第二章TEM原理与结构new课件.ppt

第二章透射电镜的结构与成像原理,第一节 透射电镜的结构,一、电子光学系统,二、真空系统,三、供电系统(电子学系统),电镜的组成(一）,电镜的组成（二）,高压电缆,电子枪室,第一、二聚光镜,光阑,样品臂,物镜,中间镜,投影镜,观察窗,荧光板,底片盒,TEM剖面图,观察室,（一）、电子枪 1、电子枪结构 1) 自给偏压式三极电子枪 阴极：尖端发射电子 栅极：控制电子束形状和发射强度 阳极：加速电子、调节电子波长,一、 电子光学系统,电子枪典型结构的主要部件图,电子束形成示意图,灯丝加热温度和发射电流之间的关系,T,I,1、电子枪结构,2) 场发射电子枪,阴极：钨丝针尖阴极，其曲率半径10002000。第一阳极：相对于阴极有一正压，引发阴极场发射并控制发射电流强度。第二阳极：加速电子、调节电子波长,场发射式电子枪,名词： 场发射：在金属表面加上极强的电场之后，金属表面势垒降低,在隧道效应的作用下，金属内部的自由电子穿过势垒从金属表面发射出来，向真空飞去，这种物理现象称为场发射,场发射电子枪特点：亮度高；交叉光斑小，直径1 m，最小30100；能量分散小；寿命长，给定寿命2000小时（实际可用3年左右）；分辨率高，高分辨率的TEM和SEM都采用。,1). 钨丝阴极：热电子发射, 最小交叉斑直径 1050m , 寿命2025h,最长约200h 2). LaB6阴极：低温热电子发射亮度高, 寿命约 1000h,2、电子枪从材料可以分为：,1、磁透镜的汇聚作用2、汇聚作用结论：磁透镜总是汇聚透镜磁场稍有变化，焦距f则有较大变化,磁场强度越强焦距越短透镜的放大倍数越高。（焦度1/fHz2)，且电子加速电压越高，电子速度越快，电子越不被易折射，焦距f就越长,(二)、磁电子透镜,r,Fzr,几何光学作图法,1). 聚光镜 ：汇聚电子束，控制束斑的大小 控制孔径角第一级聚光镜C1：短焦距强磁透镜第二级聚光镜C2：长焦距弱磁透镜 2). 物镜作用：形成样品第一级放大的像; 改变其焦距f，对象进行精确聚焦.类型：短焦距强磁透镜,3、TEM的磁透镜,3).与物镜相关的装置 A.物镜极靴 保证磁场的轴对称，防止磁饱和,减少磁场能量的浪费B.物镜可动光阑 30，50，70 m 控制物镜孔径角、减小球差 、增强像的反差C.物镜消像散器 消除像散，提高物镜分辨率D.物镜的散热装置 维持物镜低恒温，减少物镜热漂移,电子束,极靴,电磁线圈,电磁线圈,物镜极靴纵面图,带极靴的磁透镜,4). 中间镜和投影镜 中间镜 类型：长焦距弱透镜 倍率可变 M20， 可设二级 作用：第二次放大图象、控制总放大倍数 投影镜 类型： 短焦距强透镜，可设二级 作用：第三次放大图象,总放大倍数：M总=MO MI MP其中：MO：物镜放大倍数MI ：中间镜放大倍数MP：投影镜放大倍数 物 镜：Objective Lens (OL) 中间镜：Intermediate Lens (IL) 投影镜：Projector Lens (PL),物镜100X,样品,第一级实像,中间镜20X,第二级实像,最终像,投影镜100X,1）位置：聚光镜和物镜之间2）作用：更换样品，承载样品，移动样品3）组成：样品载体，样品架，样品台，样品移动机构，空气闭锁装置，防污染装置4）结构分类： 顶落式：样品台在物镜激励线圈上方，样品架由上而下落入物镜中，稳定度高，可以获得高分辨率图像。 侧插式：样品台在物镜激励线圈下方，样品架由上侧面进入物镜中，结构复杂可以获得最短物镜焦距，常采用,（三）、样品室,防污染装置,冷阱,铜块（-100-150C）,样品,入射电子,空心圆孔,观察装置荧光板 （100,余辉适中） 观察窗 （含铅）双目显微镜（10倍，长焦距）记录装置照相室、曝光操纵杆、自动曝光装置,（四）、观察和记录装置,1.机械泵工作原理 真空度：10-2-10-3Torr1Torr1mmHg=1/760大气压133.3Pa 76010Torr 粗真空 10103Torr 低真空 103108Torr 高真空 108Torr以下 超高真空,二、真空系统,一般采用方式：二级真空系统，由机械泵预抽真空再由机械泵和油扩散泵抽至高真空,1转子 2泵体壁 3刮片 4排气阑 5空隙 6吸入 旋转刮片式低压真空泵截面图,2. 油 扩 散 泵 （10-6-10-7Torr）,电镜要求在高真空下工作的原因：1）电子在平均自由程内，应不与任何粒子发生碰撞，不被散射，可“自由地”到达荧光屏，否则使电子发生散射，引起 “弦 光”并降低成像的反差。2）电子枪负高压引起残余气体分子电离和放电，导致电子束不稳 定或产生“闪烁”现象。3）灼热的灯丝遇到气体会受到腐蚀而容易断裂，减少灯丝寿命，甚至烧断。4）残余气体聚集到样品和光阑上会污染样品表面，增加像散，再次降低像的质量。 所以为了提高图像质量、延长灯丝寿命必须使电镜的镜筒达至一定的真空度。,3. 高真空的必要性,4. 真空系统其它附属装置 1）、检测装置： 热规（Pirani)：粗真空检测（大气103Torr） 冷规(Penning)：高真空检测（103 106 Torr） 离子真空计： 103 107 Torr或以上范围 2）、真空管道 3）、自动阀门系统及安全报警装置,高压电源透镜电源偏转线圈电源消散器电源真空控制电源照相机构电源 总电源：220v2% 稳定,纯净 三大类： A:小电流高电压; B:大电流低电压 C:小电流小电压,三、供电系统（电子学系统）,第二节 TEM的成像原理,一 电子束与样品的相互作用,二 样品的成像过程与成像反差,三 TEM的基本成像过程,（一）电子束与样品的相互作用产生的信息 TEM直接透射电子（TE)非弹性散射电子小角度弹性散射电子SEM俄歇电子（AU）二次电子（SE）背向反射电子（BE）X-ray分析仪X-ray阴极荧光 STEM非弹性散射电子大角度弹性散射电子,一、电子束与样品的相互作用,（二）、与TEM成像有关的信息 （名词）电子散射： 以一定能量入射到样品的电子束，由于受到样品中的原 子核及其核外电子的静电场的作用，使得电子运动方向和速 度发生变化，这种现象称。 1、 透射电子：运动方向和能量基本不变 2、 非弹性散射电子 特点：能量损失，速度改变，散射角小 主要作用：改变入射电子束的方向入射电子能量损失，引起色差（图象模糊） 排除方法：使样品很薄。加大入射电子束能量,3、弹性散射电子特点： 散射角大， 速度大小不变而方向变， 能量 几乎无损失类型小角度弹性散射电子：参与TEM成像大角度弹性散射电子：被光阑挡掉,四个基本物理过程参与成像： 吸收、散射、干涉、衍射 1. 吸收 吸收伴随着热量释放，薄膜样品会烧坏，故尽 量少出现。 2. 散射 原子散射截面：一个电子穿过单位面积样品 时受到一个原子散射的几率，用表示。,二、样品的成像过程与成象反差,（一）、参与成象的四个基本物理过程,弹性散射截面可表示为： （1） Z-样品元素的原子序数，V-入射电子的加速电压结论：电子受重原子（Z大）弹性散射的可能性大，而快速电子受弹性散射的可能性小。,(2),非弹性散射截面可表示为： （2）弹性、非弹性散射面积和Z的关系： （3）结论：电子受重元素比轻元素弹性散射的可能性大。,3. 干涉 一个运动的电子可以看作是一个电子波，它向着电子运动方向以匀速的并随时间做正弦变化的方式前进。像是透射波和散射波的相互干涉后合成的结果.4. 衍射 由于衍射效应，形成Airy盘，可增强像的反差，但降低像的分辨率。,1. 基本概念 1). 振幅反差：人肉眼能分辨出来的光强度的差异 （或叫反差，衬度，振幅差），该反差在TEM中由样 品各部位质量厚度不同引起的透射中的电子波强 度（振幅）变化所提供。 2). 黑白照片的成因 3). TEM的反差: 由散射反差和相位反差组成 2. 散射反差 （基于电子束的粒子性） 质量厚度：样品的密度和厚t的乘积，单位g/cm2 入射电子在运行过程中 ，总散射量与样品的质量 厚度成正比。,（二）、图像反差形成机理,均匀自然光线,密度均一的玻璃板,t大的区域,t小的区域,暗区,亮区,散射反差示意图,t大的区域 ， 产生大角度的弹性散射电子 暗区 t小的区域 ， 产生小角度的弹性散射电子 亮区 散射反差结论：t成像电子束 弱，其对应区域像暗t成像电子束 强，其对应区域像亮 或者：暗区 高Z,大t亮区 低Z,小t 注:暗区：指像上的相应区域高 Z： 原子序数高的元素，即对应样品中 元素序数大或致密区域,3. 相位反差(位相反差) (基于电子束的波动性） 透射波：由TE组成，V不变 散射波：非弹性散射，散射角小，V 相位反差：入射束中个电子与样品作用的散射波与透射波的相位差不同，相位差为奇数倍时，两者合成波为极小值，为 的偶数倍时合成波为极大值，样品内的微观结构决定了散射波的分布强度，从而在图像上就出现了明暗不同的区域（干涉强度），该反差称为相位反差。,结论： 电镜的反差是：散射反差和位相反差的 综合效应大结构:（t5070nm),散射反差为主小结构:（t50nm),位相反差为主特小结构:（d1nm,t10nm),唯一的反差： 位相反差,4、提高反差的方法 操作电镜缩小孔径角降低加速电压暗场观察离焦反差 其中： （由卢瑟福散射定律推出） DN/N ：被光阑挡掉的电子的机率 Z ：原子序数 e：电子电量 ：孔径角 V： 电子加速电压 M：样品原子量 N0：阿伏伽德罗常数,dN/N=C*t 即t dN/N 从比较大的t值与很小的t值间, t越大, 结论: dN/N越大,像的反差越强,dN/N=10,dN/N=5,dN/N=1,反差大,反差小,同理可得:越小，C越大， t稍有变化，dN/N就有很大变化，即 dN/N越大、像的反差增大V越小，像的反差增大 暗场观察,b,c暗场照明,离焦反差 费涅耳环（条纹）： 当光照射到一个障碍物边缘时，在该边缘会产生一个次级波， 它与入射波发生干涉作用，在障碍物的边缘处产生明暗相间 的干涉条纹。,费涅耳环： 欠焦时 亮线 过焦时 暗线 正焦时 消失 故正焦时 图象的反差最小, 提高样品本身的质量厚度差别 电子染色正染色，负染色超薄切片染色原则: 生物样品不同区域不同组份对重金属离子的结合力不同,t越大,结合重金属离子越多; 金属投影 增加厚度（100nm,一般5070nm) 优点：适当的厚度可以提高样品反差 缺点：产生色差使样品发热、膨胀，导致图像漂移、模糊引起图像叠加，混杂不清，背底昏暗,三 TEM的基本成像过程,电子束的产生 聚光镜 汇聚电子束 作用于样品交互作用 产生带有样品信息的信号物镜 初像中间镜和投影镜 终像 荧光板显像,第三节 TEM的性能与应用,一 分辨率与放大倍数,二 透射电镜的其它性能指标,三 适用于透射电镜的样品,一 分辨率与放大倍数,（一）. 分辨率 定义：指可以辨别的两点之间的最短距离， 用表示肉眼0.10.2mm光镜0.10.2m电镜12 1. 光镜分辨率局限性光具有波粒二相性光镜中，用可见光，=400800nm衍射：波遇到障碍物时能偏离直线传播的性质,光的衍射现象,?,光线拐弯了！,衍射现象：光波偏离直线传播而出现光强不均匀分布的现象,能量占全部光能量的84,瑞利判据表明：两衍射斑中心之间重叠区的最 小光强是最大光强的81%时人眼恰可分辨。,瑞利（Rayleigh）判据（由E.Abbe.德国衍射理论归纳而得） 0.61/n*sin :光在真空中的波长：孔径角（半张角）n:透镜与物体之间介质的折射系数n*sin (NA):数值孔径 技术上NAmax=1.5 opt=0.4 紫外线=13390nm,该判据表明:当且仅当物体上两点之间的距离d大于或等于等式右边所规定的量时，才被看作是分开的两个点,2. TEM的分辨率 A. 提高TEM的分辨率的途径缩短波长:提高加速电压增加数值孔径：增加孔径角大小 其中: Vr：经过相对论修正的电压值 V0：加速电压（Kv),表格 结论: 加速电压V ，波长 ， 电子速度 ,B 像差 定义：电子光学系统偏离理想的成像系统，从而引起的图像也偏离理想成像，导致图像模糊不清或发生畸变的这种现象称为像差。 理想成像的含义：透镜对物（样品）是理想状态的，像与物是一一对应的关系。 理想的成象系统需具备的条件： 磁场分布是严格地旋转轴对称； 满足旁轴条件，即物点离轴很近，以及电子射线与轴线的夹角很小； 电子的初速度及经加速后的速度都相等。 像差的分类： 球差(s),像散(a)，色差(c)， 衍射差(d)，畸变, 球差： 定义:远轴电子通过透镜时，被折射的程度大于近轴电子，像点附近 产 生了弥散状的小球,像平面上看不到清晰的一点而是得到一个模糊的圆，这种现象称为。 大孔径角的电子f小，电子汇聚快 小孔径角的电子f大，电子汇聚慢球差半径: sCs3 式中:Cs:球差系数; :物方的孔径角 若Cs 、 ,则 s 强磁透镜，焦距较短， Cs很小 最小模糊圆的半径: s0.25Cs3,Cs,像散：磁场不是绝对轴对称的，造成磁透镜两 个不同方向的焦距不同 图示：通过AB面的电子束在f1聚焦 通过CD面的电子束在f2聚焦 f2f1时： AB面正焦，CD欠：CD正，AB欠 分类：残余像散（用消像散器消除）， 二次像散（清洗） 消像散器的工作原理：在透镜磁场中，用消散 仪产生一个弱的柱面磁场，并调节它，使之与要校正的像散大小相等、方向相反，从而抵消残余像散。,畸变：由于透镜边缘部分比中心部分的聚焦能力强， 致使物体上各点像的放大倍数，随着物点离轴 的径向距离的不同而变化 畸变程度： (Rd)=CdR03 分类：桶形畸变：Cd0,离轴越远，物点放大倍数旋转畸变：由于球差的存在使电子束角度随着 离轴距离而变化扭曲畸变： （桶或枕）旋转 注： 畸变只是像的比例失调，图像是清楚的, 色差： （波长差） 定义：由于电镜加速电压波动导致电子束波长发 生变化，使得入射电子速度不一致，与速度 相应的电子波长也有一定的分散度，从而引 起的一种像差。 原理： V， ， 电子越不易折射，焦距f大 V ， ， ，电子越易折射，焦距f小 同理： （光镜） 红光偏折最小，红光焦长 紫光偏折最大，紫光焦短 分类： 中心色差，放大色差，旋转色差， 放大旋转色差,形成色差的原因： f =Cc(V/V- 2I/I) 式中: f:焦差； Cc：色差系数 V/V：加速电压相对起伏 I/I：透镜激励电流相对起伏加速电压的变化透镜激励电流变化电子与样品的交互作用 减小色差的方法：稳定加速电压和透镜激励电流106min，减小光阑直径（即孔径角）样品做薄，提高加速电压，使电子穿过样品的速度变化小。采用电子速度过滤器，减少参与成像电子速度分布,C. TEM最佳分辨率 电镜的分辨率主要取决于物镜的分辨率 物镜的分辨率取决于：衍射差：d0.61/nsin=0.61 / 球差: sCs3色差、像散：可以忽略 只考虑衍射差和球差的综合效应 最佳1.1(/ Cs)1/4 opt=0.65(Cs 3) 最佳=0.2nm,实际 (s2+ d2+ a2+ c2)1/2 一般TEM0.51nm（二） 有效放大倍数：植物细胞直径100m动物细胞1020 m细菌的直径1 m病毒直径10100nm生物大分子110nm小分子0.11nm原子直径0.1nm M有效 肉眼仪器,二 透射电镜的其它性能指标,1. 场深：也称景深，指在保持像清晰度的条件下，物面允 许移动的距离。 Dfi=/ 特点：场深大, 可达1 m 容易聚焦，物面位置允许有Dfi长度的误差 对于厚度小于场深的样品，都能获得高分辨率 图像，尤其适合复型样品；但同时也导致图像 上下叠加背底昏暗2. 焦深：在保持像清晰度的条件下,像面许移动的距离 Dfo=M2* Dfi 特点：焦深大,M=500时，500m，最大可达10000m 照相时非常方便,三 适用于透射电镜的样品,1. 从样品类别上分：超薄切片冷冻蚀刻的复型膜悬浮样品的滴片直接培养的单层细胞 2. 从研究内容上分免疫电子显微技术电镜放射自显影技术电镜细胞化学技术Xray微区分析,免疫电子显微镜技术的定义：(Immune Electron Microscopy: IEM)又叫免疫电镜细胞化学技术，就是将免疫化学技术与电镜技术有机地结合起来，研究抗原抗体相互作用的一种方法。抗原抗体之间的相互作用具有较高的特异性，相互作用后，可直接形成或通过某种标记物形成大分子复合物或聚合物。该生成物具有电子致密性，在电镜下可以观察到，又不影响免疫反应的特异性。那么，就可以在细胞超微结构水平上或分子水平上研究免疫作用。这种在很高分辨本领电镜下非常精确地显示抗原所在位置的方法称为,免疫电子显微镜技术的原理：,用化学方法将不同大小的金粒与特异性抗体球蛋白在不影响特异性蛋白质免疫特性的前提下结合起来，制备成金标抗体(GA)。当GA与相应的抗原(直接法)或抗原抗体复合物(间接法)相遇时，即结合形成免疫金复合物，可用透射电镜观察反应结果：有金粒的地方，即为抗原或抗原抗复合物存在的地方。不同抗原肽以不同种动物供体来的相应标记抗体顺序反应，可在同一组织切片中标记两种抗原肽。抗体以小金粒标记，另一抗体以大金粒标记，在透射电镜下很容易将两者区分开来。 两种抗原肽分别与来自不同种动物供体的抗体发生反应，兔初抗用小粒金标记的猪抗兔IgG检测；而豚鼠初抗IgG用大粒金标记的兔抗豚鼠IgG检测。,举例：,验证植物的胞间连丝组分中，是否有actin（肌动蛋白）和 myosin（肌球蛋白）的存在。,VAP (6-nm gold particles) and MP (18-nm gold particles),A coiled-coil interaction mediates cauliflower mosaic virus cell-to-cell movementLivia Stavolone, Maria Elena Villani, Denis Leclerc, and Thomas HohnPNAS April 26, 2005 vol. 102 no. 17 62196224,作业,1. 名词解释：分辨率 振幅差 场深 焦深透射电镜主要由哪三大系统组成?其中每个 系统主要包括哪些部分?3. 透射电镜工作时为什么要求真空?4. 电子束与样品相互作用后产生哪些信息?其中又有哪些信息与透射电镜的成像有关？5. 生物样品的反差有什么特点? 怎样提高生物样品的反差6. 简述透射电镜的基本成像过程。7. 透射电镜有哪些主要性能。,透射电镜有哪些主要性能： TEM是以电子束作为照明光源的；装有聚光镜、物镜、中间镜、投影镜一系列电磁透镜；其分辨率可达0.10.2nm;有效放大倍数可达100万左右；散射反差和位相反差在其成像反差起主导作用；在放大500倍时其焦深为500 m，场深可达1 m ；图象用荧光板显示，且无色彩；适于100nm的超薄切片、复型膜等；要求样品在真空条件下成像。,