第五章 生物信息的传递(上)转录课件.ppt

第三章 生物信息的传递（上） Transcription从DNA到RNA,RNA 充当信使的证据,DNA与RNA的比较, 基本概念 转录起始：RNA聚合酶、启动子 转录的基本过程 转录后加工 原核生物与真核生物mRNA的特征比较 RNA合成与DNA合成异同点,Contents,思考题？,一、基本概念与基本特征,基因转录是在细胞核内进行的。它是指以DNA的一条链为模板，按照碱基互补配对原则，合成RNA的过程。,转录(transcription) ：,参与转录的物质,原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板:DNA酶: RNA聚合酶转录的场所：细胞核（真核生物）转录的条件：需要酶和ATP(解旋酶和RNA聚合酶），以及其他蛋白质因子转录的结果：mRNA,RNA合成方向：5 3,转录的不对称性：,在RNA的合成中，DNA的二条链中仅有一条链可作为转录的模板，称为转录的不对称性。,编码链与模板链,与mRNA序列相同的那条DNA链称为编码链，即有义链(sense strand)；将另一条根据碱基互补原则指导mRNA合成的DNA链称为模板链，即反义链(antisense strand)。,模板链并非永远在同一条单链上,DNA分子上转录出RNA的区段，称为结构基因。,结构基因：,转录单元（transcription unit）,一段从启动子开始至终止子结束的DNA序列。,（一） RNA聚合酶（二） 启动子(promoter),二、参与转录起始的关键酶与元件,（一） RNA聚合酶,原核生物RNA聚合酶（大肠杆菌为例）,全酶(holoenzyme)=核心酶(core enzyme)+因子,亚基：识别启动子，起始转录。亚基和其他肽链的结合不很牢固，易脱离全酶。 核心酶：全酶脱离亚基剩下的2称为核心酶。核心酶本身就能催化核苷酸间磷酸二酯键的形成。亚基：是酶和底物结合的部位和催化位点。利福平(rifampicin)和利福霉素(rifamycin)通过结合亚基，对全酶有强烈的抑制作用，抑制RNA合成的起始，但不抑制其延长。亚基基因rpoB突变可使细菌对利福平有抗性。链霉溶菌素(streptolydigin)能抑制RNA链的延长，rpoB突变却可使细胞对链霉溶菌素亦发生抗性。,亚基：其作用是与模板DNA相结合。亚基的碱性较强，适于与模板DNA相结合。肝素是一种多价阴子，能和亚基结合，从而抑制DNA与RNA聚合酶相结合，进一步抑制转录作用。亚基：功能现尚未知。然而，当噬菌体T4感染E.coli时，其亚基即在精氨酸上被ADP-核糖化。这种修饰作用使该RNA聚合酶全酶对其原先识别的启动子的亲和力减弱。所以有人认为，亚基的功能可能是识别其相应的启动子。,大肠杆菌RNA聚合酶的组成分析,原核生物RNA聚合酶的作用,识别启动子。主要依赖于亚基， 亚基只参与转录的起始，并决定转录的方向。与DNA结合并使之解链，另外还具有解旋、重新使DNA螺旋化作用。催化RNA聚合反应。负责三种RNA合成。RNA聚合酶核心酶通过与不同的亚基结合，识别不同的启动子。,2. 真核生物RNA聚合酶,细菌只有一种RNA聚合酶，它完成细胞中所有RNA的合成。真核细胞的转录机构更加复杂。真核细胞核内产生三种RNA聚合酶，位于不同的部位，且均有复杂的亚基结构。每种酶负责不同种类基因的转录。它们的一般性质见下表。,真核细胞的三种RNA聚合酶特征比较,RNA聚合酶的活性最显著。位于核仁中，负责转录rRNA基因(rDNA)，细胞内绝大部分是rRNA。其活性不被-鹅膏蕈碱所抑制。 RNA聚合酶位于核浆中，负责hnRNA的合成。hnRNA是mRNA的前体。其活性可被低浓度的-鹅膏蕈碱所迅速抑制， RNA聚合酶负责合成tRNA和许多小的核内RNAs。聚合酶对-鹅膏蕈碱的反应则不尽相同：在动物细胞中聚合酶可被高浓度-鹅膏蕈碱所抑制，而在酵母和昆虫细胞中则不会被抑制。,RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别,某些常用的转录抑制剂,（二） 启动子(promoter),启动子：指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。,原核生物启动子特性,在基因表达调控中，转录起始是关键，基因是否能表达决定于在特定的启动子起始过程。 只有RNA聚合酶能够特异性地与启动子相结合。亚基起识别作用，没有时，核心酶偶而亦能起始RNA的合成，但有许多起始错误，而且核心酶所合成的RNA链的起始在某个基因的两条链上是随机的。但当存在时，则起始在正确的位点上。,RNA聚合酶能否与启动子相互作用是起始转录的关键问题。 不同启动子对RNA聚合酶的亲和力各不同。可能对调控转录起始的频率，即对基因表达的程度有重要不同。,一类是RNA聚合酶可以直接识别的启动子。这类启动子应当总是能被转录。但实际上也不都如此，外来蛋白质可对其有影响，即该蛋白质可直接阻断启动子，也可间接作用于邻近的DNA结构，使聚合酶不能和启动子结合。 另一类启动子在和聚合酶结合时需要有蛋白质辅助因子的存在。这种蛋白质因子能够识别与该启动子顺序相邻或甚至重叠的DNA顺序。,1） 两类不同的启动子,为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢? RNA聚合酶分子上可能有一个活性中心能够识别出DNA双螺旋上某特异序列的化学结构； 启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合，就好像酶与其底物的结构相恰恰适合一样。,2） 启动子的共同顺序,利用“足迹法”和测序技术，对100多种启动子的顺序进行了比较，发现在RNA合成开始位点的上游大约10bp和35bp处有两个共同的顺序，称为-10和-35序列。这两个序列的特征如下： -35区：T85T83G81A61C69A52 （-35序列, TTGACA区） -10区：T89A89T50A65A65T100 （-10序列,TATA区） 大多数启动子均有共同顺序(consensus sequence)，只有少数几个核苷酸的差别。共同顺序是启动子的关键部位。,启动子的共同顺序,启动子的共同顺序,TATA区：(又称为-10序列或Pribnow盒) 酶的紧密结合位点（富含AT碱基，利于双链打开）-10序列的突变不影响RNA聚合酶与启动子结合的速度，但会降低双链解开的速度。 TATA盒决定着转录的方向。,-35序列是RNA聚合酶全酶的识别位点，对全酶有很高的亲和性。 如果-35序列发生突变或缺失，将大大降低对全酶的亲和性，即降低RNA聚合酶与启动子的结合速度，但不影响转录起始位点附近DNA 双链的解开。,TTGACA区（又称-35序列）提供了RNA聚合酶全酶识别的信号,转录起点,与新生RNA链第一个核甘酸相对应DNA链上的碱基。,大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区,T85T83G81A61C69A52,T89A89T50A65A50T96,典型启动子的结构,-35 -10 转录起点TTGACA 16-19bp TATAAT 5-9bp,原核生物亦有少数启动子缺乏这两个序列（-35和-10)之一。在这种情况下，RNA聚合酶往往不能单独识别这种启动子，而需要有辅助蛋白质的帮助。,E.coli RNA聚合酶与启动子结合的过程可分为两步：酶识别启动子，并与其结合形成“关闭”复合体(即双螺旋形式)。这一步所识别的是-35序列。“关闭”复合体转变为“开放”复合体(即双螺旋解旋，两条链分开)，此时酶的结合比较紧密。在这个转变中，富含AT碱基对的-10区约有17bp被解旋，暴露出模板链。-10区的突变可阻碍开放复合体的形成。许多突变改变了-10序列中的碱基，但并未减低其AT对的水平，却仍然能阻碍其融化为开放复合体，可见-10区除了要易于融化之外，还必须有特异的形状，以便RNA聚合酶能够识别它。,RNA聚合酶与启动子的结合,RNA聚合酶与启动子的结合模式图, 真核生物启动子,真核有三种不同的启动子和有关的元件启动子最为复杂，它和原核的启动子有很多不同,又称rRNA基因启动子或型启动子。不同真核生物型启动子序列有较大的差异，缺乏保守性。目前发现有两个区域是转录必需的： -40+5近启动子部分：为核心序列，其功能是决定转录起始的精确位置。这一段序列的全部或部分缺失，被同样长度的寡聚核苷酸替代，在选择性位点作单个碱基突变等变化，都会消除或强烈降低 rDNA转录能力。 -165-40远启动子部分：又称上游控制元件(UCE)，其功能是影响转录的频率。这段序列受到缺失、置换、插入等破坏，可造成转录下降100倍。,1） RNA聚合酶启动子,又称蛋白质基因启动子或型启动子。该启动子有四个区域对转录起始和活性起着调控作用，是真核基因转录不可缺少的。 转录起始位点：其碱基大多为A，两侧各有若干个嘧啶核苷酸：YAYTCYYY。该序列对启动子的强度和确定起始位点方面都是必要的。 TATA盒：位于-25-30bp左右，是核心序列，又称Hogness box。其共有序列： T85A97T93A85(A63/T37)A83(A50/T37) 基本上由AT组成，极少数启动子中有GCbp。,2） RNA聚合酶启动子,TATA盒的作用在于决定转录的起点，序列的改变会是转录位点偏移；缺失TATA盒，转录将在许多位点上开始。TATA盒决定转录的效率： 如鸡蛋清蛋白基因启动子的TATA变为TAGA后，转录效率大大下降； 兔珠蛋白中TATA盒是ATAAAA，人工突变为ATGTAA后，转录效率下降80%； 人的-珠蛋白基因的ATAAAA序列变为ATGAAA、ATACAA或 ATAGAA， -珠蛋白的产量大大降低，引起地中海贫血症。少数蛋白质基因缺乏TATA盒，如腺病毒DNA结合蛋白（27KD）基因的上游没有TATA盒。, 上游调控区（UPE）：真核型启动子上游具有多种调控元件： CAAT盒：转录起始位点上游70-80bp处的CAAT顺序。这一顺序具有较保守的共同顺序：GGC/TCAATCT。RNA聚合酶可以识别一顺序。用人工方法诱导兔珠蛋白基因CAAT顺序发生突变，兔珠蛋白基因的转录水平降低。 GC盒：位于CAAT盒邻近，共同顺序：GGGCGG。 此外，在不同的启动子上还有其它类型的UPE，他们是转录调控因子结合的位点，影响着转录活化和频率。, 远端调控区：在真核生物中，有些基因的启动子远上游区域（-100bp以上）可大大增强启动子的活性，这种序列称为增强子。 增强子有两个特征：与启动子的相对位置不固定，而能有很大的变动；b. 能在两个方向产生作用。一个增强子并不限于促进某一特殊启动子的转录，它能刺激在它附近的任一启动子。首先被发现的增强子是SV40增强子。,SV40 增强子由两个72bp重复串连而成，约在转录起始点上游200bp处，即107178和179250序列。 缺失实验显示两个重复缺失一个并不产生什么影响，如两个均缺失即将大大降低活体内的转录。有人发现，如果将珠蛋白基因放在含有72bp重复的DNA分子中，它的转录作用在活体内将增高约200倍以上，甚至当此72bp顺序位于离转录起点上游1400bp或下游3000bp时仍有作用。各个基因中的增强子顺序差别较大，但有一个基本的核心顺序(core sequence)：AAAGGTGTGGGTTTGG,RNA聚合酶能识别各种各样不同的启动子顺序，当然，还是要依靠一些辅助因子。 例如，RNA聚合酶在转录爪蟾的5SRNA基因时，需要一个转录因子，37KD的蛋白质TFA的协助。TFA结合在+45到+96的部位。它有双重作用(另外一个作用是在卵母细胞中与5SRNA相结合)。 另外还需要两个因子(TFB和TFC)，但这两个因子对所有第类基因的转录都需要的。而TFA则是对5S基因专一的。,3） RNA聚合酶启动子,在枯草杆菌(Bacillus subtilis)中首次发现不同启动子需要不同因子。 细胞中存在主要的因子，识别主要启动子。此外，还有另外一些因子，能够识别另一些启动子，并促使核心酶起始转录。这些变异的因子在细胞中有特别功能，通常能剧烈改变细胞RNA的合成方式，以便在需要时使一组全新的基因得以表达。 噬菌体往往有其自己的因子，借以在噬菌体发育的某一特殊阶段开动其所需要的某些噬菌体基因的转录。,不同启动子需要不同因子,E.coli细胞中正常的因子称为70(表示其分子量为70KD)。 E.coli中有17个热休克基因，其基因表达依赖于基因htpR，受热休克反应所诱导。hrpR的产物是一个很不稳定的32KD蛋白质，它就是一种变异的因子，称为32。32能引导核心酶在热休克基因的启动子处起始转录。 70和32识别的启动子的顺序是不同的。特别是其-10顺序几乎完全不同。,E.coli另一种因子是在氮饥饿时起作用的，称为60。正常时E.coli细胞中仅有少量60，但当介质中氨缺乏时，60大量增多，以开启某些可利用其他氮源的基因。这就是说，60能引导核心酶识别启动子的另一种共同顺序。 60所识别的-35顺序实际上位于-20处，因为-10和-35顺序之间的间距特别短，只有6bp。,E.coli的不同因子识别不同的共同顺序,枯草杆菌正常因子(相当于70)称43，它能识别70所识别的共同顺序。从一组基因表达变换为另一组基因表达往往需要更换因子。 B.subtilis在芽孢形成中产生新的因子： 在芽孢形成期开始时43即被37所取代。芽孢形成开始时，在37的指导下，RNA聚合酶即能转录第一组芽孢形成基因。37分子较43略小。它在营养型细胞中即已存在，但为量很少，而且也不和核心酶结合形成全酶。 在芽孢形成开始后4h，29开始出现。它指导另一组新基因的转录。29不存在于营养型细胞中，故可能是芽孢形成基因在37转录下的表达产物。,目前尚不了解这种替代如何调控的，现在认为机制可能很复杂，牵涉到其他好几种蛋白质。这种替代并不完全，而且被替代下的43也未完全被灭活。大约还有10%的核心酶仍和43相结合，可能还有某些营养型酶在芽孢形成时仍存在于细胞中。在营养型细胞中存在一种32。它在芽孢形成早期出现活性，指导某些启动子起始转录。其含量极少，不到1%。,在营养型细胞中还有一种28，它的量不多，仅代表RNA聚合酶总活性的一小部分，而在芽孢形成开始时即告失活。然而奇怪的是，在某些不能形成芽孢的突变株中，是找不到它的活性的。所以有人认为，28是表示营养已用竭，应当开始芽孢形成反应的信号系统的一个部分。,真核生物启动子的结构,核心启动子（core promoter）上游启动子元件（upstream promoter element，UPE）,1、核心启动子,定义：指保证RNA聚合酶转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点及转录起始位点上游TATA区,作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始,TATA 常在-25bp左右，相当于原核的-10序列T85A97T93A85A63A83A50,2、上游启动子元件,包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等,作用：控制转录起始频率。,CAAT：-70 - -80bpGGGCGG：-80 - -110bp, 启动子的效率 各启动子的效率是不一样的，效率好的启动子可以使RNA转录重复的更快一些。即启动子开始与酶结合和开放型复合物的形成速度，在各启动子之间不一样。有的启动子需要10min以上才启动一次，有的仅12s内启动一次。 启动子的启动速率是基本的限速步骤，在这一步骤的基础上，基因表达的速度就确定了。 即使是同一基因，其转录效率也是不固定。在不同的生长情况下转录可根据需要而改变。,启动子的效率及影响因素,E.coli转录调节常常是通过调节蛋白的介导。调节蛋白与启动子或启动子附近的序列相结合，从而增高或降低RNA聚合酶起始的效率。调节蛋白有： 阻遏蛋白(repressor)：能阻断RNA聚合酶的结合，从而抵制转录； 激活蛋白(activator)：能与RNA聚合酶结合并提高其活性。, 调节蛋白对启动子的影响,凡需要激活蛋白才能充分发挥作用的启动子常常与-35顺序很不相似，这提示激活蛋白可以取代这个结合位点。 作为一种启动子的阻遏蛋白可能是另一种启动子的激活蛋白，反之亦然，这取决于其结合位点的准确位置。一种调节蛋白的名称常常只是反映了它第一次被发现时的功能。, 调节蛋白对启动子的影响,影响启动子功能的调节蛋白,影响启动子功能的调节蛋白,RNA聚合酶首先要在启动子处使DNA解旋才能起始转录。因此，DNA模板的超螺旋张力对启动子效率有影响，凡有利或不利于解旋的情况就会增高或降低起始的频率。 DNA旋转酶(gyrase)能使细菌的DNA保持超螺旋状态，故有利于解旋。DNA旋转酶抑制剂萘啶酮酸可以抑制许多基因的表达。 拓扑异构酶能阻止负超螺旋。编码拓扑异构酶的基因发生突变时可增强某些基因的表达。, 模板的超螺旋张力对启动子效率的影响,但是，增加负超螺旋不一定就会增强启动子的功能，对某些启动子可能正好相反。这可能在于负超螺旋改变了启动子的微细构象，抑制了RNA聚合酶的功能。详细的机制还不明了，旋转酶基因的启动子本身据信就有这样的特性。这是有利于调节负超螺旋程度的：当细胞DNA的负超螺旋达到足够的程度时，DNA旋转酶的合成就会自动放慢。,此外，某些启动子对超螺旋张力很敏感，而另一些则不很敏感。可能性之一是每个启动子对超螺旋的依赖程度不同，这取决于其不同的顺序。某些启动子的顺序易于融化(故较不依赖于超螺旋)，而另一些的顺序较难融化。另一种说法是细菌染色体的不同区域本来就有不同程度负超螺旋，因此，启动子处于染色体的什么区域就是一种重要因素。,原核生物RNA聚合酶具有很大的全能性，几乎不依赖任何其他蛋白质。但是，真核生物RNA聚合酶不具有全能性，需要依赖于一系列蛋白因子才能识别和结合到启动子特定序列上，并启动转录。 真核生物基因转录必需的蛋白因子统称为转录因子。目前已经分离纯化或鉴定的转录因子有数百种，分为两类：a.普遍性转录因子：结合与启动子及邻近的序列。b.转录调控因子：结合与上游调控区和增强子区。, 转录因子对启动子的影响,上游序列在某些时候可作为一些激活剂的结合部位，直接激活RNA聚合酶； 上游序列和拓扑异构酶结合，诱导DNA形成有利的超螺旋状态，有利RNA合成； 上游序列促使RNA聚合酶能更好地接近启动子区段，或使DNA与蛋白质结合固定在细胞结构上； 上游序列可影响-10和-35区的DNA结构。, 上游DNA序列可增强启动子的活性,转录起始复合物, 原核生物转录起始复合物,转录因子 转录复合体TBPTAFsTFIIATFIIB TFIIF Pol IITFIIE RNA pol 的转录起始, 真核生物转录起始复合物,转录的基本过程,1、起始位点的识别：RNA聚合酶与启动子DNA双链相互作用并与之相结合的过程。因子能识别启动子，并识别有义链，它与核心酶结合，引导核心酶定位到启动子部位。,2、转录起始,RNA链上第一个核甘酸键的产生标志着转录起始当聚合酶结合到启动子上后，在启动子附近将DNA局部解链，约解开17个碱基对。（酶与启动子结合的部位是AT富集区，有利于解链） 第一个核苷三磷酸(常常是GTP或ATP)结合到全酶上，形成“启动子-全酶-核苷三磷酸”三元起始复合物。 第二个核苷酸参入，连结到第一个核苷酸的3羟基上，形成了第一个磷酸二酯键。 因子从全酶上掉下，又去结合其它的核心酶。,3、RNA链的延伸, 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移，方向为DNA模板链的 3 5，同时将核苷酸逐个加到生长的RNA链的3-OH端，使RNA链以 5 3方向延伸。 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,核心酶 DNA RNA,4、转录终止,终止子（terminator）：基因编码区下游使RNA聚合酶终止mRNA合成的密码子。 强终止子内部终止子 弱终止子 需要因子（rho factor） 又称为依赖性终止子 （Rho-dependent terminator）,不依赖Rho ()因子的转录终止依赖Rho ()因子的转录终止,转录的终止,DNA分子上有终止转录的特殊信号，也是特定的核苷酸序列，称为终止子。 RNA聚合酶可以识别终止子，它在一种蛋白因子的帮助下，终止转录，放出RNA链；有时，RNA聚合酶不需要蛋白因子的帮助即可终止转录。 核心酶释放了RNA后，也离开DNA。 DNA上的解链区重新形成双螺旋。,两类终止子共同的序列特征,在转录终止点前有一段回文序列。回文序列的两个重复部分(每个720bp)由几个不重复的bp节段隔开。回文序列的对称轴一般距转录终止点1624bp。,不依赖因子的终止,终止位点上游一般存在一个富含GC碱基的二重对称区（回文序列），RNA形成发夹结构；,在回文序列的下游方向又常有68个AT碱基对(在模板链上为A、在mRNA上为U)；,两类终止子的不同点,发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。,终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，长度 效率,依赖因子的终止,因子：六聚体蛋白、水解各种核甘三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。,依赖因子终止子中回文序列的GC对含量较少。在回文序列下游方向的序列没有固定特征，其AT对含量比前一种终止子低。,转录的基本过程,转录的抗终止,由于不同的生理要求，在转录过程中有时即使遇到终止信号，仍然需要继续转录，于是出现了抗终止现象 。抗终止是细菌操纵子和噬菌体在调控回路中对转录进行的调控。抗转录终止的两种方式：1.破坏终止位点RNA的茎-环结构；2.依赖于蛋白因子的转录抗终止。,不论原核或真核生物的rRNAs和tRNAs都是以初级转录本形式被合成的，然后再加工成为成熟的RNA分子。然而绝大数原核生物的mRNA却不需加工，仍为初级转录本的形式。相反，真核生物从断裂基因产生的mRNA要经过复杂的加工历程，包括去除内含子的剪接反应(splicing)。 RNA的加工和成熟包括三个方面： RNA的一般加工过程 （5端加帽和3端加尾） RNA的剪接作用 RNA的编辑作用,RNA的加工和成熟,真核生物mRNA前体称为hnRNA，又称类似DNA的RNA(D-RNA)。由hnRNA加工为成熟的mRNA，经历以下过程： 5 端形成特殊的帽子结构5端的一个核苷酸总是7-甲基鸟核苷三磷酸（m7Gppp），mRNA5端的这种结构称为帽子（cap）。有三类：帽子0：m7 G 5 ppp 5X 单细胞生物（如酵母）帽子1：m7 G 5 ppp 5Xm 多细胞生物，主要形式帽子2：m7 G 5 ppp 5XmpYm 占1015%,真核生物mRNAs的加工,帽子结构功能： 能被核糖体小亚基识别，促使mRNA和核糖体的结合； m7Gppp结构能有效地封闭mRNA 5末端，以保护mRNA免受5核酸外切酶的降解，增强mRNA的稳定。,真核生物mRNAs的加工, 3端加尾： 由一种360KD特异性酶切除3末端一段后，经RNA末端腺甘酸转移酶催化加上polyA尾巴（约200个A）。,PolyA的功能：可能在于增加mRNA的稳定性。,真核生物mRNAs的加工,多聚腺苷酸尾巴的添加,AAUAAA：准确切割加poly（A）,真核生物mRNAs的加工,m7Gppp,鸟甘酸转移酶, 通过剪接除去由内含子转录的序列。 链内部核苷酸甲基化。 主要是m6A，可能对mRNA前体的加工起识别作用。,真核生物mRNAs的加工,真核生物rRNA的成熟过程比较清楚。哺乳动物的初级转录本是一条45SRNA链，约含110个甲基，是在转录中或刚刚转录好时加工上去的。45SRNA被加工成18S，5.8S和28SrRNAs。 几乎所有甲基均连接在核糖基上，在成熟的rRNAs中，这些甲基全部被保存。甲基的存在是初级转录本转变成熟的rRNA的标志。 18SrRNA上大约有39个甲基是原来的，有4个是后加上去的； 28SrRNA大约有74个甲基，全部是原来的。,真核生物rRNAs的加工,成熟的途径可能多样，因为中间产物的长度在不同途径中是不一样的，然而最终产物都是一样的。 其中两条途径(HeLa途径和L途径)切割的位置是： 18S基因的5则； 18S和5.8S基因之间的间隔区(soqacer)； 5.8和28S序列之间的间隔区 (5.8S序列成为一个和28S rRNA通过碱基配对相结合的小RNA)。,E.coli7个编码rRNA的操纵子称为rrnA-G。它们在染色体上不连锁。每个操纵子均转录为一个RNA前体。这些rrn操纵子的组成基本相同，均含有顺序为16S-23S-5S的三个rRNA分子。 所有rrn操纵子均有双重启动子： 启动子P1：位于16S序列起始位点的上游约300bp处。P1可能是主要的启动子。 启动子P2：在P1的右方约110bp处。,原核生物rRNAs的加工,加工rRNA的酶是RNase。 在r n e-细胞中缺乏成熟的rRNAs，而是30S前体。该前体在体外被RNase切割成成熟的rRNA分子。 16S和23SrRNAs的前体分别称p16和p23，它们分别比16S和23S略长一些。在初级转录本中，由于p16、p23的两端的碱基都是互补的，它们分别形成很大的发夹。其发夹顶的环非常大，分别为1600个核苷酸和2900个核苷酸。,tRNA的加工,原核或真核生物中tRNA基因往往成簇存在。在原核生物中，至少某些tRNAs能一起形成操纵子，并由一个启动子转录成一条长的前体RNA链。例如，T4噬菌体中8个tRNA基因组成一簇。 E.coli中已找到两个tRNA基因簇，二者均除tRNA基因外尚含有其他基因。这两个基因簇均含有tRNATyr的基因，故命名：tyrU簇，包括4个tRNA基因，tRNAThr，tRNAGly，和tRNATyr；tyrT簇，则仅包含两个相同的基因，编码tRNATyr。,在每个tRNA基因簇中，唯一的启动子常位于第一个tRNA基因之前。 在最后一个tRNA基因的后面还有编码蛋白质的基因。 在tyrU簇中是基因tutB(编码延长因子EF-Tu的两个基因之一)。 而在tyrT簇中是编码蛋白质P的基因(蛋白质P是一种类似鱼精蛋白的多肽)。,E.coli中参与tRNA加工的酶有： 1. RNaseP：它是一种内切核酸酶，负责切割所有tRNA分子的5端。它是一种不寻常的酶。它由蛋白质和RNA二者组成，分子中RNA有375个碱基长(约130KD)；而蛋白质组分要小得多，大约只有20KD。在E.coli中，基因rnpA编码其蛋白质组成，而rnpB编码RNA部分。这两个基因相隔甚远。RNA和蛋白质这两个组分对RNaseP的催化活性似乎都是必须的。,2. RNaseD：它能从RNA的3端一个一个地切去碱基，以产生tRNA的真正的3端(5端由RNaseP产生)。3. RNase：有外切核酸酶的活性，它能够将tRNA完全分解完。以前认为它也与tRNA加工有关，但目前认为它可能仅和RNA的分解代谢有关。,在细菌中有两种tRNA前体，其区别在于其3端的序列。 型分子有CCA三联体在其3端。但某些噬菌体编码的型分子则没有CCA序列。当其他碱基被一个一个从前体分子上除去后，另由称为tRNA核苷酸转移酶的将CCA加到3端上去。 真核生物中可能所有的tRNA前体都属于型，在成熟时都需要通过酶的作用，在其3端加上CCA序列。,RNA的剪接,1. 酵母tRNA的剪接,RNA的剪接就是要把断裂基因的转录本中的内含子除去。 酵母胞核400个tRNA基因中约有40个是断裂基因。这些基因均只有一个内含子，位于与反密码子的3侧相隔一个核苷酸之处，长度为14至46bp。不同的tRNA基因中的内含子不同，无任何可识别的共同顺序。所有内含子中均有一段反密码子互补的序列，反密码子被配对而使反密码臂伸长了很多。在前体中仅反密码臂受到影响，其他部分仍保持其正常结构。,酵母tRNAphe中的内含子能与其反密码子碱基配对，从而改变了反密码臂的结构。此剪切过程可分为两个阶段： 第一步是磷酸二酯键的断裂，这不需要ATP。这一步由一种内切核酸酶所催化。 第二步是连接反应，需要ATP的存在，由RNA连接酶所催化。在无ATP时，产生的两个tRNA半分子不能连接起来。 识别信号可能位于前体tRNA的外显子中的序列和结构。,这两个半分子具有独特的末端：其5端有OH基，而3有一个2,3 -环磷酸基。当加入ATP时，两个tRNA半分子先发生碱基配对，形成成熟tRNA分子的构象，然后由RNA连接酶形成磷酸二酯键而将两个半分子共价连接起来。 2,3-环磷酸基的存在并不限于酵母，在植物和哺乳动物的tRNA剪接反应中也有环状基团的产生。在人的HeLa细胞中，RNA连接酶能将带有2,3-环磷酸基的RNA和另一带有5-OH基的RNA直接连接起来。酵母tRNA前体也可以在爪蟾的卵母细胞核提取液中正确地被剪接。这表示剪接反应没有种属特异性。爪蟾具有能识别酵母tRNA的内含子的酶类。,内含子,外显子2,外显子1,内切酶,5,3,外显子1,外显子2,3,5,P,HO,激酶,外显子2,外显子2,外显子2,A-P-P,3,3,3,连接酶-AMP,连接酶,ATP,内含子,P,外显子2,P,外显子1,P,OH,外显子1,P,P,外显子1,P,OH,3,5,5,5,AMP,磷酸酯酶,P,环式磷酸 二酯酶,pre-tRNA,成熟tRNA,四膜虫的两个主要rRNAs基因的初级转录本称为35S前体RNA，较小的rRNA的序列在5侧，较大的26SrRNA序列则在3侧。在编码26SrRNA序列存在一个单一的，短的(约400bp)内含子。 如将这个35S前体RNA在体外温育，可以发生自动剪接作用:内含子从前体中被切出，先呈线性RNA片段，后来又环化为环状RNA。,2. rRNA的剪接自身剪接反应,某些真菌线粒体中的内含子有很不寻常的结构，这些内含子有编码顺序，这些顺序的翻译对于该顺序所在的内含子的剪接是必须的。 编码细胞色素b (cytb)的box基因在仅剪去内含子1时，会产生RNA成熟酶的mRNA。当内含子2亦被剪去时，才是cytb的编码顺序的开端。 box基因中的外显子1有417bp，编码cytb的N端139个密码子。内含子1有765bp，不编码。外显子2非常短，仅有5个密码子。其后是一个很长的内含子2，含有840bp组成的开放读框(ORF)，有280个密码子，其最后一个密码子为终止密码子。,3. 能够编码蛋白质的内含子的剪接,当将内含子1剪去后，翻译即从外显子1起始，通读过外显子2而进入内含子2的ORF，产生一个有423个氨基酸残基的蛋白质(其中144个是cytb的N端氨基酸，279个则由内含子2编码）称为RNA成熟酶(maturase)。 RNA成熟酶是特异地用来剪去内含子2的。这样，这个酶促反应便成为一个非常敏感的负反馈径路。去除内含子2后，外显子1和2即与外显子3相连接，因而破坏了编码成熟酶的顺序。,生物体内内含子的主要类型：GU-AG、AU-AC、类内含子、类内含子,参与RNA剪接的物质：,snRNA（核内小分子RNA）snRNP（与snRNA结合的核蛋白）,mRNA内含子的去除必须非常精确，否则即使只差一个核苷酸，也会产生错义或移码的蛋白质。所以可以肯定在内含子与外显子连接处的核苷酸序列具有高度的相似性。 剪接连接点(splicing junctions)是指在切断和重接位点处的两旁的顺序。在内含子左侧的连接点称为供体(donor)，在内含子右侧的称为受体(acceptor)。,4. mRNA内含子的剪接 细胞核中的剪接连接点,正确的剪接依赖于天然前体RNA分子的完整性。一个外源基因如果存在于病毒顺序中，仍能很好地被剪接。另外，前体RNA亦能在不同的组织，或甚至不同物种的细胞中被正确地剪接。这都表示剪接作用是很保守的。 一个基因的外显子可以和另一个基因的外显子连接。例如SV40(猴病毒40)早期转录单位的第1外显子和小鼠珠蛋白的第3外显子相连。 剪接作用与转录作用、 RNA的修饰无关。例如HeLa细胞的核提取液能够剪接纯化的RNA前体，珠蛋白RNAs即使缺少poly(A)尾链，也没有加帽，仍能正常地被剪接。,剪接过程可分为两个阶段，核内剪接需要ATP。在第一阶段中，内含子左端(供体位点)处被切断，形成两个分离的RNA分子，即左外显子和右内含子-外显子。左外显子此时为线性分子，但右内含子-外显子则不然：内含子左端(5端)以5-2键与在内含子右端上游约30碱基处的CTGAC序列(共同序列)中的A相连接，于是形成一个套索(lariat)。, 剪接过程套索的产生,在第二阶段，在受体位点处被切断而将此套索状的内含子剪去；同时分离的右外显子即与左外显子相连接。套索然后被“脱支(debranch)”而形成一线性内含子。 在这种剪接机构中，有三个很短的共同顺序，即供体点、受体点和套索分支处的序列。 供体点 分支点 受体点 外显子1GGUAPyAG外显子2,分支点 外显子1GGUAPyAG外显子2 UG G外显子1 A PyAG外显子2 UG G外显子1 A PyAG外显子2 外显子1G外显子2 UG APyAG,剪接反应需要蛋白质和RNA参与。 参与剪接反应的蛋白质：有4类A. SR蛋白家族：含有S-Ser和R-Arg二肽重复序列，起调控作用。 结合于多聚嘧啶束的蛋白质： 2种U2snRNP的辅助因子(U2AF)， 1种多聚嘧啶束的结合蛋白(PTB)， 1种与PTB相连的剪接因子(PSF).与snRNP相连的剪接蛋白,D.其它剪接蛋白： 帽子结合蛋白CBP； 剪接体形成蛋白； 催化必需的蛋白质因子； 依赖于ATP的RNA解旋酶； 特异于SR蛋白的激酶。E. 组成snRNPs的大量蛋白质 参与剪接反应的RNA： U1、U2、U4、U5和U6snRNA五种。 snRNA和大量蛋白质结合组成snRNP(小核糖核蛋白颗粒),每个真核细胞中含有105-106个小RNA，约有100300个碱基，它们是由RNA聚合酶或所合成的，其中某些像mRNA一样可被加帽。 snRNA：在细胞核中，如U16 snRNA scRNA：在细胞浆中 snRNP：snRNA-蛋白质复合物，U16 snRNP scRNP：scRNA-蛋白质复合物,(3) snRNAs的作用,snRNPs的作用：和剪接作用有密切关系，有些snRNPs分别和供体及受体剪接位点以及分支顺序相互补。,编码蛋白质的结构基因是在核浆中被转录的。核浆中的RNA大，很不稳定，并且其顺序的复杂性也要大得多。由于它的大小很不一致，故称核内不均一RNA(hnRNA)。 mRNA是从hnRNA生成的。胞浆内mRNA平均只有1800-2000个碱基。而哺乳动物的hnRNA平均有8000-10000个碱基，其范围很广泛，从2000-14000碱基均有，所以一般要比mRNA大4-5倍。正常哺乳细胞中mRNA仅占hnRNA量的5%，则相当于有25%的hnRNA可转变为mRNA。有3/4的hnRNA即在核内降解。,(4) 核内不均一RNA,hnRNA被切除内含子后即成为mRNA，并进入细胞浆内。但在切除内含子之前，hnRNA可先加帽和加poly(A)尾链。有一种称为poly(A)聚合酶的酶可以用ATP为底物，以加上poly(A)尾链，这是hnRNA转变为成熟的mRNA所必须的。在哺乳动物细胞中，仅约30%的hnRNA被多聚腺苷酸化，而mRNA中却约70%是有poly(A)尾链的。可能多聚腺苷酸化是hnRNA分子要被加工的信号。hnRNA的尾端要被切去一段，然后才加上poly(A)。因为RNA聚合酶在转录时即已通过了相当于加上poly(A)的位点，故hnRNA尾端的多余部分要由内切核酸酶切去，才能加上poly(A)。,5. RNA剪接的生理作用,选择性剪接的生物学意义一个基因可以产生多个蛋白质,选择性剪接(alternative splicing)是指在同一个基因中，其剪接位点和拼接方式可以改变，从而导致一个基因能产生多个具有明显差异的mRNA。,例1：选择性剪接能使-原肌球蛋白基因编码出骨骼肌细胞和成纤维细胞两种形式的蛋白质。,骨骼肌肉细胞中剪接,平滑肌-原肌球蛋白mRNA,-原肌球蛋白mRNA前体,成纤维、平滑肌肉细胞中剪接,骨骼肌-原肌球蛋白mRNA,被剪去的部分