第七章 外源基因的表达及其优化策略课件.ppt

,第七章 外源基因的表达及其优化策略,第一节影响外源基因表达的因素 第二节外源基因在原核细胞中的表达 第三节外源基因在真核细胞中的表达,第一节影响外源基因表达的因素,基因表达： 从DNA分子有序地将其所承载的遗传信息,通过密码子和反密码子系统,转变由特定氨基酸顺序构成的多肽或蛋白质分子过程，从而决定生物有机体遗传表型。,基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。 基因工程中基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。,第一节影响外源基因表达的因素,第一节影响外源基因表达的因素,基因表达 遗传信息从DNA到蛋白质的传递过程中心法则（central dogma）。,第一节影响外源基因表达的因素,克隆基因的表达 外源基因在宿主细胞中表达,外源基因,表达载体,重组载体,导入宿主细胞,在宿主细胞中 表达出蛋白质,提取蛋白,宿主细胞：,原核细胞或真核细胞,第一节影响外源基因表达的因素,影响外源基因表达的因素主要有： 阅读框架 顺式作用元件 翻译过程 表达体系,第一节影响外源基因表达的因素,一、阅读框架对转化基因的影响 什么是阅读框架(open reading frame, ORF)? 二、顺式作用元件对基因表达的影响 1.对基因转录起始的调控 1)启动子 2)增强子 3)沉默子,第一节影响外源基因表达的因素,二、顺式作用元件对基因表达的影响 2.对基因转录终止的调控 1)终止子 2)衰减子 3.对DNA结构的影响 1)核基质结合区：一段与核基质特异结合的DNA序列。 2)绝缘子：对一侧有作用，对另一侧没有。 3)基因座控制区：通过改变染色质结构导致基因转录。,第一节影响外源基因表达的因素,三、翻译过程对表达的影响 1.翻译起始对基因表达的影响 2.密码子偏爱性对基因表达的影响 3.翻译终止对基因表达的影响 四、表达系统对表达产物的影响,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,外源基因表达系统由基因表达载体和相应的受体细胞两部分组成。,宿主细胞分为两大类：第一类为原核细胞： 大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；第二类为真核细胞： 酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。,目前使用最广泛的宿主菌是大肠杆菌和酿酒酵母，已建立了许多适合它们的克隆载体和DNA导入方法。许多外源基因已获得成功表达。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,用原核生物作宿主。,A dividing E. coli,原核或噬菌体启动子,MCS,SD序列,终止子,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的优势 全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架 基因克隆表达系统成熟完善 繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定 被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,大肠杆菌作为表达外源基因受体菌的特征 大肠杆菌表达外源基因的劣势 缺乏对真核生物蛋白质的复性功能 缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统 内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白真核与原核生物结构上存在差别,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,一、原核生物细胞表达的特点 1.原核生物只有一种RNA聚合酶识别原核细胞的启动子，催化所有RNA的合成。 2.原核生物的表达是以操纵子为单位的。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,一、原核生物细胞表达的特点 3.原核生物的转录与翻译是偶联的，也是连续进行的。 4.原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。 5.原核生物基因的控制主要在转录水平，这种控制要比对基因产物直接控制要慢。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,一、原核生物细胞表达的特点 6.在大肠杆菌mRNA的核糖体结合位点上，含有一个翻译起始密码子及同16S RNA 3末端碱基互补的序列，即SD序列。 Shine-Dalgarno（S-D）sequence:含有一个启始密码子和一段同核糖体16SRNA3末端碱基互补的序列，叫Shine-Dalgarno（S-D）序列。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,二、外源基因在原核细胞中表达具备条件 1.通过表达载体将外源基因导入宿主菌，并指导宿主菌的酶系统合成外源蛋白。 2.外源基因不能带有间隔顺序(内含子)，因而必须用cDNA或全化学合成基因，而不能用基因组DNA。 3.必须利用原核细胞的强启动子和SD序列等调控元件控制外源基因的表达。 4.外源基因与表达载体连接后，必须形成正确的开放阅读框架(ORF)。 5.利用宿主菌的调控系统，调节外源基因的表达，防止外源基因的表达产物对宿主菌的毒害。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,原核生物基因表达载体的组成特征 启动子 核糖体结合位点(SD序列) 终止子 选择标记基因 复制子 原核生物基因表达的受体系统 大肠杆菌受体系统、芽孢杆菌受体系统 链霉菌受体系统、蓝藻受体系统,大肠杆菌表达载体的基本成分,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 是DNA上的能与RNA聚合酶结合并能起始mRNA合成的序列。 （1）启动子序列 大肠杆菌的所有启动子中都有两段一致顺序（consensus sequence）。,-35 Box 和 -10 Box,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,不同启动子的consensus sequences,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （1）启动子序列 -35 box：RNA聚合酶 亚基的识别位点 。 5-TTGACA-3 -10 box（Pribnow Box）：5-TATAAT-3,TTGACA,TATAAT,转录起始位点,17bp,5,核糖体结合位点,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,原核启动子共有序列的功能,三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （1）启动子序列,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 1. 启动子 （2）翻译的起始位点 a)核糖体结合位点（ ribosome binding site ,RBS） Shine-Dalgarno（SD） sequence： mRNA上与核糖体16sRNA结合的序列。 S-D序列距离AUG的距离也影响翻译，最佳距离4-8 nt b)起始密码：位于SD序列下游 AUG（91%）、GUG（8%）、UUG（1%）,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 2.RNA多聚酶 大肠杆菌只有一种类型的RNA多聚酶转录tRNA，rRNA和mRNA。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子 在表达载体克隆位点的下游一般设计一段转录终止子。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子 原理： 茎环结构 反向回文顺序被转录后，立即形成一个茎环结构，使转录物与模板之间配对的碱基数降低，整个减弱了RNA 与DNA的互作 多聚A/U 由于茎环3段紧接一串A/U的配对，稳定性比较差，有利于转录物脱落而不利于转录延续。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 3. 转录终止子,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,三、原核生物基因表达的调控 4. 翻译终止密码 大肠杆菌偏爱UAA。一般安置上全部的三个终止密码防止核糖体跳跃（skipping）。 5. 翻译增强子（Translation enhancer） 能够显著增强外源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率的特殊序列。 T7噬菌体基因10前导序列（简称g10-L序列）; 大肠杆菌atpE基因mRNA5-UTR中富含U的区段,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体,1. 非融合型表达载体,载体表达出的外源基因蛋白质不与细菌的任何蛋白质融合在一起。,S-D序列,ATG-外源基因-TAG,优点：产物结构接近于真核细胞体内的蛋白质结构。 缺点：容易被宿主菌的蛋白酶所破坏。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体：,条件： 必须选择一个有lacI的宿主菌。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体： 结构组成： 1）强启动子: tac（trp-lac） 2）操纵基因：乳糖操纵子系统。,trp的-35区,lacUV5的-10区,lac操纵基因,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体： 结构组成： 3）调节基因：宿主菌染色体上的乳糖操纵子系统。 如JM105菌。 4）终止子：rrnB的强终止子 S-D序列和插入位点区：,S-D,插入位点区,Lac I,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 1. 非融合型表达载体 pKK223-3 载体： 结构组成： 6）载体的其余部分：来自pBR322质粒。 7）表达诱导物：IPTG（乳糖的类似物，不会被降解）,tac P,Lac O,S-D,插入位点区,rrnB T,宿主lac I,阻遏物,IPTG,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体 载体表达出的外源蛋白质与细菌的分泌信号肽连在一起，可被宿主菌分泌到细胞周质中。,如：pIN III系列：,pIN III-comA1, pIN III-comA2, pIN III-comA3,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体 pIN III系列 组成结构 1）强启动子：Ipp（脂蛋白基因启动子）和lacUV5启动子。 2）调节基因：lac I 。3）S-D序列和起始密码ATG。 4）分泌信号肽：大肠杆菌外膜蛋白基因ompa。 5）插入位点区（多克隆位点）。,Ipp,lac P,lac O,S-D/ATG,ompa,插入位点,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,pIN III-comA1,四、常用大肠杆菌表达载体 2. 分泌型表达载体,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 表达出的外源基因产物蛋白是与质粒载体上的菌体蛋白连接在一起的。 如：pGEX系列 优点：便于融合蛋白的分离和纯化。 组成结构： 1）启动子：tac 2）操纵基因：lacP 3）调节基因：lacI 4）S-D序列 5）ori：pBR322 ori 6）融合肽：GST(谷胱甘肽巯基转移酶）,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列,lacI,tac,lac O,S-D/ATG,GST,插入位点,TGA,lacP,GST融合蛋白用Glutathione Sepharose亲和层析柱分离纯化。,产物提纯:,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统 pGEX系列 产物分离:用凝血酶或Xa因子可以把外源蛋白从GST上切下来。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,GEX-2X的插入区,GEX-1X的插入区,GEX-3X的插入区,四、常用大肠杆菌表达载体 3.融合蛋白表达载体系统,GEX系列插入区,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,四、常用大肠杆菌表达载体 4.其他融合蛋白系统 His-tag（组氨酸标签） 在外源多肽的N端或C端接上6个组氨酸（His）。 His-tag能与Ni2+柱结合，但很容易被EDTA（或咪唑溶液）洗脱下来，可以纯化蛋白质。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,五、提高外源基因表达效率的方法 1. 选择强启动子序列，如tac 等 2. 调整S-D序列与AUG碱的距离 一般为5-9bp 距离过长或过短都影响真核基因的表达。根据不同的启动子选择不同的距离 3. 改变起始密码下面的几组密码子 能提高翻译的起始效率 4. 增加mRNA的拷贝数和稳定性,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,五、提高外源基因表达效率的方法 5. 减轻宿主细胞的代谢负荷 合理地调节代谢负荷与外源基因高效表达的关系 （1）诱导表达 将宿主生长代谢与外源基因表达分开 一般采用温度诱导或药物诱导 PL启动子是温度诱导型:,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,五、提高外源基因表达效率的方法 5. 减轻宿主细胞的代谢负荷 （1）诱导表达 tac启动子是药物诱导型 调节基因lac I（位于宿主基因组内或载体上）始终产生阻遏物。 无IPTG 阻遏物与lac操纵基因结合，抑制外源基因转录。宿主大量生长。 有IPTG 阻遏物与IPTG结合，lac操纵基因解放，外源基因大量转录。宿主生长受抑制。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,AmpR,Plasmid pGEX-KG,GST,lacIq,Ptac Promoter,Ampr,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,五、提高外源基因表达效率的方法 5. 减轻宿主细胞的代谢负荷 （2）表达载体诱导复制 将宿主的生长与载体的复制分开。,当宿主大量生长后，再诱导载体制粒的复制，增加拷贝数。,当需要宿主大量生长时，抑制载体质粒的复制。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,五、提高外源基因表达效率的方法 6. 提高表达产物的稳定性 防止被宿主的酶降解。 （1）设计成融合蛋白 这是避免被降解的最好措施。 N末端：由原核基因编码一段多肽， C末端：是完整的真核外源基因。,质粒基因产物,目的基因产物,N,C,切割,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,五、提高外源基因表达效率的方法 6. 提高表达产物的稳定性 （2） 使用突变菌株，保护外源蛋白不被降解 减少宿主菌本身的蛋白酶的表达。 1)使用次黄嘌呤核苷（lon）缺陷型菌株，减少宿主菌的蛋白酶合成。 2)大肠杆菌的htp R基因突变也减少蛋白酶的降解作用。 3)T4噬菌体的pin基因产物能抑制细菌的蛋白酶。可把pin增加到载体上。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,五、提高外源基因表达效率的方法 6. 提高表达产物的稳定性 （3）表达分泌蛋白,细胞质,外膜,内膜,周间质,质粒,染色体,“外排”： 蛋白质从细胞质跨过内外膜到培养液中。 “分泌”： 蛋白质从细胞质跨过内膜到周间质中。,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,五、提高外源基因表达效率的方法 6. 提高表达产物的稳定性 （3）表达分泌蛋白 细菌蛋白分泌的条件： 有信号肽:位于N端，一般为15-30aa 。真核与原核的结构相似, 功能相似，可以互换。,碱性氨基酸,N,疏水氨基酸核心区,切割位点,Arg、Lys,Leu、Ile,AlaGlySer,信号肽酶,外源蛋白,第二节 外源基因在原核细胞中的表达,五、提高外源基因表达效率的方法 6. 提高表达产物的稳定性 （3）表达分泌蛋白 细菌蛋白分泌的条件： 蛋白质内有与分泌相关的aa 序列:为蛋白指明目的地。 细胞内的转运机制:信号肽酶I、信号肽酶II等近20多种蛋白质的参与。 真核细胞中的分泌蛋白能在大肠杆菌中很好地分泌表达； 但非分泌蛋白很难在大肠杆菌中分泌。,