第五章 分子发光分析法课件.ppt
,萤火虫发光,第五章 分子发光分析法,第一节 荧光分析法第二节 磷光分析法第三节 化学发光分析法,第一节 荧光分析法,一、概述 16世纪人们发现紫外和可见光照射到某些物质时，这些物质会发光，当光照停止时，物质发光会停止。1852年斯托克斯（stokes) 进行了解释。1867年Goppelsroder应用铝-桑色素络合物的荧光对铝进行了测定。现在已是一种重要的方法,王伦教授,国家自然科学基金,生物大分子有机纳米荧光探针的制备及其应用（国家自然科学基金）(20375001) 基于纳米材料的荧光共振能量转移体系的研究及其在喹诺酮类药物残留检测中的应用（国家自然科学基金）(20575001),朱昌青,物种敏感量子点新型荧光探针的制备及应用 ( 20575002 ) Fluorescence enhancement method for the determination of nucleic acids using cationic cyanine as a fluorescence probe。Analyst，2004, 129: 254-258,二、基本原理,当一个电子被激发时，通常跃迁至第一激发轨道上，也可能跃迁到能级更高的单重态上。处于激发态的电子，通常以辐射跃迁方式或无辐射跃迁方式再回到基态，辐射跃迁主要包括荧光、延迟荧光或磷光的发射。,电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁(发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；,2.激发态基态的能量传递途径,荧光：10-710 -9 s,第一激发单重态的最低振动能级基态；磷光：10-410s；第一激发三重态的最低振动能级基态,振动施豫(VR): 同一电子能级中，电子由高振动能级转移至低振动能级而将多余的能量以热的形式发出，振动施豫时间为10-12s。 内转移：当两个电子能级非常靠近以致其振动能级有重叠时，常发生有高能级以无辐射跃迁方式转移至低能级。 外转移：激发分子与溶剂分子或溶质分子的相互作用及能量转移而去活的过程称外转移。体系间跨越跃迁：指不同多重态间的无辐射跃迁。 磷光发射：由第一激发态（单重）的最低振动能级有可能以系间窜跃的形式转至第一激发三重态，通过振动施豫转至其最低振动能级，因此激发态跃回至基态时便发射磷光，10-4-100s，这种跃迁所发射的光在光照停止一段时间后仍可持续一段时间 。,非辐射能量传递过程,荧光发射：电子由第一激发单重态的最低振动能级基态（多为 S1 S0跃迁），发射波长为 2的荧光 10-710 -9 s 。由图可见，发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长长； 2 2 1 ；磷光发射：电子由第一激发三重态的最低振动能级基态（ T1 S0跃迁）； 电子由S0进入T1的可能过程：（ S0 T1禁阻跃迁） S0 激发振动弛豫内转移系间跨越振动弛豫 T1 发光速度很慢： 10-4100s 。 光照停止后，可持续一段时间,辐射能量传递过程,(二) 荧光效率及其影响因素,1.荧光量子产率（荧光效率） 荧光效率,Kf 为荧光发射过程的速率常数，Ki为非辐射跃迁的速率常数之和。 一般来说：Kf主要取决于物质的化学结构Ki主要取决于化学环境。荧光效率在0.1-1.0之间,2、荧光与分子结构的关系,（1）具有共轭双键体系的分子=0.28 0.68（2）具有刚性平面结构的分子,很强,无,（3）取代基效应a.给电子基团常常使荧光增强。如-OH,-OR,NH2,-NHR等。b.吸电子基团会减弱甚至破坏荧光。-COOH,C=0,-N02 等,滂铬BBR（无）,AI3+ _滂铬BBR鏊合物（有（红色）,3 环境因素对荧光的影响,1.溶剂极性的影响：一般来说，电子激发态比基态具有更大的极性，随着溶剂增强，对激发态会产生更大的稳定作用结果使物质的荧光波长红移荧光强度增大溶液pH对于荧光强度的影响,H 的影响,（三）溶液的荧光强度,荧光强度与溶液浓度的关系 又根据朗伯比耳定律：,IF = 2.3 I0 LC= Kc,I0为激发光强度，为摩尔吸光系数， L为样品池厚度， c为样品浓度又对于很稀溶液，投射到样品上被吸收的激发光小到2%时。即Lc0.05,（四 ）溶液的激发光谱和发射光谱荧光光谱,固定激发光波长(选最大激发波长), 化合物发射的荧光(或磷光强度)与发射光波长关系曲线(图中曲线II或III)。,激发光谱曲线,固定测量波长(选最大发射波长),化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线 （图中曲线I ）,三、荧光分析仪器,一、仪器结构流程,测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。 特殊点：有两个单色器，光源与检测器通常成直角。,基本流程如图：单色器：选择激发光波长的第一单色器和选择发射光(测量)波长的第二单色器；光源：灯和高压汞灯，染料激光器(可见与紫外区)检测器：光电倍增管。,仪器光路图,四 荧光分析的应用,(一) 无机化合物的分析有机试剂分析进行分析的元素近70种铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定,某些无机化合物荧光测定一览表,(二)有机化合物的分析,第二节 磷光分析法,一 概述 二 基本原理(一) 磷光的产生和磷光强度IP= 2.3pI0bC =Kc式中： p 为磷光效率 I0 为激发光的强度。b 试样池的光程,(二）温度对磷光强度的影响,低温有利于磷光的产生。（三）重原子效应 使用含有重原子的溶剂（如碘乙烷）或在磷光物质中引入重原子取代基，都可以提高磷光强度。这种效应称为重原子效应。前者为外部重原子效应，后一种为内部重原子效应。（四）室温磷光 在室温条件下，溶液中磷光太弱，不能用于分析，加入适当的表面活性剂后，由于形成了表面活性剂胶束，改变了磷光物质的微环境，增强了定向约束力，从而减少了磷光分子与溶剂分子的碰撞几率,增加了三种态的稳定性。,磷光分析仪器,1、试样室 低温磷光一般在液氮温度下进行，盛放试样的试样池需放置在盛液氮的杜瓦瓶内。2、磷光镜,通常借助于荧光和磷光寿命的差别，采用磷光镜的装置将荧光隔开。,第三节 化学发光分析法,一、概述,生物体化学发光现象的研究起源于古代，但是，直到十九世纪末，这种现象与简单的有机反应相联系才得到解释。,1877年 洛粉碱CL1905年 洛粉碱类似物1928年 鲁米诺1935年 光泽精1960s 发现许多有机反应可产生CL,化学发光反应的条件 在化学反应过程中，某些化合物接受能量而被激发，从激发态返回基态时，发射出一定波长的光。 A +B = C + D* D* D + h（1）能快速地释放出足够的能量（E =170300 kJ/mol ）（2）反应途径有利于激发态产物的形成；（3）激发态分子能够以辐射跃迁的方式返回基态，或能够将其能量转移给可以产生辐射跃迁的其它分子。 化学发光反应存在于生物体(萤火虫、海洋发光生物)中，称生物发光(bioluminescence)。,二、基本原理,三、化学发光反应的分类,直接化学发光A + B C* + DC* C + h例: NO + O3 NO2* + O2 NO2* NO2 + h,间接化学反应发光 A + B C* + D C* + E E* + C E* E + h,化学发光效率,化学效率：,发光效率：,dc/dt 分析物参加反应的速率,化学发光强度与化学发光分析的依据,在化学发光分析中，被分析物相对于发光试剂小得多，对于一级动力学反应：,dc/dt =Kc K 为反应速率常数。定量依据：（1）在一定条件下，峰值光强度与被测物浓度成线性；,（2）在一定条件下，曲线下面积为发光总强度(S)，其与被测物浓度成线性：,三 化学发光的类型,1、液相化学发光,鲁米诺 (luminol),max = 425 nm氧化剂: H2O2 O2 KMnO4 NaClO I2 Fe(CN)63-.催化剂: 过氧化酶 氧化血红素 过渡金属离子(Co2+、 Cu2+、 Fe3+ etc.),（3-氨基苯二甲酰肼）,化学发光反应效率：0.150. 05,光泽精 (lucigenin),max = 440 nm(绿色)氧化剂: H2O2 还原剂 + O2 还原剂: 乳酸 尿酸 抗坏血酸催化剂: 过渡金属离子抑制剂: 酚类物质对此反应有抑制作用,过氧化草酸酯 (peroxyoxalates),氧化剂: H2O2此反应本身能产生弱的化学发光. max = 440 nm, 550nm.,邻菲罗林 (1,10-phenanthroline),氧化剂: H2O2 催化剂: Cu2+ Co2+ Pb2+ Fe3+ Ni2+抑制剂: 蛋白质与Cu2+形成络合物,2、气相化学发光,a. 一氧化氮与O3的发光反应 NO + O3 NO2* NO2* NO2 + h 发射的光谱范围：600875nm，灵敏度1ng/cm-3；b.氧原子与SO2、NO、CO的发光反应 O3 O2 + O （1000 C石英管中进行） SO2 + O + O SO2* + O2 SO2 * SO2* + h 最大发射波长：200nm；灵敏度1ng/cm-3；,. 乙烯与O3的发光反应,乙烯与O3反应，生成激发态乙醛：,CH2O* CH2O + h 最大发射波长：435nm；对O3的特效反应；线性响应范围1 ng/cm-3 1g/cm-3；,四 、化学发光的仪器,装置流程：,发光反应可采用静态或流动注射的方式进行： 静态方式：用注射器分别将试剂加入到反应器中混合， 测最大光强度或总发光量；试样量小，重复性差； 流动注射方式：用蠕动泵分别将试剂连续送入混合器，定时通过测量室，连续发光，测定光强度；试样量大；,化学发光分析的特点,优点: 灵敏度高, 线性范围宽；仪器简单, 价格便宜；分析时间短。缺点: 选择性差。,五、化学与生物发光分析的应用,（1） 该发光反应速度慢，某些金属离子可催化反应；利用这一现象可间接测定这些金属离子。可测痕量的Cu2+ 、Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等（2） 可检测低至 10-9 mol/L 的H2O2；（3） 间接测定某些生物试样,氨基酸 + O2 酮酸 +NH3 + H2O2,葡萄糖 + O2 + H2O 葡萄糖酸 + H2O2 通过测定生成的H2O2 ，确定氨基酸、葡萄糖含量。,Thank you!,
