微生物药物的发酵工艺课件.ppt

微生物药物发酵过程,福建省微生物研究所周 剑 （副研究员 ） 2014.05.23,微生物药物工业生产的组成(原料药）,发酵,分离,菌种,菌种选育,菌种分离纯化,菌种制备保存,摇瓶种子制备,罐上种子制备,发酵生产,发酵液预处理,产物提取,产物精制纯化,微生物药物,（一）微生物药物工业生产菌种,工业生产用菌株不同于实验室研究菌株，不但要求其产物合成能力能够稳定的表达，还应追求产量尽可能的高，作为目标产品的类似物尽可能的少，发酵产物尽可能的易于提取精制等。在工业生产中，需要对生产菌株不断的纯化、复壮和改良。,工业生产菌株应满足的要求：能够产生较高浓度的目标产物；微生物药物工业发酵中高浓度产物一般是胞外产物；产物便于分离提取；能利用易得廉价原料，如淀粉、糖蜜、甲醇和纤维素物质等；不致病，不产生内毒素；发热量低，需氧低，具备适中的发酵温度和细胞形态，即发酵条件较温和；容易进行代谢调控。,菌种的选育 1. 寻找产生新化合物的菌种（略） 2. 现有微生物药物产生菌种的选育 目的：a. 提高目标产物的产率水平，降低杂质组分含量 b. 提高菌种对工业化生产条件的适应力 方法：a. 自然纯化选育 b. 传统诱变选育（紫外线、诱变剂、离子束） c. 代谢调控和条件模型选育 d. 基因工程选育,工业用菌种的分离纯化,微生物遗传变异是绝对的，稳定是相对的；退化性的变异是多数的，进化性的变异是少数的。不对工业用菌种加以分离纯化，剔除变异菌，那么通过传代的累积效应，退化变异菌种将占据种群遗传优势。最终导致生产水平的波动和下降。,菌种分离纯化流程（例）,保存菌种,涂布平板,点种平板,斜面,稀释涂布,单菌落点种,接斜面扩增,生产能力鉴定,斜面,斜面,菌种制备保存方式： 1.短期制备保存 短期制备保存方式主要用于生产用菌种的扩增制备和短时保存。 保证培养物能够短时的保存在常温或者冷藏条件下，随时应用 于生产。 主要包括：菌落平板 试管/茄子瓶斜面 麸皮/米孢子培养物 2. 中长期制备保藏 中长期制备保存方式主要用于菌种中长期保存，保证菌种的遗 传特性和活力，保证生产菌种有可靠来源。 主要包括：冷冻甘油管保藏 冷冻干燥管保藏 液氮甘油管保藏 沙土/石蜡管保藏,基本原则：低营养/干燥/缺氧/低温/密封,（二）微生物药物发酵生产过程,发酵生产流程概况,生产菌种培养,摇瓶种子培养,一级种子 罐培养,二级种子 罐培养,发酵罐培养,微生物药物的发酵生产包括种子培养和发酵生产两个阶段。种子培养阶段通过连续的扩增培养，获得足够量健壮均一的 种子投入发酵生产。发酵生产包括生长期和生产期，生长期仍以菌量的扩增为目的；当营养消耗等条件适宜后，微生物即开始产生目标产物，进入生产期。,发酵种子培养过程,迟滞期,对数期,平台期,衰亡期,种子生长曲线,种龄,菌量,种子的评价指标：生长健壮旺盛，移入下一级后能迅速生长，迟滞期短菌体稳定均一，生长同步性好菌体总量和生长密度适宜无杂菌污染,发酵种子培养的调控 1. 培养基 碳源、氮源、无机盐、生长因子是微生物生长的四大营养要素。一般而言，种子配方中碳/氮比要求均衡，量以满足生长为宜，优质有机氮源要有一定比例。碳氮源种类选择上则必须了解菌种的利用能力，并配合考虑种龄种量和发酵配方中碳氮源组成。 2. 环境因素 影响菌种生理活性的因素包括了温度、pH、溶氧、渗透压、离子强度等。不同的菌种都有着其最适应的范围，从而进行正常的生理代谢。 所有上述因素的选择在种子阶段都应以菌种的生长最适条件来进行选择。 3. 种子级数的设计 种子培养级数越多，培养周期越长，过程中可能出现的不稳定因素越多。在设备条件允许的情况下，应尽可能缩减种子培养级数，提高每一级培养下菌体的扩增量，保证下一级需要。,发酵生产流程,培养基投料溶解,移入发酵罐定容,调节灭菌前pH值,高压蒸汽灭菌,降温至培养温度,种子液移入,调节空气流量、搅拌速度、罐顶压至规定值，开始发酵,发酵生长曲线,迟滞期,对数期,平台期,衰亡期,发酵周期,生长期,生产期,次生代谢发酵原理：当微生物生长到一定阶段，由于营养减少和有害代谢物积累，使比生长速率下降趋零。为了维持生存，微生物体触发有关次生代谢基因，产生次生代谢物。以取得环境竞争优势，保存自身。,影响发酵的相关因素培养基,1. 碳源 碳源用于提供微生物能量来源、构建细胞和形成产物。碳源包括单糖、双糖、多糖、天然复合物、油脂、低级醇烃等，如葡萄糖、蔗糖、淀粉、面粉、豆油、甘油等。当培养基中碳源达到5%以上就形成高渗透压溶液，影响发酵。同时在一定浓度下碳源会阻遏产物合成酶，形成碳分解代谢物阻遏。 2. 氮源 氮源是微生物蛋白质和其他含氮有机物的来源，也参与形成含氮产物。氮源包括无机氮源和有机氮源，如氨盐、硝酸盐、玉米浆粉、蛋白胨等。无机氮中的铵离子及有机氮通过降解得到的铵离子也有阻遏产物合成酶的性质。 3. 矿物盐 磷酸盐、镁盐、钙盐是微生物能量代谢和生长的参与因素。锌、铁、钼、钴等是微生物所需要的微量元素。碳酸钙可以调节发酵液pH，但盐浓度达到一定程度则成为生长抑制和产抗调节因素。,4. 生长因子 许多微生物生长需要它们所不能合成的生长因子，如特殊氨基酸、维生素、生物素、嘌呤等。一般在天然复合物（如酵母粉、玉米浆）中有存在，但有时也必须单独添加以保证需要。 5. 消泡剂 发酵过程中，由于营养物分解代谢和菌体老化，加上发酵罐内通气和搅拌效果，易导致泡末产生，造成溶氧不足和逃液等问题。可通过消泡剂的添加控制泡末。一般消泡剂为高分子聚合物，如泡敌，聚乙二醇等。油类也具有类似效果，如豆油、葵花子油等。 6. 前体物质 次生代谢产物的合成往往需要特定化学结构物质作为反应起始物。这些物质虽然也能够通过微生物代谢合成得到，但如果予以人为添加则可以有效减少限制，促进产物合成。如青霉素发酵中添加苯乙酸，红霉素发酵中添加正丙醇，达托霉素发酵中添加癸酸，雷帕霉素、环孢菌素等添加特定氨基酸效价可以提高好几倍。,影响发酵的相关因素培养基,发酵工业中，一些常见前体物质,前体一般都有毒性，浓度过大对菌体的生长不利 如苯乙酸，一般基础料中仅仅添加0.07%，癸酸必须培养15h后加入。 前体添加过多，容易引起挥发和氧化，分解等。 因此，前体在使用过程中，常采用流加方法。,用法：前体普遍采用流加的方法， 流加有利于提高前体的转化率。,产物促进剂是指那些非细胞生长所必须的营养物，又非前体，但加入后却能提高产量的添加剂。,产物促进剂,促进剂提高产量的机制还不完全清楚，其原因是多方面的（机理不详）。 有些促进剂本身是酶的诱导物； 有些促进剂是表面活性剂，可改善细胞的透性，改善 细胞与氧的接触从而促进酶的分泌与生产； 也有人认为表面活性剂对酶的表面失活有保护作用； 有些促进剂的作用是沉淀或螯合有害的重金属离子。,在发酵培养基设计中，一般先用合成成分鉴别特殊需要，再转为天然培养基，以扩大生产。在发酵培养基成分选择是，除传统营养外，可选用各种农副产品、工业副产品、废料等。开发天然培养基时，应考虑：新选微生物及其工艺的特殊营养需求；为保持培养基成分稳定，改善储藏条件和加工条件；原料的性质及配制、灭菌、发酵条件对产物提取的影响；培养基价格。,发酵培养基设计,培养基优化,（1）目前还不能完全从生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方。（2）只能用生物化学、细胞生物学、微生物学等的基本理论，参照他人所使用的比较适合某一类菌种、某一类产品发酵的经验配方。（3）采用摇瓶、玻璃罐等小型发酵设备，按照一定的实验设计和实验方法选择出较为适合的培养基。,培养基优化的基本原则,注意事项：（1）菌种特性，同化能力（2）合适的C、N比。（3）合适的快速利用碳源、氮源。（4）合适的生理性酸性与碱性（5）pH、离子强度等,没有最好，只有更好,提高生产率,降低物耗、能耗、三废排放,提高发酵单位,缩短生产时间,价廉的原料替代，降低成本,培养基优化目标,方法,结果,培养基优化的基本方法,影响发酵的相关因素培养条件,1. 温度 温度影响微生物酶系的活力，这些酶分别决定微生物的初级代谢生长和次级代谢产抗。不同微生物菌种的生长温度不一样，而生长和产抗阶段的最适温度也有差异。发酵温度的设计要综合考虑能源消耗、发酵周期、稳定培养和产率水平因素，必要时可考虑变温培养。 2. pH pH对微生物的影响，主要也是作用于酶。另外对营养利用和细胞结构也有重要影响。无控制的条件下，pH 呈现如下变化规律。,有机氮分解，形成大量NH4+,NH4+消耗利用 碳源消耗产生有机酸,菌体老化，进入鸟氨酸循环形成大量NH4+,菌体二次生长,影响发酵的相关因素培养条件,H的调节首要在基础培养基的设计，如生理酸碱性物质的搭配、缓冲体系的设计等。另外可以加入外源性的酸碱物质调控，如盐酸、氨水等。在流补体系中，往往通过葡萄糖和氨水的流加平衡pH，同时也兼具营养补充功能。 3. 氧的供应 工业微生物大都为好氧微生物，氧的供应和利用影响初级生长和次级代谢。工业发酵中，将无菌空气通入培养基，通过搅拌桨分散气体以实现有效利用，同时维持一定罐顶压以增大氧的溶解度。 反映氧的供给和利用情况的数值包括：DO溶解氧、OUR摄氧率、Kla氧传递速率等，可通过溶氧电极、发酵尾气分析仪等获得。 类似的，生长和产抗往往有不同的氧需求。通过调节通气量、搅拌速率、罐压可以有效控制和保证氧的供给。而发酵黏度、泡沫等因素往往导致氧利用的恶化，需要警惕和控制。,影响发酵的相关因素培养条件,4. 灭菌条件 发酵罐和培养基灭菌是无菌培养的必要前提，同时也导致营养损失和毒性物质积累。因此对于敏感菌种往往需要对部分养分单独灭菌，以降低影响。但是这些影响因素往往会成为控制生长、调节微生物产抗的必要因素。通过灭菌温度、时间的调整来控制微生物发酵也是常用的手段。 5. 剪切力 发酵生产培养中，搅拌促进氧的分散利用，但桨叶尖端末速形成的剪切力也会损伤菌体，造成菌体断裂破碎，进而导致二次生长、黏度提高、菌种变异等情况，使发酵恶化。 对于剪切，可以筛选耐剪切力菌种，提高菌种抵抗能力。在设备上也可以选择低剪切、高分散效率的搅拌桨，如轴流推进式桨叶。,影响发酵的相关因素其他因素,1. 种子质量的影响 2. 设备的影响 良好可靠的发酵设备是发酵生产的必要因素。设备对于发酵生产的负面影响表现如：轴封磨损、管路接头缝隙、过滤器失效导致染菌问题；搅拌不平衡导致罐体震动，影响供氧；开关阀门动作失灵导致温度、pH控制不稳等等。 3. 人员操作的影响 人员操作是发酵生产控制的重要因素,对发酵生产各环节都有决定性影响。只有严格按照操作规程操作，才能避免由于粗略和错误的影响。 4. 环境因素 环境因素往往导致发酵水平的季节性波动。如环境空气的温湿度会使无菌空气的温湿度有差异，导致培养体积随时间的增减，影响发酵环境。,（健壮均一、足够数量、缩短迟滞期）,发酵终点的判断,1. 发酵的评价指标 发酵产率：单位体积的产物含量 g/L 发酵总亿：发酵液中产物总产量 十亿单位/kg 发酵系数：产物总产量/总发酵体积*总发酵时间 kg/m3*h 发酵成本：发酵(原料+动力+人员+其他)成本/总产量 元/kg 2. 终点判断标准 发酵终点的判断主要从技术和经济指标两方面来衡量。技术上需要寻找发酵总亿与发酵系数的平衡点，当总亿增加，发酵系数却趋低时即应考虑放罐。同时从分离角度考虑，一方面残余营养物要尽量减少，另一方面菌体自溶不能大量出现。此外，一旦难分离杂质组分有升高趋势，也将影响分离得率和总的成本。 从经济角度考虑，发酵终点应处于最低发酵成本位置，但同时也应兼顾分离提取需要。,（三）发酵系统介绍,（三）发酵系统介绍,工业发酵搅拌器技术的发展,适用发酵过程的搅拌器,径向流圆盘搅拌器：Rushton涡轮半弯管圆盘涡轮BT-6轴向流搅拌器：窄叶高效轴流 A310，CBY, HE3，ZCX等宽叶高效轴流A315，KSX, MaxFlo等,工业发酵过程搅拌技术,红霉素370吨发酵罐,工业发酵过程搅拌技术,酶制剂-糖化酶,长城最新发酵搅拌技术,发酵罐设计几点经验,发酵罐的长径比H/D的考虑：考虑气体的停留时间以及热管的布置国内一般考虑2.5到3。考虑搅拌的整体稳定、换热的能力以及罐体水柱背压对压缩机背压的影响从而极大影响压缩机能耗，国外例如DSM青霉素H/D=2，韩国希杰氨基酸H/D=1；由于搅拌能力提高靠大H/D提高气含率，与低H/D没有太大区别。 气含率的控制：对于目前高的气含率提供好的供氧，但降低了罐容，我建议对于通气比在1：0.5以内的搅拌控制气含率在68%，抗生素在812%之间。,长城最新发酵搅拌技术,3 换热管的布置：竖型列管，大蛇管，排管，圆形列管束（列管式换热器型），弹簧管，蜂窝挡板等等。采用形式与发酵液黏度、固形物含量，发酵液热值等等有关。挡板（换热管就是一定的挡板）的大小靠近全挡板的75%到80%为佳。,竖管,大蛇管,弹簧管,工业发酵过程搅拌技术,小结,大量的工业生物过程需要搅拌技术和设备，搅拌设备随着发酵罐的容积的增大也越来越大；新的搅拌技术也不断应用于工业发酵过程。发酵罐的高径比设计，换热管的设计等都与搅拌设计密切相关，有许多经验可供参考。,（四）几种抗生素的发酵工艺实例,（1）青霉素的发酵工艺,青霉素的产生菌产黄青霉（Penicillium chrysogenum）51-20和点青霉（P. notatum），目前全世界用于青霉素生产的高产菌株几乎都是以产黄青霉为出发菌株，经不同的改良途径得到的。目前青霉素的发酵单位最高达到120000U/ml。,In 1928, Alexander Fleming ( left), a Scottish bacteriologist, discovered a mold with bacteria-killing powers so incredible it was effective even when diluted 800 times. Courtesy of the USDA. Right, a strain of P. notatum was used for some of the first tests of pencillin. Courtesy of the FDAs Center for Drug Evaluation and Research.,甘油、葡萄糖和蛋白胨组成的培养基斜面培养,砂土孢子,生产孢子的制备,大米或小米固体培养基上25培养7d，孢子成熟后真空干燥，低温保藏备用。,采用三级发酵，其目的是使青霉菌菌体数量逐步扩大和适应发酵，其次是使发酵罐连续使用，缩短发酵周期。,一级发酵：小罐，使孢子萌芽形成菌丝；二级发酵：大量繁殖青霉菌菌丝体；三级发酵：继续大量繁殖菌丝体，生产青霉素。,大规模发酵生产,发酵的影响因素及控制,碳源、氮源的影响和控制：,葡萄糖是容易利用的碳源，有利于菌体的生长；乳糖是青霉素生物合成最好的碳源。青霉素发酵中采用连续流加葡萄糖的方法，在发酵初期使青霉菌大量迅速强壮地繁殖菌丝体；发酵后期利用乳糖使青霉素大量合成。玉米浆是青霉素发酵最好的氮源。 玉米浆中含有丰富的可溶性蛋白、生长素和一些前体物质，含大约40%50%固体物质。 在玉米浸泡过程中若长有乳酸菌和酵母菌，则提高玉米浆的质量；若长有腐败性细菌则降低玉米浆的质量。（含有大量乳酸） 玉米浆是微生物生长很普遍应用的有机氮源，它还能促进青霉素等抗生素的生物合成。,前体的影响和控制：,苯乙酸及其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可以作为青霉素G侧链的前体物直接结合到青霉素分子中，也可以作为养料和能源被利用。苯乙酸、苯乙酰胺等对菌体生长和生物合成均有毒性。采用间歇或连续添加低浓度前体物质的方法，保持前体的供应率仅大于生物合成的需要，可以起到提高产量的作用。,H的影响和控制：,青霉素发酵的最适pH一般认为是6.2-6.8，应尽量避免pH超过7.0。当pH高于最适pH时，通过补糖和生理酸性物质（硫酸铵等无机氮源）降低pH ；当pH低于最适pH时，通过补加CaCO3、氨水或尿素，也可提高通气量，促进有机酸氧化来提高pH。可利用自动加入酸或碱的方法维持pH。,温度的影响和控制：,青霉菌生长的适宜温度是30，分泌青霉素的适宜温度是20，通常采用分段变温控制法，使温度适合不同阶段的需要。0-56 h维持在27.2，然后恒速降温至18.7，并维持到184 h，最后24 h回复到27.2培养。这样变温培养法可比常温25培养产量增加16%。,补料控制：,中间补糖以控制糖浓度和pH；补加氮源可延长发酵周期、调节pH、提高青霉素产量，控制发酵液中的氨基氮含量在0.01%-0.05%。补加表面活性剂，如新洁尔灭50 mg/L、聚氧乙烯、山梨糖醇酐等也能增加青霉素的产量。,加入少量可溶性高分子化合物，如聚乙烯醇、聚二乙胺或聚乙烯吡咯烷酮（PVP），能使青霉素产率提高38%。（1）当发酵罐使用较大的搅拌功率和较快的搅拌叶尖速时，这些高分子化合物能使临近搅拌叶的液体速度梯度降低，避免打断菌丝，而且促进氧在培养基 中充分溶解的同时还有利于除去 CO2。 （2）菌丝生长时，由于高分子化合物起到分散剂的作用，菌丝不致成团，界面面积得以增加，因而增加了氧传递到菌丝体内的总速度。,铁离子的影响和控制：,Fe3+对青霉素生物合成有显著影响，一般当发酵液中含量超过30-40g/ml，则发酵单位增长缓慢。铁制发酵罐在使用前必须进行处理，可在罐壁涂上环氧树脂等保护层，使Fe3+含量控制在30 g/ml以下。,冷冻干孢子,琼脂斜面,米孢子,种子罐,发酵罐,提取工序,菌种工艺：自身耐受性突变前体或前体类似物抗性突变营养缺陷型的回复突变耐消泡剂的菌株细胞膜渗透性良好的菌株构建基因工程菌株,发酵的优化控制 碳、氮源 pH温度微量元素：铁离子的影响补料:糖、硫酸铵、尿素、玉米浆前体化合物、水溶性高分子化合物、表面活性剂,青霉素生产工艺流程,（2）达托霉素的发酵工艺达托霉素的产生菌玫瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus ),daptomycin的分子结构,福建省微生物研究所,由连接到一个环状13-氨基酸肽的N-末端色氨酸上的癸酰基侧链构成。,达托霉素的作用机制,福建省微生物研究所,改变细胞膜电位，搅乱细胞膜对氨基酸等的转运从而阻碍细菌细胞壁肽聚糖的生物合成；改变细菌细胞质膜的性质，破坏细菌细胞膜使细菌内容物外泄等。daptomycin是目前发现的唯一能抑制G细菌细胞膜上特有成分脂磷壁酸合成的抗生素。,化学半合成法 首先经玫瑰孢链霉菌发酵获得达托霉素原形药然后经微生物转化、化学半合成最终形成达托霉素。 工艺路线长，存在两步发酵，发酵效率和提取收率低，不适于工业化生产。,生物定向合成法 利用癸酸作为发酵的前体物直接由微生物发酵产生达托霉素。一步发酵，发酵效率高，工艺路线短，提取收率也比较高。,达托霉素生物合成途径,从抗生素A21978C到daptomycin,诱变,推理选育,高产菌种,摇瓶发酵工艺优化,常规诱变：紫外辐射、NTG、抗生素处理等,遗传稳定性菌种保藏工艺,单因素、正交、响应曲面法等摇瓶流加癸酸盐,癸酸耐受性,菌种遗传改良,菌种工艺,菌种用冷冻干燥法或甘油管法保存，并严格控制有效使用期；所有生产用菌种或斜面都保存于低温冷库内（0-4），并限制其使用期限；严格控制生产菌落在斜面上的传代次数，一般以3代为限，用单菌落转种，以使用新鲜斜面为原则；定期进行菌种的纯化筛选，淘汰退化的菌落；不断选育高单位的新菌种。,达托霉素产生菌容易发生变异,大规模发酵生产,采用高度通气搅拌、3-4级的扩大深层培养法发酵。,菌种（冷冻干燥管或甘油管）斜面摇瓶种子（1-2级） 种子罐种子（1-3级） 大罐发酵（7-8 d）,发酵过程控制pH（流加氨水）适当时机补料前体物质癸酸（采用不同的形式：癸酸盐或溶于有机溶剂）,发酵的影响因素及控制,碳源、氮源的影响和控制：,首选碳源是马铃薯糊精；可利用碳源：葡萄糖、糊精、可溶性淀粉、玉米淀粉、麦芽糊精等等有机氮源以黄豆饼粉为佳，无机氮源以硫酸铵和尿素最常用，氨水可用来调节发酵pH。有机氮源：酵母粉、黄豆粉、黄豆饼粉、玉米浆粉、蛋白胨、棉籽粉无机氮源：硫酸铵、尿素、硝酸铵、柠檬酸三铵、磷酸氢二铵等,无机盐及微量元素的影响和控制：,磷酸盐对菌体生长和抗生素的合成非常重要，一般采用较低的磷酸盐浓度，15-150 mmol/L（46.5-465 mg/L）；Fe2+一般适用量在20 g/ml（FeSO4、(NH4)2Fe(SO4)2.6H2O ）生物素（biotin）、维生素C、维生素B12；,通气和搅拌的影响和控制：,增加通气量，保持一定搅拌速度，避免长期停止搅拌和闷罐。,温度、pH的影响和控制：,玫瑰孢链霉素发酵温度以30为宜；玫瑰孢链霉素菌丝生长的最适pH为7.0左右，适于达托霉素合成的pH为6.5-6.8。,补加葡萄糖、硫酸铵和氨水，不仅为菌体生长和产物合成提供营养物质，还能调节发酵液的pH。前体物癸酸对细胞毒性大，很小剂量就可以抑制细胞生长，甚至导致死亡；但是作为达托霉素的侧链，在发酵适当时机加入可以大大提高达托霉素产量（约510倍）由于癸酸对细胞具有毒性，而且其在常温下是呈固体状。所以必须通过溶剂溶解后再由补料的方式流加。一般采用油酸甲酯、乙醇等溶解癸酸，但是溶解在油酸甲酯或乙醇中的癸酸仍然对细胞具有较大毒性，并且温度低时容易结晶析出，影响流加效果。而癸酸盐在常温下能够以液体的形式存在，并且游离癸酸根离子对细胞的毒性相对效价。因此可以作为达托霉素侧链的供体。,补料控制,种子罐为200L，装料70%，培养温度：301，罐压：0.03-0.05MPa，空气流量：1：1 vvm，搅拌转速150300rpm，发酵过程用浓氨水调节pH不低于6.5。菌容达到30%左右，约30h移入2吨二级罐（培养基同发酵罐）装液量为70%，移种量为5%10%，培养温度：301，罐压：0.03-0.05MPa，空气流量：1：1 vvm，搅拌转速150250rpm，发酵过程用浓氨水调节pH不低于6.5。在培养15hr左右（菌容为20%），移入发酵罐10吨，移种量15%，培养温度：301，罐压：0.03-0.05MPa，空气流量：1：1 vvm，搅拌转速150250rpm，发酵过程用浓氨水调节pH不低于6.5。发酵24h后开始补料流加癸酸盐溶液（癸酸钠、癸酸钾、癸酸铵），流速0.5-3.0ml/L/H至发酵结束时发酵液中达托霉素效价达到10001700mg/l左右。,发酵前期控制：原材料、灭菌、种子质量、菌体形态溶氧对发酵的影响：搅拌、通气、罐压、补水等菌体比生长速率跟抗生素产量的关系淀粉酶活性的变化规律糖氮、溶磷曲线规律前体物的添加策略：癸酸的组分形式、补料时机、 流加速度、发酵液中残余癸酸浓度等,最大限度的发挥高产菌株的生产性能,连续多批次在100L发酵罐上实现高产，在工厂3吨发酵罐以及10吨生产罐上实现工艺重复。,达托霉素发酵过程控制研究,发酵曲线分析,发酵曲线分析,发酵液预处理：加热、调酸、加絮凝剂、硅藻土过滤：滤布的孔径、陶瓷膜的孔径超滤、纳滤溶媒萃取树脂分离,分离提炼工艺,本实验室在一株链霉菌NOV-0827产生的次级代谢产物中发现香豆素类抗生素新生霉素（novobiocin），大环内酰胺类抗生素BE-14106（GT-32A）和GT-32B。,（3）新化合物的发现及发酵工艺优化,原始菌株接种于斜面培养基上，培养7天。待菌体发育成熟后，将斜面接入种子培养基，种子在28，转速220rpm条件下培养48h后，再以5%的接种量接到装液量60ml发酵培养基中，28，220rpm条件下培养144h。流程为： 斜面 7天，28 种子培养基 48h，28 发酵培养基 144h， 28 发酵液,菌株发酵基本流程,原始菌株经自然选育，得到了14株不同形态的菌株，编号依次为1#-14#。再对这14株菌株进行筛选，以新生霉素的产量为指标，筛选出效价较高的4#和5#菌株。,菌株形态观察发现：无孢子的菌株相对于有孢子的菌株，新生霉素的效价更高。,各筛选菌株相对效价的比较图,筛选菌株形态图,注：从左至右依次为：1#、8#（有孢子);4#、5#（无孢子）,筛选菌株传代稳定性考察,对筛选出的4株菌株进行分别5次传代培养，以生长良好的第一代菌株为对照，分别考察各代新生霉素产量的稳定性。结果显示：各筛选菌株的遗传稳定性良好，可作为下一步的实验菌。,显微镜下菌丝体形态图注：A：4倍；B：10倍；C：40倍；D：100倍,A,B,C,D,对种子及发酵培养液进行取样、涂片、染色后，镜检观察菌丝体形态，镜检结果显示：菌丝体长势良好，菌丝茁壮、茂密、舒展，无结团现象。,在本部分的研究中，对原始出发菌株经自然选育和初步筛选，得到了1株编号为4#，菌株形态观察无孢子的菌株，其新生霉素的效价最高。且传代稳定性实验表明其遗传稳定性良好，可作为下一步实验菌。 因此，选择效价最高的4#菌株为下一步的实验菌株，其新生霉素的效价较原始菌株提高了272.6%。,发酵罐总发酵液HPLC图,化合物B,化合物C,化合物A,实验过程中，初步发现了3个较明显的化合物峰，标记为化合物A、B、C。首先以效价较高的化合物B为指标，利用单因素实验优选出合适的碳氮源及微量元素。进一步利用正交实验设计法，分别以化合物B和化合物C的产量为指标，优选出各自合适的培养基配比，得到各自培养基的优势配方。,单因素实验设计(碳源、氮源及微量元素的选择)正交实验设计（研究碳源、氮源以及微量元素之间的交互作用）发酵过程的影响因素及其控制（从发酵周期、淀粉酶、装液量、转速、接种量、消泡剂等方面来考察）,单因素实验设计结果,1、发酵培养基碳源的选择,由图可见，糊精和甘油作为新碳源，相较原始培养基的碳源葡萄糖和玉米淀粉，四者化合物B的效价未见显著差异。因此，选用糊精、甘油、葡萄糖、玉米淀粉作为候选碳源进行下一步的分析比较。,2、发酵培养基氮源的选择,由图可见，只有蛋白胨作为新氮源，相较原始培养基的氮源黄豆饼粉和酵母粉，三者化合物B的效价未见显著差异。因此，选用蛋白胨、黄豆饼粉、酵母粉作为候选氮源进行下一步的分析比较。,3、发酵培养基微量元素的选择,由图可见，NH4Cl和MgSO4作为新微量元素，相较原始培养基的微量元素NaCl和KH2PO4，四者化合物B的效价未见显著差异。因此，选用NH4Cl、MgSO4、NaCl、KH2PO4作为候选微量元素进行下一步的分析比较。,正交实验设计结果,第一次正交设计因素水平表L12(211)（%）,第二次正交设计因素水平表L27(313)（%）,根据第一次正交实验的结果，筛选出具有统计学意义的因素，对有意义的因素具体取值范围进一步设计，以获得各因素的最佳比例。,根据单因素实验的结果，筛选出几种效价较高的碳源、氮源及微量元素，对各因素的取值范围进行合理设计后，按第一次正交实验设计表进行实验。,两次正交实验方差分析表（化合物B）,对于化合物B：,根据上述方差分析，结果显示：P0.05的因素具有统计学意义，能认为它们水平的高低对于产物浓度有影响。得出化合物B的优势配方为：黄豆饼粉 2%或3%，酵母粉 2%，葡萄糖 2%，甘油 0.5%或1.5%，玉米淀粉 3%，糊精 3%，NaCl 1%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.2%。,两次正交实验方差分析表（化合物C）,根据上述方差分析，结果显示：全部因素均具有统计学意义，能认为它们水平的高低对于产物浓度有影响。得出化合物C的优势配方为：黄豆饼粉 3%，酵母粉 2%，葡萄糖 3%或4%，甘油 0.5%，玉米淀粉 2%，糊精 4%，NaCl 1%，KH2PO4 0.1%，MgSO4 0.1%。,对于化合物C：,发酵培养条件对产物的影响,发酵周期对发酵的影响淀粉酶对发酵的影响摇瓶转速及装液量对发酵的影响接种量对发酵的影响消泡剂对发酵的影响,1、发酵周期对发酵的影响,由图可见：化合物A的最佳发酵周期为120h；而化合物B的最佳发酵周期为168h；化合物C的最佳发酵周期为168h。,2、淀粉酶对发酵的影响,由图可见：加酶与否对化合物A、B、C的效价影响不显著。,3、摇瓶装液量对发酵的影响,由图可见：化合物A的最佳装液量为80ml；化合物B的最佳装液量为80ml；而化合物C的最佳装液量为90ml。,4、摇瓶转速对发酵的影响,由图可见：化合物A和C的最佳摇瓶转速为250rpm；而化合物B的最佳摇瓶转速为220rpm。,5、接种量对发酵的影响,由图可见：化合物A、B和C的最佳接种量都为5%。,6、消泡剂对发酵的影响,由图可见：消泡剂（泡敌）浓度越高，对化合物A和B有抑制作用，而对化合物C有促进作用。,小结,对筛选菌株的发酵条件进行了探索，首先对其发酵培养基进行了优化。在筛选合适的碳氮源种类的基础上，应用正交实验的设计方法，进一步优化了发酵培养基，得出各化合物最优势的配方组合。经过优化后，化合物B的效价相较于原始菌株效价，提升了323.2%；化合物C的效价相较于原始菌株效价，提升了241.4%。 其次针对不同化合物的发酵条件，从发酵周期、淀粉酶、装液量、转速、接种量、消泡剂等方面，对摇瓶的发酵工艺也进行了优化。,菌株快速确认目标化合物（检测条件建立）参考文献对目标化合物发酵培养条件进行初步优化确认几种可能对产物影响较大的培养基，进行单因素或两因素多水平试验正交实验、响应面曲线、神经网络等统计学方法可能的代谢途径进行优化，添加前体物、氨基酸、pH控制、补料等等工艺,大孔吸附树脂在微生物药物发酵过程的应用,埃博霉素、普那霉素、安丝菌素、丝裂霉素等,价格昂贵/目标化合物不稳定/产量微量,吡咯类,大环内脂类,多烯类,