第二章沉淀法课件.ppt

第二章 沉淀法,什么是沉淀法？沉淀法纯化蛋白质的优点有哪些？常用的沉淀方法包括哪些？何谓盐析？其原理是什么？常用的盐是什么？影响盐析的主要因素有哪些？有机溶剂沉淀法的原理是什么？影响有机溶剂沉淀的主要因素有哪些？等电点沉淀的原理是什么？,通过本章学习应掌握以下内容,1、沉淀：利用沉析剂使生化物质在溶液中的溶解度降低而形成无定形固体沉淀的过程。2、沉淀法的目的：通过沉淀达到浓缩的目的；沉淀法可有选择地沉淀杂质或有选择地沉淀所需成分，初步纯化 ；将已纯化的产品由液态变成固态，加以保存或进一步处理。沉淀法是最古老的分离和纯化生物物质的方法，目前仍广泛应用在工业上和实验室中。,一、概述,生物分子在水中形成稳定的溶液是有条件的，这些条件就是溶液的各种理化参数。任何能够影响这些条件的因素都会破坏溶液的稳定性。沉淀法基本原理就是采用适当的措施改变溶液的理化参数，控制溶液中各种成分的溶解度，根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。溶剂组分的改变、改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。,3、沉淀法的原理,沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行，得到的沉淀物可直接干燥制得成品或经进一步提纯，如透析、超滤、层析或结晶制得高纯度生化产品。操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：,4、沉淀法的操作, 首先加入沉淀剂; 沉淀剂的沉化，促进粒子生长； 离心或过滤，收集沉淀物。加沉淀剂的方式和控制条件对产物的纯度、收率和沉淀物的形状都有很大影响。,5、沉淀法的步骤,沉淀法不仅可以用于实验室中；也可广泛用于生产的制备过程。因其不需专门设备，且易于放大，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。,6、沉淀法的应用,优点：操作简单、经济、浓缩倍数高。缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强。,7、沉淀法的优缺点,根据所加入的沉淀剂的不同，沉淀法可以分为：（1）盐析法；（2）等电点沉淀法；（3）有机溶剂沉淀法；（4）亲和沉淀法；（5）选择性沉淀法。（6）复合盐沉淀法；（7）非离子型聚合物沉淀法；（8）聚电解质沉淀法；,8、沉淀法的分类,二、蛋白质的溶解特性,蛋白质是由疏水性各不相同的 20 种氨基酸组成的两性高分子电解质，形成荷电区。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面，形成亲水区。因此，蛋白质由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区。,蛋白质的溶解行为,蛋白质的溶解行为由其组成、构象以及分子周围溶液性质所决定。蛋白质在自然环境中通常是可溶的，其外部大部分是亲水的，内部大部分是疏水的。一般而言，小分子蛋白质比在类似的大分子蛋白质更易溶解。,防止蛋白质凝聚沉淀的屏障, 蛋白质周围的水化层。 保护了蛋白质粒子，避免了相互碰撞，使蛋白质形成稳定的胶体溶液。 蛋白质两性电解质，分子间静电排斥作用（存在双电层）。蛋白质粒子在水溶液中是带电的，带电的原因主要是吸附溶液中的离子或自身基团的电离。蛋白质表面的电荷与溶液中反离子的电荷构成双电层。,三、盐析Salt induced precipitation,1、定义,概念：在高浓度的中性盐存在下，蛋白质（酶）等生物大分子物质在水溶液中的溶解度降低，产生沉淀的过程。盐析是可逆的，而变性是不可逆的早在1859年，中性盐盐析法就用于从血液中分离蛋白质，随后又在尿蛋白、血浆蛋白等的分离和分级中使用，得到了比较满意的结果。,2、盐析法机理,（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。（2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。（3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。,3、盐析过程,当中性盐加入蛋白质分散体系时可能出现以下两种情况：（1）“盐溶”现象(salt-in)低盐浓度下，增加蛋白质分子间静电斥力，蛋白质溶解度增大。（2）“盐析”现象(salt-out)高盐浓度下，中和电荷、破坏水化膜，蛋白质溶解度随之下降。,盐析作用要强盐析用盐需有较大的溶解度盐析用盐必须是惰性的来源丰富、经济,4、盐析用盐选择原则,在相同离子强度下，盐的种类对蛋白质溶解度的影响有一定差异，一般的规律为：半径小的高价离子的盐析作用较强，半径大的低价离子作用较弱。阴离子盐析效果 ：柠檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3-阳离子盐析效果：NH4+ K+Na+ 阴离子的影响大于阳离子,盐析中常用盐：硫酸铵、硫酸钠、磷酸钾、磷酸钠硫酸铵是最常用的蛋白质盐析沉淀剂（1） 价廉 ；（2） 溶解度大，温度系数小，许多蛋白质可以盐析出来；（3） 硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好；（4） 不易引起蛋白质变性。,5、盐析常用的盐,6、盐析操作(加盐方式）,硫酸铵的加入有以下几种方法：1）加入固体盐法 用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况；工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高；2）加入饱和溶液法 用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况；它可防止局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。3）透析平衡法 先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，袋内饱和度逐渐提高，达到设定浓度后，目的蛋白析出。该法优点在于硫酸铵浓度变化有连续性，盐析效果好，但程序烦琐，故多用于结晶。,一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 组成相近的蛋白质，分子量越大，沉淀所需盐的量越少；蛋白质分子不对称性越大，也越易沉淀。,7、盐浓度对盐析效果的影响, S=-sS蛋白质的溶解度，g/L; I离子强度I=1/2mizi2 ,mi离子 i的摩尔浓度；Zi所带电荷常数，与温度、pH和蛋白质种类有关，与盐的种类无关；Ks盐析常数，与温度和pH无关，但与蛋白质和盐的种类有关。,蛋白质溶解度与盐浓度的关系Cohn经验式,有时为简单计，也可以用浓度代替离子强度，则上式成为,（用浓度代替离子强度）,式中m为盐的摩尔浓度.,8、用盐析法分离蛋白质的二种方法,盐析法分为两类，第一类叫分段盐析法，在一定离子强度下通过改变pH和温度来实现，（固定离子强度，改变pH及温度），由于溶质溶解度变化缓慢，且变化幅度小，因此分辨率更高，用于后期进一步分离纯化和结晶；第二种叫Ks分段盐析法，在一定pH和温度下通过改变离子强度实现，（固定pH, 温度，改变盐浓度），由于蛋白质对离子强度的变化非常敏感，易产生共沉淀现象，用于早期的粗提液。,由于不同的蛋白质溶解度不同，沉淀时所需的离子强度也不相同。改变盐的浓度，可将混合液中的蛋白质分批盐析分开。,分段盐析原理,分段盐析的条件先需要进行小实验探索。 先进行0%-30%的硫酸铵沉淀，再进行30%-60%的硫酸铵沉淀，最后进行60%-80%的硫酸铵沉淀。 每一段盐析静置之后都要离心获得沉淀，透析并检测活性。 比如实验中的活性物质主要在60%-80%盐析出来，在以后的实验中，就可以首先进行0%-60%的硫酸铵沉淀，这段沉淀物可以抛弃（去除大多数杂质）；然后进行60%-80%的硫酸铵沉淀，这段沉淀物含有大量目的蛋白质，将其收集进行下一步纯化工作。,分段盐析步骤,9、盐析用盐量的确定-饱和度,饱和度的概念： 以硫酸铵为例：250C时，硫酸铵的饱和溶解度是767g/L定义为100%饱和度。目标蛋白质的盐析沉淀操作之前，所需的硫酸铵浓度或饱和浓度可通过实验确定。对多数蛋白质，当达到85%饱和度时，溶解度都小于 0.l mgL，通常为兼顾收率与纯度，饱和度的操作范围在40%-80%之间。,调整硫酸铵溶液饱和度计算表,10、盐析的影响因素1）pH值,一般来说，蛋白质所带净电荷越多溶解度越大，净电荷越少溶解度越小，在等电点时蛋白质溶解度最小。为提高盐析效率，多将溶液pH值调到目的蛋白的等电点处。 注意在水中或稀盐液中的蛋白质等电点与高盐浓度下所测的结果是不同的，需根据实际情况调整溶液pH值，以达到最好的盐析效果。,H值,PH,两种蛋白质的相对溶解度会随pH而变化很大； 等电点附近有极小值,pH,在进行盐折时，必须控制pH图中直线都相互平行Ks,H值,2）温度的影响,在低离子强度或纯水中，蛋白质溶解度在一定范围内随温度增加而增加。但在高盐浓度下，蛋白质、酶和多肽类物质的溶解度随温度上升而下降。在一般情况下，蛋白质对盐析温度无特殊要求，可在室温下进行，只有某些对温度比较敏感的酶要求在0-4进行。随温度升高减小Ks不随温度而变,3）蛋白质浓度,沉淀蛋白质盐的浓度范围并不是固定的，而是和起始浓度有关。高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，若蛋白浓度过高，会发生严重共沉淀作用，除杂蛋白的效果会明显下降。在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，共沉淀作用比较少，但回收率会降低。因此需要在两者之间进行适当选择。分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。相当于25 mg/mL30mg/mL。,对起始浓度为 30g/L的COMb溶液，大部分蛋白质在硫酸铵饱和度为 58-65之间沉淀出来；但对稀释10倍的 COMb溶液，饱和度达到66%时才开始沉淀，而相应的沉淀范围为66-73%饱和度。,11、盐析注意事项,选择适宜饱和度采用分步盐析盐析的成败决定于溶液的pH值与离子强度，稳定pH 用磷酸缓冲液在加入盐时应该缓慢均匀，搅拌也要缓慢，越到后来速度应该更注意缓慢，如果出现一些未溶解的盐，应该等其完全溶解后再加盐，以免引起局部的盐浓度过高，导致酶失活。盐析后最好缓慢搅拌一个小时而且再在冰浴中放置一段时间。为了避免盐对酶的影响，一般脱盐处理后再测酶活性。盐析后的蛋白质最好尽快脱盐处理，以免变性，透析较慢，一般可用超滤,盐析注意事项,硫酸铵的使用硫酸铵中常含有少量的重金属离子，对蛋白质巯基有敏感作用，使用前用H2S处理高浓度的硫酸铵溶液一般呈酸性（pH=5.0左右），使用前也需要用氨水调节至所需pH。硫酸铵容易吸潮，计算饱和度需注意固体硫酸铵加入后体积变大加入固体盐后体积的变化已考虑在表中；盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心。过滤多用于高浓度硫酸铵溶液，因为此种情况下，硫酸铵密度较大，若用离心法需要较高离心速度和长时间的离心操作，耗时耗能。离心多用于较低浓度硫酸铵溶液。,12、盐析法特点,成本低，不需要特别昂贵的设备。操作简单、安全。不会引起蛋白质变性，经透析去盐后，能得到保持生物活性的纯化蛋白质。分离效果不理想，通常只是作为初步的分离纯化，还需要结合其它的纯化方法。,四、等电点沉淀法 isoelectric point precipitation,1、定义和原理,在低的离子强度下，调pH至等电点，使蛋白质净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。生产胰岛素（pI5.4）时，在粗提液中先调pH8.0去除碱性蛋白质，再调pH3.0去除酸性蛋白质。,pH=pI,大豆蛋白的溶解度随pH的变化情况,2、等电点沉淀法注意事项,本法适用于憎水性较强的蛋白质，例如酪蛋白在等电点时能形成较大的凝聚物。但对一些亲水性强的蛋白质。则在低离子强度的溶液中，调pH在等电点并不产生沉淀。等电点沉淀法往往不能获得高的回收率，通常与其他沉淀方法结合使用；在调节等电点时，如果采用强酸强碱，要注意防止酶的失活或蛋白变性。为了使pH缓慢变动，也可用乙酸等弱酸和碳酸钠等弱碱。中性盐浓度增大时，等电点向偏酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。,五、有机溶剂沉淀法organic solvent precipitation,概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较早使用的沉淀方法之一。,1、有机溶剂沉淀法定义,2、有机溶剂沉淀法机理,A 降低溶剂介电常数（介电常数D有机 D水） 减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间作用力，增加了蛋白质等带电粒子相互吸引力，聚合沉淀。B 破坏水化膜： 由于使用的有机溶剂与水互溶，它们在溶解于水的同时从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层，使蛋白质沉淀。C 相反力：疏水基团暴露并与有机溶剂疏水基团结合形成疏水层,3、常用的有机溶剂,选择依据：水溶性要好介电常数要小致变性作用要小毒性要小容易获取，成本低沉淀蛋白质常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸常用的是乙醇。乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒， 是最常用的有机沉淀剂；丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广。,1、温度使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行有机溶剂与水混合时，会放出大量的热量，使溶液的温度显著升高，增加有机溶剂对蛋白质的变性作用，有机溶剂要缓缓加入，防止溶液局部升温。温度还会影响有机溶剂对蛋白质的沉淀能力，一般温度越低，沉淀越完全。 因此，有机溶剂须预先冷却到-10-20；在使用有机溶剂沉淀生物高分子时，整个操作过程应在低温下进行 。,4、有机溶剂沉淀法的影响因素,2、pH值： pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。 3、样品浓度：样品较稀将增加有机溶剂投入量和损耗；样品太浓会增加共沉作用。蛋白质的初浓度以0.52为好，粘多糖则以12较合适。4、中性盐浓度：较低浓度中性盐有利于沉淀作用，减少蛋白质变性,以0.010.05M为好，常用为醋酸钠/铵、氯化钠等。 5、某些金属离子：一些金属离子如Ca2+、Zn2+等可与蛋白质形成复合物，溶解度降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成。,优点：分辨能力比盐析法高，即某一种蛋白质只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；沉淀不用脱盐，过滤较为容易；缺点：对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作要求在低温下进行。成本高总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。,5、有机溶剂沉淀法的特点,举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取-淀粉酶（米曲霉）发酵固体 + 水 过滤 水抽提清液 加乙醇（70%）搅拌 -淀粉酶,* pH影响 收率% 酶活 收率 酶活 6. pH * 适宜的pH 5.6 6.0,* 温度影响 收率% 酶活 酶活 收率 10 20 T * 适宜的温度10 20 ,六、 亲和沉淀,亲和沉淀是沉淀分离的一种，将亲和反应的高度选择性、低处理量特性与沉淀操作的大处理量有机结合形成了亲和沉淀技术。定义：利用蛋白质与特定的配基（免疫配体、基质、辅酶等）之间高度专一的相互作用而设计出来的一种特殊选择性的分离技术。其沉淀原理与通常的沉淀方法有很大的不同：不是依据蛋白质溶解度差异，而是依据“吸附” 蛋白质的特殊聚合物溶解度的大小。,1、定义和原理,2、亲 和 沉 淀过程,配基与载体的选择将配基与可逆溶解载体偶联后形成载体-配基复合物，将目标蛋白质与键合在可溶性载体上的亲合配基络合形成复合体；改变溶液条件，使复合体沉淀析出；所得沉淀物用一种适当的缓冲溶液进行洗涤，洗去可能存在的杂质；用一种适当的试剂将目标蛋白质从配位体中离解出来。,举例：胰蛋白酶的亲和沉淀,配基（大豆胰蛋白酶抑制剂）固定于载体（聚合脂质体-醇磷脂乙醇胺）胰蛋白酶粗溶液加入一定量聚合物溶液进行吸附；加入0.2MNaCl使复合体沉淀0.01 M NaOH洗脱沉淀，释放胰蛋白酶,七、选择性变性沉淀法,概念：选择一定的条件使溶液中存在的某些杂蛋白等杂质变性沉淀下来，而与目的物分开。原理：利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。方法：）利用对热的不稳定性,加热破坏某些组分，而保存另一些组分；）酸碱变性。 ）利用表面活性剂(三氯乙酸)或有机溶剂引起变性；,1、定义、原理和方法,选择性变性沉淀法是使杂质变性沉淀，又对目的物没有明显影响，所以在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂质的种类、含量及其物理化学性质等有比较全面的了解。例如对于-淀粉酶等热稳定性好的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂蛋白受热变性沉淀而被除去。,2、选择性变性沉淀法,酚、氯仿、十二烷基磺酸钠等目的是使核酸和蛋白质分离，蛋白质变性沉淀，核酸则存在于水溶液中。在核酸提取液中加入氯仿-戊醇，振荡一段时间、使蛋白质在氯仿-水的界面上形成沉淀而被除去，核酸仍然留在水溶液中。在DNA、RNA混合溶液中，用异丙醇选择性地沉淀DNA，而RNA留在溶液中。,举例：选择性沉淀法分离核酸,各种沉淀方法应用范围,盐析法：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。有机溶剂沉淀法：多用于生物小分子、多糖及核酸的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。等电点沉淀法：用于氨基酸、蛋白质等两性物质的沉淀。多与其它方法结合使用。亲和沉淀法：具有特定配基的蛋白质。选择性沉淀（热/酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。,八、沉淀法应用,鸡卵清中提取鸡卵类粘蛋白第一步:粗提,鸡卵类粘蛋白是一种糖蛋白，它具有强烈的抑制蛋白酶的作用，常用于胰蛋白酶的酶学性质的研究，也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效的分离与纯化胰蛋白酶。另外，还可用于分离纯化麦胚凝集素。,原理,鸡卵类粘蛋白在中性及偏酸性溶液中较稳定，对热、高浓度脲及有机溶剂均有较高的耐受性，在10三氯乙酸或50丙酮溶液中有较好的溶解度。本实验采用选择性变性沉淀、凝胶过滤柱层析、离子交换柱层析等方法分离纯化鸡卵类粘蛋白。,在鸡蛋蛋清中，加入 10TCA溶液作为初步分离，在pH3.5的条件下，杂蛋白变性沉淀，离心后，上清液中含有鸡卵类粘蛋白。,1) 取1个鸡蛋蛋清，加入等体积的10TCA溶液，充分搅匀后，测定溶液的pH值（精密pH试纸），若偏离3.5，用10 NaOH 溶液调pH3.5，室温静置4h以上。,步骤,2) 3000r/min离心10min 。收集清液，再用滤纸过滤并检查滤液的pH值是否3.5，若不是，则要调整。滤液量体积后转入500 mL烧杯内，缓慢加入3倍体积冷丙酮，搅匀，用塑料薄膜封严，置冰箱放置过夜。,3) 小心吸出部分上清液，剩余浑浊液转入50mL离心管中， 3500r/min 离心10min，弃清夜，将沉淀抽真空去净丙酮。,思考题,1、什么是沉淀法，具体包括哪些方法？ 2、理解概念：硫酸铵饱和度，盐溶， 盐析3、盐析的机理是什么？ 4、影响盐析的因素有哪些？ 5、有机溶剂沉淀蛋白质的机理什么？6、用乙醇沉淀蛋白质时应注意哪些事项？7、何为选择性变性沉淀法？,