微生物菌种课件.ppt

第二章 微生物菌种选育,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,发酵工程工业生产水平的三个决定要素,生产菌种的性能发酵和提取工艺条件生产设备,获得优良的生产菌种是实现高水平微生物工程工业生产的第一环节.,第一节 菌种来源,工业发酵常见微生物种类 发酵工业上常见的微生物有细菌、酵母、霉菌和放线菌。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,细菌,醋酸杆菌（Acetobacter） ，用于生产醋酸和维生素C。假单胞菌(Pseudomonas)，荧光假单胞菌发酵生产2-酮基D-葡萄糖酸。乳酸菌（Lactobacillus） ，发酵生产乳酸。大肠杆菌（E. coli），生产谷氨酸脱羧酶、天冬酰胺酶、天冬氨酸、苏氨酸和缬氨酸。枯草芽孢杆菌生产淀粉酶、蛋白酶和某些氨基酸、肌苷、5-肌苷酶等。梭状芽孢杆菌生产丙酮-丁醇。北京棒杆菌生产谷氨酸。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,酵母菌,酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：发面和酿酒及分子生物学用。假丝酵母属（Candida）：生产SCP。汉逊氏酵母属：产乙酸乙酯。毕赤酵母属（Pichia）：工业污染菌。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,霉菌,曲霉属（Aspergillus）：黑曲霉（A. niger）生产柠檬酸、草酸、葡萄糖酸、糖化酶、酸性蛋白酶、果胶酶、单宁酶等；米曲霉（A. oryzae）用于酿酒和L-乳酸生产。青霉属（Penicillum），生产青霉素，桔青霉（P. citrinum）可产生5磷酸二酯酶，降解核糖核酸为四个单核苷酸。根霉属（Rhizopus ）用于米酒和黄酒生产， 还用于淀粉糖化菌、有机酸发酵及甾体转化。毛霉（Mucor）产生蛋白酶，生产腐乳、酱 油，进行甾体转化。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,放线菌,最大的经济价值在于产生多种抗生素链霉菌（Streptomyces）,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,放线菌（链霉素四环素；红霉素等）,真菌（青霉素、头孢等）,一些产芽孢的细菌,植物或动物来源,食用菌和藻类,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,工业微生物来源,想菌种保藏机构索取有关的菌株，从中筛选所需菌株。从自然界采集分离。从一些发酵制品中分离目的菌株。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,微生物菌种的选择性分离,工业化菌种的要求能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物；有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强；遗传性能要相对稳定；不易感染它种微生物或噬菌体；产生菌及其产物的毒性必须考虑（在分类学上最好与致病 菌无关）； 生产特性要符合工艺要求。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,菌种分离的一般过程,土样的采取, 富集, 分离, 目的菌的筛选,如何使样品中所含微生物的可能性大,如何在后续的操作中使这种可能性实现,目的：高效地获取一株高产目的产物的微生物,问题：,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,调查研究（包括资料查阅）,筛 选 工 作 程 序,分离与筛选的设计要求,在筛选所需菌株时应考虑以下一些重要指标：,1、菌的营养特征,一般要求采用廉价的培养基或使用来源丰富的原料,2、菌的生长温度,3、菌的稳定性,4、菌的产物得率和产物在培养液中的浓度,5、菌对所采用的设备和生产过程的适应性,6、容易从培养液中回收产物,3-6是用来衡量菌种的生产性能，如能满足这几条，便有希望成为效益高的生产菌株,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,较复杂；应根据分离目的灵活掌握,土壤（丰富、 5-25cm、土质、酸碱度、植被状况、地理条件、季节）,食品 、海水、动物、植物、极端环境,根据微生物的营养类型采样,森林土中有相当多枯枝落叶和腐烂的木头，富含纤维素，适合利用纤维素作碳源的纤维素酶产生菌生长。,肉类加工厂附近、饭店排污沟，易分离到蛋白酶和脂肪酶产生菌。面粉加工厂等场所易分离到产淀粉酶、糖化酶的菌,根据微生物的生理特性采样,筛选高温酶产生菌通常从温泉、火山爆发处、堆肥等采样；,筛选产低温酶的微生物，可从冰窖、南极、深海等采样分离耐高渗透压酵母菌，可到甜果、蜜饯、甘蔗渣堆积处采样,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,采样时要注意的问题,富集的三种方案：,定向培养:采用特定的有利于目的微生物富集的 条件（加热、膜过滤等），进行培养。,目的微生物富集的一些基本方法,富集的目的：,让目的微生物在种群中占优势，使筛选变得可能。,当不可能采用定向培养时，则可设计在一个分 类学中考虑，,不能提供任何有助于筛选产生菌的信息，这 时只能通过随机分离的办法,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,定向培养的富集方法,1、底物,2、pH条件,3、培养时间,4、培养温度,等一切能提高目的微生物相对生长速度的手段，培养（固体、液体；分批连续）后使目的微生物在种群中占优势。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,目的菌的分离和筛选,从产物角度出发,在培养时以产物的形成有目的的设计培养基,利用简单、快速的鉴定方法，如抗生素,从形态的角度,菌落的外观形态，是微生物的一个重要表征。如多糖产生菌在适当的培养基上生长，从具有粘液性的菌落外观上就可以初步识别。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,透明圈法,分离水解酶产生菌时较多采用，如蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、核酸酶等；,在平板培养基中加入溶解性较差的底物，使培养基混浊； 能分解底物的微生物便会在菌落周围产生透明圈，圈的大小初步反应菌株利用底物的能力。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,土壤经巴氏消毒，以减少不产芽孢的微生物；然后铺在pH8-9的琼脂培养基（含有均匀的不溶性蛋白质）表面；碱性蛋白酶产生菌能消化平板上的不溶性蛋白质，产生一透明圈。,例如用此法分离产生碱性蛋白酶的芽孢杆菌,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,分离某种产生有机酸的菌株时，也通常采用透明圈法初筛 在选择培养基中加入碳酸钙，使平板呈混浊状，产酸菌能够把菌落周围的碳酸钙水解，形成清晰的透明圈。 透明圈的大小不能完全作为选择高产菌的依据，因为在深层培养中的产酶单位与平板上圈的大小之间并不完全成正比。 但作为初筛的手段是有意义的,如何分离磷细菌？,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,变色圈法,对于一些不易产生透明圈产物的产生菌，可在底物平板中加入指示剂或显色剂，使目的微生物菌落周围呈现变色圈，从而能被快速鉴别出来；,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,用含0.2%果胶为唯一碳源的培养基平板，对含微生物样品进行分离，待菌落长成后，加入0.2%刚果红溶液染色4h，具有分解果胶能力的菌落周围便会出现绛红色水解圈。,如 筛选果胶酶产生菌,甘油三丁酸酯为底物罗丹明B为指示剂荧光圈,又如 分离解脂微生物,豆油作底物中性红（红黄. 6.88.0. ）指示菌落周围呈红色圈,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,生长圈法, 通常用于分离筛选氨基酸、核苷酸和维生素的产生菌,将待检菌涂布于高浓度工具菌并缺少所需营养物的平板上进行培养，若某菌株能合成平板所需的营养物，在该菌株的菌落周围便会形成一个混浊的生长圈, 工具菌（指示菌）是一些相对应的营养缺陷型菌株,如 嘌呤营养缺陷型大肠杆菌与不含嘌呤的琼脂混合倒平板，在其上涂布含菌样品保温培养，周围出现生长圈的菌落即为嘌呤产生菌,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,抑菌圈法, 常用于抗生素产生菌的分离筛选,据估计，筛选1万个菌株才能得到1株有用的抗生素产生菌；因此，设计一个准确、快速的筛选模型十分重要。抑菌圈法是常用的初筛方法, 工具菌采用抗生素的敏感菌,若被检菌能分泌某些抑制菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,抗生素产生菌的分离,抑菌圈法、扩散法、生物自显影法等,试验菌的选择是关键（关系到灵敏度、活性、抗菌谱等）,采用联合试验菌（枯草杆菌和绿色产色链霉菌或巴氏梭状芽孢杆菌）分离到黄霉素,采用专一性强的筛选技术也是检出新抗生素的有效方法主要是利用抗生素作用机制相关的酶、酶抑制剂、激活剂等建立的筛选技术如棒酸（clavulanic acid）的发现：通过鉴定氨苄青霉素和待测样品对-内酰胺酶产生菌克雷氏菌的协同抑制作用,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,抗肿瘤药物产生菌的分离,临床上有效的抗肿瘤药物大多是直接作用于核酸或抑制核酸生物合成的物质 大部分具有抗菌或抗真菌的活性 现发展出利用微生物筛选作用于DNA 的抗肿瘤药物的方法，如生化诱导分析法,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,酶抑制剂产生菌的分离, 某些酶与病理相关, 如果某种化合物能在体外抑制某关键的人体酶， 它就可能在体内有药理作用, 选择与生理和病理关系明确的酶作为靶酶,靶 区 靶 酶抗高血压 血管紧张素转移酶抗糖尿病 -淀粉酶、蔗糖酶等抗血脂症 缩合酶抗组氨 组氨酸脱羧酶、组氨-N-甲基转移酶,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,生长因子产生菌的分离,通过观察分离菌能否促进营养缺陷型菌株的生长，来检测生长因子产生菌。,分离培养基上培养,被杀死的菌落周围有无检测菌的生长圈,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,第二节 发酵高产菌种选育,菌种选育是应用微生物遗传和变异理论，用人工方法(或自然)造成变异，再经过筛选以得到人们所需菌种的过程 。 菌种选育的目的是为了不断提高发酵工业产品的产量和质量，增加新产品和适应工艺改革的要求。 菌种选育的方向是选育“吃粗粮”、耐高温、生长快、代谢旺、产量高、质量好、无毒性的优良菌株。微生物育种的方法包括自然育种、诱变育种、细胞工程育种和DNA重组技术育种等。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,自然选育,在生产过程中，不经过人工处理，利用菌种的自发突变而进行菌种筛选的过程叫自然选育。,自发突变(spontaneous mutation)，也称自然突变，指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变，但这决不意味着这种突变是没有原因的。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,自然突变两种情况： 生产上所不希望的：菌种的衰退和生产质量下 降 对生产有益的： 生产性能提高,制备单孢子（单细胞）悬液 适当稀释在固体平板上分离挑取部分单菌落进行生产能力测定经反复筛选以确定生产能力更高的菌株替代原来的菌株,自然选育的一般程序,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,自然选育简单易行，可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定生产、提高产量等目的。 自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产水平大幅度提高。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,诱变育种,诱变育种就是人为地利用物理或化学等因素，使诱变对象细胞内的遗传物质发生变化，引起突变，并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。, 诱变育种不仅可以提高菌种的生产能力，且可改进产品质量、扩大品种和简化生产工艺。, 目前发酵工业中应用的生产菌株大部分是诱变育种得来的。以青霉素为例，1943年开始生产时的效价仅为20U/ml，通过多次诱变育种现已达50000-100000U/ml。 虽然遗传工程等新的育种方法迅速发展，但诱变育种仍是目前广泛使用的育种手段。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,诱 变 育 种 的 工 作 程 序,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,1、 出发菌株的选择,选择时注意以下几点：,1）选择对诱变剂敏感性强、变异幅度大的菌株作为出发菌株。,2）最好选用已经过生产选育的自发突变菌株。,3）采用具有有利性状的菌株作为亲本，如生长速度快，营养要求低等。,4）由于有些菌株在发生某一变异后会对其它诱变因素的敏感性提高，故有时可考虑选择已发生其它变异的菌株作为出发菌株。例如，在金霉素生产菌的诱变中，失去（黄色）色素的变异菌株作为出发菌株则产量会不断提高。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,2、单细胞（或单孢子）悬液制备,一般均采用生理状态一致的单细胞或单孢子悬液进行诱变处理。 因为 1）分散状态的细胞可均匀地接触诱变剂；2）可避免长出不纯的菌落 处理前，细胞应尽可能达到同步生长状态， 细胞菌龄一般在对数期，霉菌的菌丝一般是多核的，所以对霉菌的处理一般应采用孢子悬浮液。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,若在处理前细胞进行前培养，则变异率可大大提高。,同步化前培养的具体做法： 接种培养24h的斜面入50ml基本培养基中，37C振荡培养16h，然后在6C放置1h，以得到同步生长和分裂。将菌体离心并悬浮于营养丰富的前培养基中，37C振荡培养30-50min。立即降至2C保藏10min，再离心洗涤两次，悬浮于冷生理盐水中。经分散、过滤、调整细胞密度，制备成菌悬液，供处理用。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,3、诱变剂及使用剂量的选择,凡能引起生物体遗传物质发生变异的因素，统称诱变剂。,如紫外线、X-射线、-射线、快中子、超声波等,硫酸二乙酯(DES)、亚硝基胍 (NTG)、亚硝酸(NA)、氮芥(NM)、羟胺、ICR类等,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,紫外线 (Uv), 使用历史较久、廉价、危险性小、效果好，应用较广 对诱变最有效的波长是260nm左右( 253-265nm) 作用机制主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性,造成菌体变异甚至死亡.,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,快中子, 中子是不带电荷的粒子，可由回旋加速器、静电减速器或原子反应堆产生。 中子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射出质子，因而快中子的生物学效应几乎完全是由质子造成的。 中子分为快中子和慢中子。快中子的能量为0.2-10百万电子伏特，慢中子能量为1/4至100电子伏特。 慢中子的效应同射线、射线和电子等照射时引起的基本相同，快中子较X射线、 射线具有较大的电离密度，因而能更多地引起点突变和染色体畸变。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,氮 芥, 氮芥为极易挥发的油状物，它的盐酸盐是白色粉末，一般使用的是其盐酸盐。 应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠其作用，释放出氮芥子气，再与细胞起作用而造成变异。 氮芥的诱变机制是它能引起染色体畸变。是被使用得最早的一种诱变剂。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,亚硝酸,常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基。,亚硝酸A H （次黄嘌呤）C UG X （黄嘌呤）, 亚硝酸很不稳定，容易分解成水和硝酸酐，硝酸酐继续分解放出NO和NO2。所以，可在临用前将亚硝酸钠放在pH4.5的醋酸缓冲液中，使先生成亚硝酸然后再使用。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,亚硝基胍 (NTG), 是亚硝基烷基类化合物，可诱发营养缺陷型突变，不经淘汰便可直接得到12%至80%的营养缺陷型菌株，有超级诱变剂之称。 在缓冲液中较难溶解，而在甲酰胺中溶解度较大，因此用甲酰胺溶解，可以提高处理浓度。 通常在浓度为30ug/ml、温度为28C和时间为60min的条件下进行处理，容易得到高产菌株 。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,剂 量,确定诱变剂后，诱变剂剂量的选择也是育种工作的一个关键问题。, 对一般微生物而言，诱变率往往随诱变剂剂量的增高而增高，但达到一定程度后，再提高剂量，反而会使诱变率下降。, 目前的处理剂量已从以前采用的死亡率90-99.9%降低到70-80%，甚至更低的剂量，特别是对于经过一再诱变的高产菌株。, 剂量似乎也不宜过低，因为在使用高剂量诱变时，除个别核被诱发变异外，还可以使其它的核破坏致死，最终能形成较纯的变异菌落；另外，高剂量可能引起遗传物质的巨大损伤，产生回复突变少，促使变异后菌株的稳定。,凡既能增加变异幅度，又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适剂量。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,处 理 方 法,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,诱变剂的复合处理及其协同效应,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,4、诱变处理后的后培养,表型迟延现象 生理性 分离性,遗传物质经诱变处理后发生的突变，必须经复制才能表现出来。 研究表明，诱变后的一小时内必须进行新的蛋白质合成，这个变异才有效。 因此必须在完全培养基中进行培养才能稳定变异，使菌株表现出高的突变频率。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,A 不经液体后培养 B 经液体后培养,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,5、变异菌株的筛选,由于经诱变处理后提高产量的变异株仍属少数，所以必须经过大量的筛选工作，才能得到需要的菌株。,初筛 和 复筛,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,在初筛过程中，一般采用观察初筛菌落在平板上的生理效应所呈现的变色圈、透明圈、生长圈或抑菌圈的大小来进行初步测定。,初 筛,要求迅速地从大量菌株中挑选出较好的一些菌，主要应着眼于尽量扩大挑选范围。,例如，测定突变株淀粉酶活力，可把待测菌株的培养液以相同大小和条件浸泡的滤纸片点植于淀粉平板上，经培养后滴加碘液再仔细观察并测定其透明圈的大小。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,部分微生物菌株经过诱变处理后，变异菌株的菌落形态与生理特性、生产性能变化有一定的相关性，可在初筛时加以利用。,赤霉素产生菌 色素 暗红加深，产量上升红霉素产生菌 有颜色 产量下降,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,复 筛,在初筛缩小了的范围中选出产量最高的1-2个菌株，主要着眼于在接近生产条件的情况下精确地测定出菌株的生产性状。,复筛一般是将初筛所得到的菌株接种到三角瓶中做摇瓶培养，然后对其培养液进行定量分析测试。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,设计或采用高效筛选方案或方法,第一轮,第二轮,五个出发菌株,经诱变后，菌种的性能有可能发生各种各样的变异，如营养缺陷、抗性突变、形态变异、生长温度变异等，这些变异均可用各种方法筛选出来。,几种重要突变株的筛选,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,1、营养缺陷型菌株的筛选, 氨基酸、核苷酸生产菌株 等, 影印培养法、夹层培养法、逐个检出法等,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,2、抗性突变株的筛选, 提高某代谢产物的产量,如 抗氯霉素的解烃棒杆菌突变株比亲株产生的棒杆菌素高3倍。（氯霉素是棒杆菌素的结构类似物）,又如，蜡状芽孢杆菌的抗利福平无芽孢突变株的-淀粉酶产量提高了7倍。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,3、温度敏感突变型筛选,TS（Ts; ts）突变株 （temperature-sensitive mutant）, 指仅在某个温度范围内显示与野生型不同表型的突变型。 高温敏感突变型：在某个温度以上显示出和野生型不同表型。 低温敏感突变型：在某个温度以下显示出与野生型不同表型。, 如果发生这类突变的基因控制的特性是生长繁殖不可缺少 的，那么就会形成条件致死突变型。, 温度敏感突变型（高温）是最常用的一类条件致死突变型 基因功能研究、育种,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,许可温度(permissive temperature) 保持原来正常性状的温度限制性温度(restrictive temperature非许可温度 (non-permissive temperature) 显现突变型性状的温度,TS突变株 在许可温度下能正常生长，其表型和野生型没有区别；在非许可温度下不能生长或微弱生长，表性与野生型不同。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,原因: TS突变株的一种重要酶蛋白（例如 DNA 聚合酶、氨基酸活化酶等）在某种温度下呈现活性，而在另一种温度下却是钝化的。 原因是由于这些酶蛋白的肽链中更换了几个氨基酸，从而降低了原有的抗热性。 TS突变株在代谢过程中的各个环节，如核酸合成、蛋白质合成、细胞膜或细胞分裂过程中，某种酶的合成或功能由温度所控制例如，有些大肠杆菌菌株可生长在 37 下，但不能在 42 生长； T4 噬菌体的几个突变株在 25 下有感染力，而在 37 下则失去感染力等。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,菌悬液涂布在完全培养基上，置于许可温度下培养,影印到一个完全培养基和两个基本培养基平板上,取基本培养基一皿为一组，置于许可温度下培养；另取完全培养基和基本培养基各一皿，置于非许可温度下培养,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,在许可温度的基本培养基上生长，而非许可温度的基本培养基和完全培养基上都不生长；,根据菌落生长情况，可分两大类：,1）非必需基因突变形成的温度敏感突变株,在许可温度下的基本培养基上生长，非许可温度的基本培养基上不生长而在完全培养基上生长。是一类突变引起失去单一酶但可以补偿功能的TS突变株。,2）必需基因突变引起TS突变株,在许可与非许可温度下基本培养基和完全培养基上全部生长，则为野生型菌株。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,4、抗反馈调节突变株的筛选,酶的活性酶的合成,调节基因或操纵基因发生突变， 使产生的阻遏蛋白不再能和终产物结合或结合后不能作用于已突变的操纵基因,结构基因突变，使变构酶不再具有结合终产物的能力，但仍具有催化活性,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,通常抗反馈抑制和抗反馈阻遏突变株是通过抗结构类似物突变的方法筛选出来的, 结构类似物与末端产物结构相似，能与阻遏蛋白或变构酶结合，阻止产物的合成，引起反馈调节作用；但不能代替末端产物参与生物合成, 抗结构类似物突变株即使在结构类似物存在下，仍可合成末端产物,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,末端产物 结构类似物 可过量生产的产物对氨基苯甲酸 磺胺 对氨基苯甲酸 精氨酸 D-豆氨酸，D-精氨酸 精氨酸色氨酸 5-甲基色氨酸 色氨酸葡萄糖 2-脱氧葡萄糖 -葡萄糖苷酶,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,5、组成型突变株的筛选, 调节基因或操纵基因发生突变，都有可能获得组成型突变株, 筛选原则 设计某种有利于组成型菌株生长，并限制诱导型菌株生长的培养条件，造成组成型菌株生长优势或适当的分辨两类菌落的方法，选出组成型突变株,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,例如 可在培养基中加入抑制诱导酶合成的物质，使组成型菌株处于选择优势,以-半乳糖苷酶为例： 含有乳糖的培养基中加入抑制物邻硝基-D-岩藻糖苷,-半乳糖苷酶的合成被抑制，因此诱导型菌株不能利用乳糖，故不能生长而组成型菌株能合成该酶，利用乳糖生长，使组成型菌株被富集,发酵工程 第二章 微生物菌种选育, 通过显色反应可在平板上识别组成型菌株, 在不含诱导物，但含有经酶解后能呈现颜色变化的底物的平板上进行培养，可方便快速地检出组成型菌株,如，用邻硝基苯乳糖苷作为底物筛选-半乳糖苷酶组成型突变株,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,杂交育种,杂交育种一般是指人为利用真核微生物的有性生殖或准性生殖，或原核微生物的接合、F因子转导、转导和转化等过程，促使两个具有不同遗传性状的菌株发生基因重组，以获得性能优良的生产菌株。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,原生质体融合的概念, 就是把两个亲本的细胞分别去掉细胞壁，获得原生质体，将两亲本的原生质体在高渗条件下混合，由聚乙二醇（PEG）作为助融剂，使它们互相凝集，发生细胞质融合，接着两亲本基因组由接触到交换，从而实现遗传重组。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,1 、大幅度提高亲本之间重组频率。,原生质体剥离了细胞壁，去除了细胞间物质交换的主要障碍，也避免了修复系统的制约；再加上促融剂的诱导作用，重组频率显著提高。,2、扩大重组的亲本范围。,原生质体融合育种的优点,如天蓝色链霉菌的种内重组频率可达20%,去除了细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合、交换，实现重组，不需要有已知的遗传系统。,3、原生质体融合时亲本整套染色体参与交换，遗传物质转移和重组性状较多，集中双亲优良性状机会更大。,4、可以和其它育种方法相结合，把由其他方法得到的优良形状通过原生质体融合再组合到一个单株中。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,原生质体融合的基本过程,一般步骤,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,具体步骤：,直接亲本及其遗传标记选择双亲本原生质体制备与再生亲本原生质体诱导融合融合重组体（融合子）分离遗传特性分析与测定,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,、直接亲本及其遗传标记的选择, 所用的亲株均要有一定的遗传标记，以便于选择, 一般以营养缺陷型和抗药性等为标记, 目的基因并不一定与标记基因连锁，但确实可大大减少工作量，提高育种效率, 优良性状,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,、原生质体的制备与再生,多用酶解法 细菌、放线菌 溶菌酶 酵母菌 蜗牛酶 霉菌 纤维素酶等,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,影响原生质体制备的因素：,1）菌体的预处理,在使用脱壁酶处理以前，先用某些化合物对菌体进行预处理，有利于原生质体制备。,如 EDTA（乙二胺四乙酸）、甘氨酸、青霉素、D-环丝氨酸等,2）菌体的培养时间,一般选择对数期后期的菌体进行酶处理,3）酶浓度,一般来说，酶浓度增加，原生质体的形成率增大；超过一定范围，则原生质体形成率提高不明显。酶浓度过高，往往导致原生质体再生率降低,建议以使原生质体形成率和再生率的乘积达到最大时的酶浓度作为最适酶浓度。,4）酶解温度, 温度对酶解作用有双重影响 一般2040,5）酶解时间,充足的酶解时间是原生质体制备的必要条件；但太长会使再生率显著降低,6）渗透压稳定剂,必须在高渗或等渗溶液中对不同菌种，应采用不同的稳定剂 细菌、放线菌 一般采用蔗糖、丁二酸钠 酵母 采用山梨醇、甘露醇 霉菌 采用KCl和NaCl浓度 一般0.30.8mol/L,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,原生质体再生, 再生是原生质体育种的一个十分关键的问题, 不同微生物，即使是非常近似的种，所要求的再生的最适条件往往不同,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,融合子的检出, 在选择培养基上检出如利用营养缺陷型为遗传标记，可在基本培养基上筛选, 原生质体融合后会产生两种情况 一是真正的融合，即产生杂合二倍体或单倍重组体； 二是暂时的融合，形成异核体。,两者均可在选择培养基上生长，一般前者较稳定，后者不稳定，会分离成亲本类型，有的甚至可以异核状态移接几代。 因此要获得真正的融合子，必须在融合体再生后，进行几次自然分离选择，才能确定。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,菌种保藏原理,主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。 一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,第三节 菌种退化和菌种保藏,保藏方法,斜面冰箱保藏法 4 C ； 3-6个月 沙土管保藏法 产孢子或芽孢微生物，1年 菌丝速冻法 甘油或二甲基亚砜作为保护剂，-20 C 石蜡油封存法 1年左右 真空冷冻干燥保藏法 任何微生物；一般5年以上 液氮超低温保藏法 -196 C ；保护剂；保存期长,发酵工程 第二章 微生物菌种选育,