第七章 凝胶层析资料课件.ppt

第七章 凝胶层析,层析法（也称色谱法）：早在1903年由俄国植物学家Tswett分离植物色素时采用。他在研究植物叶的色素成分时，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离形成各种不同颜色的谱带。这种方法因此得名为色谱法。以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。,概述,1.层析法简介,层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。其中固定的称为固定相；流过固定相的称为流动相。,2.层析法的基本原理,根据层析分离机制,柱层析纸层析薄层层析薄膜层析,吸附层析离子交换层析凝胶层析亲和层析,气相(气-液;气-固)层析液相(液-液;液-固)层析,根据两相所处状态,根据操作形式不同,3.层析法的分类,凝胶层析,第一节 凝胶层析的基本原理第二节 凝胶的结构和性质第三节 凝胶层析的实验条件和操作第四节 色谱峰变宽的问题（自学）第五节 凝胶层析的应用,第一节 凝胶层析的基本原理,一、凝胶层析原理凝胶过滤、分子筛层析、排阻层析、凝胶渗透层析等。是将样品混合物通过一定孔径的凝胶固定相，由于各组分流经体积的差异，使不同分子量的组分得以分离的层析方法。,二、凝胶层析的重要参数1. 外水体积、内水体积、基质体积、柱床体积、洗脱体积 柱体积(VA) ：柱体积是指凝胶装柱后，从柱的底板到凝胶沉积表面的体积。在色谱柱中充满凝胶的部分称为凝胶床，因此柱体积又称“床”体积(VA)。外水体积（V0） ：色谱柱内凝胶颗粒间隙，这部分体积称外水体积，亦称间隙体积，常用V0表示。内水体积Vi ：因凝胶为三维网状结构，颗粒内部仍有空间，液体可进入颗粒内部，水的总和为内水体积，又称定相体积，常用Vi表示。 不包括基质的体积（Vg）。VA=V0+Vi+Vg V柱内空间VoVi,柱床体积VA可以通过加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积来测定。VA = 1/4 D2h计算外水体积Vo可以通过测定完全排阻的大分子物质的洗脱体积来测定，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。因为它的分子量大（为200万），在各种型号的凝胶中都被排阻，并且它呈蓝色，易于观察和检测。,峰洗脱体积（淋出体积Ve）：是指被分离物质通过凝胶柱所需洗脱液的体积，常用Ve表示。Ve=V0+Vi，ace Vi ，ace是Vi的一部分，它与Vi之比成为Kd（分配系数）Ve=V0+Vi Kd,15,2.分配系数Kd,分配系数：当Kd=1时，洗脱体积Ve=V0+Vi，为全渗入。当Kd=0时，洗脱体积Ve=V0，为全排阻。0Kd1时，洗脱体积Ve=Vo+KdVi，为部分渗入。因此分子的正常Kd值01之间,这种由小到大的Kd值顺序决定了物质流出的顺序。,16,物质的Kd值,3. 排阻极限排阻极限是指不能进入凝胶颗粒孔穴内部的最小分子的分子量。所有大于排阻极限的分子都不能进入凝胶颗粒内部，直接从凝胶颗粒外流出，所以它们同时被最先洗脱出来。排阻极限代表一种凝胶能有效分离的最大分子量，大于这种凝胶的排阻极限的分子用这种凝胶不能得到分离。例如Sephadex G-50的排阻极限为30,000，它表示分子量大于30,000的分子都将直接从凝胶颗粒之外被洗脱出来。,4. 分级分离范围分级分离范围表示一种凝胶适用的分离范围，对于分子量在这个范围内的分子，用这种凝胶可以得到较好的线性分离。例如Sephadex G-75对球形蛋白的分级分离范围为3,00070,000，它表示分子量在这个范围内的球形蛋白可以通过Sephadex G-75得到较好的分离。应注意，对于同一型号的凝胶，球形蛋白与线形蛋白的分级分离范围是不同的。,5. 吸水率和床体积吸水率是指1g干的凝胶吸收水的体积或者重量。但它不包括颗粒间吸附的水份。所以它不能表示凝胶装柱后的体积。 而床体积是指1g干的凝胶吸水后的最终体积。,20,二、凝胶层析的特点,（1）凝胶层析操作简便、设备简单(仅需一根层析柱) 。（2）分离效果较好，重复性高，样品回收率高,接近100%。（3）分离条件缓和。（4）应用广泛。适用于各种生化物质，如肽类、激 素、蛋白质、多糖、核酸的分离纯化，脱盐、浓缩以及分析测定类。（5）分辨率不高，分离操作较慢。,21,第二节 凝胶的结构和性质,一、葡聚糖凝胶 (Sephadex)二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex)三、聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-Gel P）四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ） 五、多孔玻璃微球 (Bio-glas)六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）,22,一、葡聚糖凝胶 (Sephadex),商品名为Sephadex G类 .交联葡聚糖的基本骨架是葡聚糖。再经3-氯-1，2-环氧丙烷为交联剂，形成三维网状结构的高分子化合物。其交联度是通过交联剂的加量及反应条件来控制的。,1.结构,Sephadex G-X ，X数字代表1）代表交联度X越小：交联度越大，网孔越小，适用于分离低分子质量生化产品。X越大：交联度越小，网孔越大，适用于分离高分子质量生化产品。2）代表持水量每克干胶溶胀时吸水体积的10倍G-25：1g干胶持水2.5mLG-100：1g干胶持水10mL3）溶涨时间；4）凝胶孔径；5）分离范围,2 规格型号：,24,葡聚糖凝胶性能与编号的关系,25,葡聚糖凝胶（G类）的规格,3.性质稳定性。能被强酸、强碱和氧化剂破坏，对稀酸稀碱和盐溶液稳定，能耐受一定高温。存在非特异性吸附含少量羟基：对阳离子轻微吸附环状结构：对芳香族化合物和杂环化合物出现滞留,27,4.保存,湿法：加入一定量的防腐剂置于冰箱中作短期保存（6个月以内）。常用0.02%叠氮化钠、0.02%三氯叔丁醇、20%乙醇等。干法：用浓度逐渐升高的乙醇分步处理洗净的凝胶，脱水收缩，抽滤，用6080吹干。半缩法：60-70%乙醇使凝胶部分脱水收缩，封口，4保存,保存的方法有干法、湿法和半缩法三种。,28,二、修饰葡聚糖凝胶 (Modified Sephadex),（一）亲脂性葡聚糖凝胶（Lipophilic Sephadex）骨架结构上引入一些有机基团，如甲基、羟丙基，使呈亲脂性，同时保留亲水性。（二）交联葡聚糖离子交换剂（Sephadex ion-exchanger）将活性交换基团连接于葡聚糖凝胶上制成的各种交换剂。,29,（三）Superdex系凝胶由高交联度多孔琼脂糖与葡聚糖共价结合而成。（四）Sephacryl系凝胶是由丙烯烷基葡聚糖经甲叉双丙烯酰胺共价交联制成的。理化稳定性好，为硬性凝胶，可耐高压灭菌。,30,三、聚丙烯酰胺凝胶,商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。该凝胶由丙烯酰胺组成；以亚甲基双丙烯酰胺为交联剂，聚合而成。,1.结构,31,2.聚丙烯酰胺凝胶的性质,1）孔径大小（可通过交联度调整）； 2）稳定性、强度； 3）无非特异吸附，保存方便； 4）生物凝胶的编号反映出它的分离界限。如Bio-Gel P-100。,32,四、琼脂糖类凝胶 （Sepharose ）,（一）琼脂糖凝胶1.结构是由-D-半乳糖与3，6-脱水-L-半乳糖以-1，3-和-1，4-糖苷键相间连接而成的链状分子。,33,2.琼脂糖凝胶特点,1、没有共价键的交联。2、孔径 琼脂糖的浓度。3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。4、颗粒强度差。5、非特异性吸附力低。6、分离范围大。,34,琼脂糖凝胶分离范围,琼脂糖凝胶有3个规格：Sepharose2B、4B、6B分别表示琼脂糖浓度为2%，4%，6%。,琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品在都以含水状态供应，并应在湿态保存。一般悬浮在10-3mol/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。避免硼酸缓冲液,3.保存,36,（二）架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）,架桥琼脂糖凝胶为琼脂线性分子经1，3-二溴丙醇交联的凝胶。它的凝胶孔径均匀，机械强度明显加大。对热和化学物质的稳定性大大增加,在pH314范围内稳定。,37,（三）超胶（Utro-gel ACA）,所谓超胶是琼脂糖与聚丙烯酰胺的混合凝胶。商品名称后面的编号为两位数，各表示混合胶中聚丙烯酰胺与琼脂糖的百分浓度。,38,（四） Superose系凝胶,是由珠状琼脂糖经两次交联制得的可用于HPLC的高速凝胶过滤介质。有6%和12%两个规格。,39,五、多孔玻璃微球(Bio-glas),特点：1、化学稳定性高、强度大。 2、对糖类、蛋白质等物质有吸附作用。 3、编号表示其孔径, 越大，分离分子量也越大。,40,六、疏水性凝胶（hydrophobic gels）,聚甲基丙烯酸酯凝胶和聚苯乙烯凝胶。Styragel商品, 分离范围为1 60040 000 000。生物珠（Bio-Bead S），适于分离分子量较小的物质。分离不溶水的有机物质。,41,一,第三节 凝胶层析的实验条件和操作,42,43,一、凝胶的选择和处理 二、凝胶层析柱的设计和制备 三、凝胶层析操作 四、主要参数测算五、凝胶层析的扩展,44,一、凝胶的选择和处理,（一）凝胶的选择(1).将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离。(2).将分子量相差不大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。,45,1）类分离,（1）使大分子的分配系数Kd=0；（2）小分子的Kd=1。选用Sephadex G-25凝胶，分离范围1 0005 000。,46,2）分级分离,（1）使各种物质的Kd值尽可能相差大。（2）使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。（3）样品中含有3个组分：一个接近全排阻另一个接近全渗入第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1/3。如用Sephadex G-200分离血清蛋白质的效果要比Sephadex G-150为好。,47,（二）凝胶粒度的选择,细粒凝胶柱流速低，洗脱峰窄，分辨率高，用于精制分离或分析。粗粒凝胶柱流速高，洗脱峰平坦，分辨率低，用于粗制分离，脱盐。,48,（三）凝胶的预处理,使用前须溶涨，使干胶颗粒充分吸收溶剂，并达到平衡。干胶以10倍以上吸液量的溶剂浸泡。热法溶涨(水浴)。,49,二、凝胶层析柱的设计和制备,（一）层析柱的选择1.柱比：层析柱长度与直径的比值称作“柱比”。对于类分离，柱比5:1到10:1即可。对于分级分离，柱比在25至100之间。,2. 柱的下端口要满足两个要求：不易阻塞；死体积小。玻璃板上铺滤纸玻璃板下填充小玻璃珠,51,凝胶柱床大小与所需凝胶量的关系,52,（二）凝胶柱的装填,常用的支持物有棉花、玻璃纤维、玻璃珠、垂熔玻璃等。支持物要求不漏不堵，不吸附样品，且能保持一定流速空柱中应留约1/5的水或溶剂.不断搅拌下使胶粒均匀沉降，使不发生凝胶分层和胶面倾斜。凝胶悬液浓度适当,层析柱（a）自制简易层祈柱（1玻璃管；2.橡皮塞；3尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3柱床；4恒温水进口；5恒温水出口；6可调节的塞子）,层析系统连接示意图 1密封橡皮塞；2恒压管，3，恒压瓶；4，层析流出液，5可调蜾旋夹；6.自动收集器； 7.核酸一蛋白质检测仪,BS100自动部分收集器安装圈1反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8报警板；9.试管；10收集盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13自动开关；14、指示灯；15.电源开关；16换向开关（逆、顺）；17手动开关,56,（三）凝胶床的检查和维护,观察有无凝胶分层、沟流和气泡等现象。平衡有色物质溶液过柱，观察柱床有无沟流，色带是否平整。检查物质为蓝色葡聚糖。,57,操作压,层析柱由于进出口之间液位压力差形成的对凝胶颗粒的压力称作“操作压”。,58,层析床横截面所允许的最大压力,59,三、凝胶层析操作,（一）样品和加样蛋白质类样品浓度:不大于4%。样品粘度小于0.01Pas样品浑浊应先过滤除颗粒后上柱,样品黏度对洗脱曲线的影响,（1）加葡萄糖2 000，使终浓度为5%，相对粘度11.8;（2）加葡萄糖2 000，使终浓度为2.5%，相对粘度4.2; （3）加葡萄糖2 000，使终浓度为1%.,61,（1）直接将样品加到层析床表面。 （2）样品比重高。,加样时应尽量减少样品的稀释，及凝胶床面的搅动。,1.洗脱剂常采用缓冲盐溶液进行洗 脱洗脱液的成分也不应改变，以防凝胶涨缩引起柱床体积变化或流速改变。流速较低，分辨率较高，样品稀释较轻,（二）洗脱与收集,63,2、流速（操作压、型号、粒度）。整个洗脱过程中始终保持一定的操作压编号小，颗粒粗-流速大与操作压成正比，柱长成反比,3、部分收集器。,65,（三）凝胶柱的再生,板结、不溶物污染、严重吸附反冲。重新装柱。,66,四、主要参数测算,V0及Vi的测算Kd及Kav的值分辨率R,67,（一）V0及Vi的测算,1重量法Vt=Vo+Vi+Vg =/4d2h Vi=gWrVo=Vt（Vi+Vg） Vg估算为1cm3/g干胶。2过柱法已知物质的洗脱体积 Ve=Vo+KdVi如用全渗入（Kd=1）或全排阻（Kd=0）的物质过柱，测量其洗脱体积，计算该凝胶柱的V0值及Vi值。常用蓝色葡聚糖（Kd=0）及重铬酸钾（Kd=1）。,68,（二）分配系数测定,分配系数当测得某物质的Ve及Vt ，内水体积Vi及外水体积V0时，算出Kd及Kav的值。Kd及Kav Ve被认为是一种组分对于某一个凝胶柱的特征常数。,69,（三）分辨率,凝胶层析中，两物质（A和B）和分辨率（R）定义为： 当R值1，两物质完全分开，小于1时则不能完全分离。分离时较大柱床体积可增大Ve 。减少（WA+WB）的方法是适当浓缩样品、选用小粒度凝胶、流速适当减慢等。,70,五、凝胶层析的扩展,（一）上行凝胶层析 利用流动和重力方向相反的上行层析法，即洗脱液向上流动的层析法。反转柱 （二）增加有效床高 -提高分辨率 （1）串联层析 ：有效柱长 （2）循环层析：即在同一根或两根柱上，样品反复进行层析。,71,循环层析,图7.21 人血浆蓝蛋白的循环层析分离柱：交联葡聚糖凝胶G-100，3.293cm；样品：5.2ml（3%）；流速：20ml/h；洗脱液：0.1mol/L pH8.0 Tris缓冲液（含0.5mol/L NaCl）,简单的循环层析装置选择阀用于选择待循环液或废液，样品从AD上柱，经BD洗脱，经检出的废液由EC排出，需循环的物质由ED进入层析柱。,72,（三）薄层凝胶层析,用交联葡聚糖作为薄层层析的支撑载体，称“薄层凝胶层析”。仅适用于分析 。特点： 生化分析； 设备简单，操作方便，分离迅速； 分辨率高； 同一薄板可同时分析数个样品；,73,第四节 色谱峰变宽的问题,样品的洗脱曲线不是一个窄的矩形峰，而是一个较宽的高斯峰。洗脱曲线： 样品的分子量分布， 仪器造成的峰加宽效应。,74,一、溶液通过色谱柱造成的峰加宽,Giddings提出的无规则行走模型。溶质分子本身的运动是无规则的。（一）分子扩散（二）涡流扩散（三）流动相中传质阻力（四）固定相中传质阻力,75,（一）分子扩散,(1)小而均匀的填料(2)适当的溶剂(3) 提高流速,76,（二）涡流扩散,与填料颗粒的形状，尤其是颗粒尺寸有关。(1)小而均匀的填料(2)粒度一致且装得均匀,77,（三）流动相中传质阻力,流动相在柱中的流速是不均匀的。溶质分子有流速的梯度而导致溶质分子的浓度梯度，径向扩散。 （HETP）m=d2pV/Dm (1)填料装得规整、紧密。(2) 采用粒度小的填料；(3)降低流速；(4) 选用合适的溶剂（溶质的扩散系数较大）。,78,（四）固定相中传质阻力,在色谱柱中溶质分子的一部分F在流动相中，而另一部分（1F）在固定相中。分子从固定相中脱离出来到流动相中去，而另一些分子则从流动相进入固定相中。结果：（1）溶质层变宽；（2）溶质层作为一个整体以FV的速度运动。,79,色谱柱内造成的峰加宽,填充介质粒度越小,峰加宽效应越小。,80,二、溶液在柱外产生的峰加宽,（一）连接管路 当液体流经细管时，径向速度梯度使矩形溶液脉冲变成抛物面形，并导致浓度的径向梯度。减小管径 （二）检测池,凝胶过滤层析经常遇见的问题,1流速慢,（1）有气泡、出水管阻塞,（2）没打开夹子,（3）柱压太紧（操作压过大、长期使用）,2柱内产生气泡,（1）上水口不流或皮管破裂，洗脱液外流,（2）接口漏气，如上水口螺丝拧的不紧,（1）胶面不平,3条带扭曲,（7）胶不适当,（5）长菌,（6）柱下口软管太长,84,第五节 凝胶层析的应用,一、脱盐和浓缩二、分子量测定三、分离纯化,85,一、脱盐和浓缩,脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。脱盐用的凝胶多为大粒度的，高交联度的凝胶,如SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6。 柱长与直径之比为5-15.样品体积最好小于内水体积的三分之一。醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，加样后，用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。,86,采用包埋法直接投入法,浓缩,87,二、分子量测定,在凝胶的分离范围内，不同分子量的物质其洗脱体积Ve及分配系数Kd值随分子量增加而下降。对于一个特定凝胶柱，待测定物质的洗脱体积与分子量的关系符合公式Ve=-KlogM+C,88,（1）求解法:（两个已知分子量的蛋白质过柱） Vel=CKlogM1 Ve2=CKlogM2 （2）标准曲线法:（先以3个以上已知分子量的标准蛋白过柱 ）: 标准曲线法准确性较高,89,Ve与分子量的关系,图7.29 一些球蛋白分子量与Ve的关系柱：402.4cm；洗脱液；0.05mol/L Tris-HCl缓冲液pH7.5（含0.1molKCl）1大豆胰蛋白酶抑剂；2细胞色素C二聚体；3胰凝乳蛋白酶原；4卵清蛋白；5血清白蛋白；6血清白蛋白二聚体；7-球蛋白；8甲状腺球蛋白；9蔗糖；10胰高血糖素；11细胞色素C5611；12细胞色素C5611；13核糖核酸酶；14-乳清蛋白；15肌红蛋白,90,三、凝胶层析在生化制药中的应用,（一）去热原吸附法除热原的专一性不强。对SephadexG-25来说，氨基酸Kd值等于1，热原性物质Kd值都等于0。,91,（二）分离纯化,SephadexG-50纯化胰岛素，除去胰岛素中前胰岛素和其它大分子抗原物质。利用某些物质与凝胶具有程度不等的弱吸附作用。如用G25分离氨基酸混合物。酸性氨基酸受到胶粒部分排斥而先被洗出，芳香族氨基酸有弱吸附作用故较后排出，碱性氨基酸吸附最强，所以最后排出。,思考题,4.什么是“类分离”和“分级分离 ”？,2.柱床体积、内水体积、外水体积、基质体积、洗脱体积 、分配系数、全渗入、全排阻,1.凝胶层析的原理及特点。,3.了解葡聚糖凝胶、生物凝胶、琼脂糖凝胶到结构及特点,5.在实验中应如何选择凝胶与预处理？,6.凝胶用过后，有那几种保存方法？,8.细粒凝胶柱流速慢，洗脱峰越窄，分辨率高，适用于什么产品的分离或分析？粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，适用于产品制备那个阶段的分离？,7.凝胶层析的操作步骤？,10.在凝胶层析中要想得到好的层析结果应注意那些问题和采取那些措施？,11.根据凝胶层析分离大分子物质的原理，分子质量为2万，6万和10万的蛋白质可选择哪种规格型号的Sephadex G凝胶将三者分开？洗脱后顺序如何？为什么？,9.凝胶层析的应用范围有那几方面？,