，在一代代传递过程中会发生明显的增加，如(CGG)n、(CAG)n等，从而导致某些遗传疾病的发病。该突变可遗传并产生表型效应引起疾病，多为神经系统疾病。代表疾病：Hutington舞蹈病(CAG)n、强制性肌营养不良，脆性X综合症(CCG)n。,动态突变正常动态突变（CAG三核苷酸重复）,AGT CAG CAG CAG TTT TTA CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro AAs,AGT CAG CAG CAG CAG CAG CAG CAG TTT TTA CGT AAC CCG DNA Met Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Phe Leu Arg Asn Pro AAs,正常人：n=650 多态受累个体：n50 copies 多者几百几千copies随着世代传递长度增加，发病年龄提前，病情加重。,1.3 突变的原因,两个概念：自发突变（spontaneous mutation)：由于正常的细胞活动，或细胞与环境的随机相互作用，这些过程所引起的生物DNA序列的改变。诱发突变（induced mutation): 特定的化学或物理因素引起的DNA序列改变。,Note: 所有突变都包含DNA序列的改变,1.3.1 DNA分子的自发性损伤,1、DNA复制中的错误 以DNA为模板按碱基配对进行DNA复制是一个严格而精确的事件，但也不是完全不发生错误的。正常情况下，大肠杆菌复制过程中的错配率为1010左右。,2、DNA的自发性变化 生物体内DNA分子可以由于各种原因发生变化，至少有： 碱基的异构互变：例如，腺嘌呤（A）的互变异构体（A）可以与胞嘧啶（C）配对，模板链上存在这些异构体的时候，子代链上就可能发生错误，形成损伤。 脱嘌呤与脱嘧啶，使脱氧核糖和碱基G（A）或T（C）连接的糖苷键被打断，从而失去G、A或T、C。 碱基的脱氨基作用：如C脱氨基后形成了U，在复制过程中将与A配对，从而引起GC AT转换突变。 G A A C U T,突变,脱氨基,复制,3、转座子的插入转座子 (transposon 或 transposable element)是基因组内相对独立的、可移动序列，它们不必借用噬菌体或质粒的形式就可以从基因组的一个部位直接转移到另一个部位，这个过程称为转座（transposition）。转座子每次移动时携带着转座必需的基因一起在基因组内跃迁，所以转座子又称跳跃基因（jumping gene）。,转座子特点转座以很低的频率发生，而且转座子的插入是随机的。转座子有时插入到一个结构基因或基因调节序列内，引起基因表达的改变。转座子也可以引起基因组序列的重排，它们的移动也和进化有关。现在认为转座子存在于地球上所有的生物。,1.3.2 物理因素引起的DNA损伤,1、紫外线引起的DNA损伤当DNA受到最易被其吸收波长（260 nm）的紫外线照射时，主要是使同一条DNA链上相邻的嘧啶以共价键连成嘧啶二聚体。 2、电离辐射引起的DNA损伤电离辐射损伤DNA有直接效应和间接效应两种途径，直接效应是DNA直接吸收射线能量而遭损伤；间接效应是指DNA周围其他分子（主要是水分子）吸收射线能量产生具有很高反应活性的自由基进而损伤DNA。损伤包括： 碱基变化; 脱氧核糖变化; DNA链断裂; 交联。,1.3.3 化学因素引起的DNA损伤,1、烷化剂对DNA的损伤如甲基磺酸乙酯EMS，烷化剂能在DNA上的四个碱基发生作用，使其增加烷基侧链，其最大的特异性是在鸟嘌呤的6位氧上增加一个烷基侧链导致与T错配，从而在下个复制周期中产生GC AT转换。,2、羟胺HA：NH2OH也是一种特定诱发GC AT转换的诱变剂。能在胞嘧啶4位上的氨基氮上发生羟基化作用，产生N4羟基胞嘧啶，它能像T那样与A配对，产生GC AT转换。,3、亚硝酸盐能使胞嘧啶（C）脱氨变成尿嘧啶（U），经过复制就可使DNA上的G-C变成A-T对，诱发GC AT；亚硝酸盐还能诱发腺嘌呤（A）脱氨基形成次黄嘌呤H，H能和C配对，诱发AT GC转换突变。,亚硝酸盐可诱发两个方向上的转换。,4、碱基类似物、修饰剂对DNA的损伤 如:人工可以合成一些碱基类似物用作促突变剂或抗癌药物，如5-溴尿嘧啶（5-BU）、5-氟尿嘧啶（5-FU）、2-氨基腺嘌呤（2-AP）等。,胸腺嘧啶类似物5溴尿嘧啶（5-BU），由于胸腺嘧啶中5CH3被Br取代会导致5BU变换异构体，使其碱基的配对能力发生变化。,酮式,烯醇式,酮式,腺嘌呤,烯醇式,鸟嘌呤,转换突变 ATGC A A G G T 5-BUT 5-BUC CGCAT G G A A C 5-BUC 5-BUT T,掺入,异构体,复制,突变,掺入,异构体,复制,突变,1.4 突变的后果,根据基因突变对机体的影响，有以下几种情况：中性突变：变异后果轻微，对机体效应不明显。造成个体间的生物化学组成的遗传学差异，一般对机体无影响；如：ABO血型，HLA，同功酶等。有利于个体生存生育；如Hbs突变基因杂合子比正常纯合子对抗疟疾。产生遗传易感性；如：肿瘤易感性。引起遗传病。每个健康人均由5-6个有害突变。致死突变：造成死胎、自然流产、生后夭折。,第二节 DNA损伤的修复机制,为了保证遗传信息的高度稳定性，生物细胞在进化过程中形成了一系列多步骤的修复机制。 目前对DNA损伤和修复的研究还不多，仅限于辐射生物反应方面。,2.1 DNA直接修复2.2 错配修复2.3 切除修复 碱基切除修复(base excision repair, BER) 核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)2.4 SOS反应诱导的修复2.5 重组修复,2.1 直接（回复）修复（direct repair）,生物体内存在多种DNA损伤以后而并不需要切除碱基或核苷酸的机制，这种修复方式称为DNA的直接修复。直接修复即简单地把损伤的碱基回复到原来状态的修复，可分为以下几种：1. O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶直接修复 通过从O6-甲基鸟嘌呤上把甲基直接转移到酶的半胱氨酸残基上来直接回复DNA的损伤。,酶,DNA甲基转移酶,O6-甲基转移酶使O6-甲基化鸟嘌呤恢复成鸟嘌呤,2. 光解酶复活（photoreactivation） 光裂合酶（photolyase）酶学光复活过程是修复UV导致的环丁烷嘧啶二聚体的直接机制，这种修复具有高度的专一性。3. 单链断裂修复DNA单链断裂是损伤的一种常见形式，可以通过DNA连接酶的重接而修复。,光复活作用,环丁烷嘧啶二聚体,Light,UV引起的光损伤嘧啶二聚体能被光裂合酶修复，该酶能在暗处和嘧啶二聚体结合，形成酶和DNA复合体，在光照条件下，复合体分解，使嘧啶二聚体分解为原先正常的碱基。,2.2 错配修复（Mismatch repair),大肠杆菌中的DNA腺嘌呤甲基化（DAM）修复途径 原核细胞内存在Dam甲基化酶，能使位于5GATC序列中腺苷酸甲基化。 复制后DNA在短期内（数分钟）为半甲基化的GATC序列，一旦发现错配碱基，即将未甲基化链切除一段包含错误碱基的序列，并以甲基化的链为模板进行修复。,参与错配修复的酶与蛋白质,Dam甲基化酶；MutH、MutL、MutS多肽；解螺旋酶；DNA聚合酶；外切酶、；RecJ核酸酶DNA连接酶；SSB,DNA甲基化酶,2.3 切除修复（暗复活）,1. 碱基切除修复（base excise repair，BER）BER可以去除因脱氨基或碱基丢失，无氧射线辐射或内源性物质引起的环氮类的甲基化等因素产生的DNA损伤。BER是维持DNA稳定的重要修复方式。,AP核酸内切酶修复途径单个嘌呤或嘧啶脱去后的位点成为AP位点。细胞中自发产生AP位点的频率很高。由一种专门在AP位点上切割的酶切断DNA上的磷酸二酯键，然后再启动由DNA外切酶、DNA聚合酶和连接酶参与的切除修复过程。,糖基化酶是损伤特异性的，细胞中有多种具有不同特异性的DNA糖基化酶 糖基化酶通过水解糖苷键去除受损碱基 切除后在DNA上形成AP位点，再经过AP核酸内切酶途径修复。,DNA糖基化酶（glycosylate）修复途径,2、核苷酸切除修复 ( nucleotide-excision repair，NER ),当DNA链上相应位置的核苷酸发生损伤，导致双链之间无法形成氢键，在一系列酶的作用下，将DNA分子中受损伤部分切除掉，并以完整的那一条链为模板，合成出切去的部分，然后使DNA恢复正常结构的过程。 NER可以修复UV照射形成的嘧啶二聚体，还能消除体内产生的各种嘌呤和嘧啶加合物。NER的关键特征是对损伤的DNA链的两端进行切割。 NER在已研究过的真核生物中都很相似，说明其在进化过程中高度保守。,在人类中这是一种重要的修复途径。着色性干皮症是由于缺乏切除修复酶造成的遗传性缺陷，正常人的皮肤细胞和该缺陷者的皮肤细胞在培养时对UV的敏感性有很大差异，具有该缺陷的人在30岁之前就易死于皮肤癌。,2.4 SOS反应诱导的修复（易错修复）SOS response & DNA repair,SOS反应：细胞DNA受到损伤或复制系统受到抑制的紧急情况下，为求得生存而出现的应急效应。SOS反应诱导的修复系统包括 避免差错的修复能力增强 诱导产生无校正功能的DNA聚合酶 抑制细胞分裂SOS反应是生物在不利环境中求得生存的一种基本功能。对原核生物它产生高变异，对高等动物则是致癌的。,黄曲霉毒素B1的诱变作用（AFB1） 是一种强烈的致癌物，它能在鸟嘌呤G上接上一个黄曲霉素分子，从而使其脱去嘌呤，在复制过程中会在脱嘌呤位置的对面优先插入一个腺嘌呤A，从而诱发GC TA的颠换。,紫外线UV的诱变作用 能使DNA上同一链中相邻的TT变为二聚体TT，干扰正常碱基配对的能力，在DNA复制过程中将发生错误导致突变。,2.5 重组修复( Recombination repair),某些DNA的损伤会阻碍DNA的复制，如UV光二聚体。细胞中由于SOS旁路复制系统会使DNA的复制重新启动并跨过该受损的区域，但在子代DNA链上产生一个缺口，这一缺口可由重组修复作用补上。即从同源DNA的母链上将相应核苷酸序列片段移至子链缺口处，然后用再合成的序列来补上母链的空缺。也称“复制后修复”（post-replication repair），因为它们在复制后起作用。重组修复并不能将亲代DNA上的损伤除去，当第二次复制时，留在亲代DNA链上的损伤任然要用同样的重组修复作用来弥补，但随着多代复制后，损伤的亲代链仅占极少数，绝大部分是重组修复后的正常DNA。从而使细胞恢复正常的功能。,DNA的重组修复,（发生在复制后）：复制时，跳过损伤部位，新链产生缺口由母链弥补，原损伤部位并没有切除，但在后代逐渐稀释。,修复的总体战略，细胞是如何有序地行使修复作用的？细胞不会合成各种酶去修复各种类型的损伤。那会消耗太大的能量。一般先用一种通用的切除修复系统除去DNA上造成明显缺陷的损伤，如核苷酸切除修复。损伤太小并未达明显缺陷时，采用特殊的切除修复系统（如DNA糖基化酶修复系统）。为了消除可能产生的复制错误，这时启用复制后错配修复系统，并能修复其它修复系统遗留下的损伤。各种修复系统并不是万能的，不能把所有的DNA损伤都修复完好生物发生变异进化的原因。,