重组水蛭素的聚乙二醇修饰.docx

重组水蛭素的聚乙二醇修饰李雪芹，候蓓蓓，赵军，田明玉，修志龙*大连理工大学环境与生命学院 大连 116024摘要：目的 水蛭素因血浆半衰期短而严重限制了其临床应用，聚乙二醇修饰能有效地延长其半衰期。本文通过比较不同修饰位点、修饰方法所得单修饰产物的比率、纯度及其活性保留率，从而得到修饰专一性强且活性保留率较高的修饰策略。方法采用液相和固相修饰方法,用琥珀酰亚胺活化的PEG 20kDa分别在pH6.0、8.0的条件下对水蛭素的His和Lys进行定点修饰；用SDS-PAGE分析产物的修饰度，并用离子交换柱对修饰后的产物进行分离，然后用凝血酶滴定法测定水蛭素单修饰产物的体外抗凝活性。另外用分子动力学模拟方法预测了pH8.0条件下PEG修饰的位点。结果 在pH6.0、8.0的条件下，水蛭素单修饰率都高达90%以上，但二者的单修饰活性保留率相差较大。在pH6.0时，液、固相单修饰活性保留率为34%、34.8%；而在pH8.0时分别为55%、96%。结论 在pH8.0 条件下，采用 “离子交换柱辅助”固相修饰的方法对Lys进行定点修饰能得到较高产率和较高活性保留率的单修饰产物。关键词：重组水蛭素；SC-mPEG；抗凝活力；分子动力学模拟 PEGylation of Recombinant HirudinLi Xueqin，Hou Beibei，Zhao Jun，Tian Mingyu，Xiu Zhilong*Department of Bioscience and Biotechnology,School of Environmental and Biological Science and Technology,Dalian University of Technology,Dalian 116024,ChinaAbstract: OBJECT Hirudin is the most potent inhibitor of thrombin found in nature. Although hirudin has the strongest anti-thrombin activity in vivo, its short half-life in serum significantly limits its clinical anticoagulant application. Currently, PEGylation is commonly used as an effective method to prolong its half-life in serum. Our object of experiment is to choose the best PEGylation method according to the monoPEGylated recombinant hirudins purity and the anticoagulant activity in vitro. METHODS Solution method and solid method assisted by “packed-bed” and anion exchange column were used to favor the formation of mono-PEGylated hirudin. The mild acidic and mild alkaline PEGylation strategy was used to target His residue and Lys residue of hirudin respectively using SC-mPEG 20kDa. The pegylated products were isolated by anion exchange chromatogram. SDS-PAGE was used to analyze the purity of PEGylated hirudin. Thrombin method was used to analyze the anticoagulant activity of PEGylated hirudin. Molecular dynamics modeling was used to judge the probability of PEGylation site. RESULTS The mono-PEGylated product with a purity of more than 90% was obtained at pH6.0 and pH8.0. But a large difference in anticoagulant activity exists: the anticoagulant activity of solution and solid methods were 34% and 34.8% respectively at pH6.0；55%、96% at pH8.0. CONCLUSION Solid method assisted by anion exchange column at pH8.0 was a better strategy to get mono-PEGylated r-Hirudin.Key words：recombinant hirudin；SC-mPEG；anticoagulant activity；molecular dynamics modeling前言 水蛭素是含65个氨基酸残基与3个二硫键的多肽，分子量约7000，是迄今为止发现的特异性最好的凝血酶抑制剂1,而凝血酶诱发的血液凝固是诱导血管血栓形成的重要原因，因此水蛭素对各种血栓病均有疗效。然而水蛭素有一些显著的药用缺点，如血浆半衰期较短，一般只有60-100分钟，患者需不断注射才能维持抗凝效果，导致治疗成本较高，且重复注射也会引起一些不良反应2-4。上世纪70年代以来，人们发现一些蛋白经过PEG修饰后，很多方面的药用特性大大改善。之后，人们开展了对于水蛭素的PEG修饰研究。George C.Avgerinos5等人采用基因工程方法对水蛭素氨基酸进行改造，用甲基营养酵母 Hansenyla polymorpha特异性表达了只含两个Lys的水蛭素，采用对硝基碳酸酯活化的PEG 5kDa进行修饰，并设计了工业等级纯化步骤。这种对水蛭素修改的方式可以大大提高修饰产物的专一性，但是研究周期性较长且须具备一定的科研条件。国内也有关于水蛭素PEG修饰的研究。于爱平6等人采用SPA-PEG 5kDa修饰水蛭素II，采用Source Q15离子交换柱凝胶柱分离修饰产物，发现三修饰产物活力大大降低，为原蛋白的33.5%。秦海娜7等人采用羰基二咪唑法活化的PEG 5kDa修饰水蛭素，采用凝胶色谱方法崔修饰产物进行分离，虽水蛭素可与修饰产物分离，但是修饰产物之间未能分离开。本实验组旨在通过比较不同修饰位点、修饰方法所得单修饰产物的比率、纯度及其活性保留率来找到修饰专一性强且活性保留率较高的修饰策略。修饰位点选择了His和Lys；修饰方法选择了液相修饰和 “填料辅助”、“离子交换柱辅助”两种固相修饰方法。1 材料 基因工程重组水蛭素（r-Hir）购自大连高新生物制药有限公司；水蛭素变异体2购自重庆科润生物医药有限公司；SC-mPEG 20kDa购自北京键凯科技有限公司2 实验方法2.1 水蛭素His位点的PEG修饰2.1.1液相修饰 HV2与SC-mPEG 20 kDa以摩尔比 1:1 溶于0.2M pH6.0磷酸盐缓冲溶液中（PBS），在25中反应1.5h。反应产物用HiTrap Q HP进行线性梯度洗脱。2.1.2“填料辅助”的固相修饰在pH6.0下，将20mM PBS与r-Hir: SC-mPEG以摩尔比1:3在Q-Sepherose FF介质中充分反应，反应完成后装柱、梯度洗脱。2.2 水蛭素Lys位点的PEG修饰2.2.1 液相修饰 HV2与SC-mPEG20 kDa以摩尔比 1:3 溶于0.02 M pH8.0 PBS中，在23下反应。SC-mPEG分三等分三次加入，每次反应30min。反应结束后样品立即用HiTrap Q HP进行线性梯度洗脱。2.2.2 “离子交换柱辅助”的固相修饰 4 ml 1.5mg/ml HV2 溶液 (溶于PBS 20 mM, pH 8 A液）与溶于4 ml 20 mM, pH 8 PBS 中的 SC-mPEG先后以1 ml/min的流速上样于柱中，使二者在柱中充分反应后进行在线梯度洗脱。3 分析方法 3.1 SDSPAGE参考文献8，15%浓缩胶、4%分离胶，采用含5%氯化钡的0.1M碘液对PEG进行染色。表1为水蛭素PEG各修饰产物的理论分子量，可结合电泳图确定洗脱组分成分。表1 水蛭素PEG修饰产物组分理论分子量Table 1 The estimated molecular weights of the PEGylated hirudin 3.2 生物活性测定参照文献9的方法，采用凝血酶滴定法。3.3 组氨酸修饰产物含量检测利用SC-mPEG与r-Hir的His残基之间形成的氨基甲酸酯键对于中性羟胺的敏感性测定组氨酸修饰位置异构体的含量。3.4 Lys修饰位点预测采用溶剂可及表面积作为判定赖氨酸残基修饰可能性的判断标准，运用分子动力学模拟的方法分析和预测液相和固相修饰的位点。4 结果4.1 水蛭素His位点的PEG修饰4.1.1 液相修饰 4.1.1.1 修饰产物的分离纯化液相方法制备的PEG化水蛭素采用离子交换柱进行分离纯化、SDS-PAGE法进行组分鉴定。图1 阴离子交换色谱分离修饰反应混合物（pH6.0）Fig.1 Separation of the PEGylation mixture (prepared at pH6.0) by anion-exchange chromatography 图2 修饰产物的电泳结果（15%-5%）Fig. 2 SDS-PAGE analysis of PEGylated r-hirudin.结合表1、图2可以推测出图1中峰 1，2 ，3分别为二修饰产物、单修饰产物、单修饰产物。通过积分法计算出图1中各峰的面积，从而得出出各产物的比例：峰1：峰2：峰3= 4.74%：94.6%：0.66%，可见单修饰产物是主要的修饰产物。4.1.1.2 单修饰产物的体外抗凝活性测定采用凝血酶滴定法对修饰水蛭素进行活性检测。图3 重组水蛭素以及单修饰重组水蛭素的体外抗凝活性测定Fig. 3 In vitro anticoagulant activity of r-hirudin and monopegylated r-hirudin 图3显示峰2相对于未修饰的r-hirudin其抗凝活性保留率为34%, 而峰3的抗凝活性保留率为19.2%。峰2具有较高的抗凝活性保留率，并且是修饰反应的主产物（峰2占修饰反应产物的94.6%）,因此被选作本文的目标单修饰产物做进一步的分析。4.1.1.3 His-修饰位置异构体含量测定利用SC-mPEG与r-Hir的His残基之间形成的氨基甲酸酯键对于中性羟胺的敏感性测定组氨酸修饰位置异构体的含量。图4 组氨酸修饰位置异构体含量测定Fig. 4 The proportion assay of His-pegylated positional isomer图4中，峰2的79.71%被中性羟胺断开为r-Hirdin, 表明His-修饰位置异构体含量为79.71%，是在0.2M pH6.0 PBS中修饰反应的主要的成份。4.1.2 “填料辅助”的固相修饰 4.1.2.1 修饰产物的分离纯化对在pH6.0 20mM PBS, r-Hir：SC-mPEG=1：3反应所得固相修饰产物，采用阶段洗脱的策略进行分离、SDS-PAGE法进行组分鉴定。图5 固相修饰反应混合物（pH6.0 20mM PBS, r-Hir: SC-mPEG=1:3）的分离纯化Fig. 5 Separation of the solid-phase assisted PEGylation reaction mixture (pH6.0 20mM , r-Hir: SC-mPEG=1:3 )图6 固相修饰反应混合物(pH6.0 20mM PBS,r-Hir:SC-mPEG=1:3)的纯化产物的电 泳图谱Fig. 6 SDS-PAGE analysis of the separation products of the solid-phase assisted PEGylation reaction mixture (pH6.0 20mM PBS, r-Hir: SC-mPEG=1:3 )如图5所示，峰1为盐浓度突然增大造成的紫外吸收的波动，峰2经电泳检测,如图6所示，分子量为约27KDa，推断为单修饰产物，峰3经高效凝胶过滤检测，因其具有和标准重组水蛭素相同的洗脱体积，推断其为未反应的水蛭素。4.1.2.2 His-修饰位置异构体含量测定利用中性羟胺法对修饰位置异构体的含量进行检测。图7 固相辅助单修饰产物高效凝胶过滤图谱Fig. 7 HPSEC analysis of the monoPEGylated product of the solid-phase assisted PEGylation由图7可知，中性羟胺作用未能打开mPEG与重组水蛭素之间的连接键，所以修饰反应未发生在His51。重组水蛭素中其他可能与mPEG-SC发生修饰的氨基酸残基主要是Lys的-氨基，N-末端氨基，文献报道N-末端氨基的pKa 为7.8，而Lys的- 氨基的pKa 为10.110，由于随着pH的降低，N-末端氨基的反应活性将大于Lys的- 氨基11,12， 所以在pH6.0的条件下，其反应活性较高，故推测修饰反应发生在N-末端氨基。 4.1.2.3单修饰产物体外抗凝活性测定采用凝血酶滴定法对修饰产物进行活性检测。表2 凝血酶滴定法测固相辅助单修饰产物活性Table 2 Analysis of the monoPEGylated product of solid-phase assisted PEGylation by thrombin titration method由表2知，单修饰产物的抗凝活性为原蛋白（r-Hir）的34.85%。该修饰产物的活性保留率略高于液相修饰反应所得单修饰产物的活性（34%），由于pH6.0,20mMPBS的液相修饰反应中79.71%的单修饰产物的修饰位点为组氨酸残基，而相同反应条件下的固相辅助修饰的单修饰产物的修饰均未发生在组氨酸，这是两种单修饰产物活性差异的主要原因。 4.2 水蛭素Lys位点的PEG修饰4.2.1 液相修饰产物的分离纯化采用离子交换柱对SC-mPEG 20 kDa的修饰产物进行分离纯化、SDS-PAGE法对分离组分进行鉴定。图8 SC-mPEG 20kDa液相修饰产物离子交换色谱图Fig. 8 Ion Exchange Chromatography of the SC-mPEG 20kDa HV 2 prepared in solution phase 图9 SC-mPEG 20kDa液相修饰产物离子交换洗脱物电泳图Fig.9 SDS-PAGE of peaks collected from Fig.8 结合表1、图9可知，图8中峰 1, 2分别为二修饰和单修饰产物。通过积分法计算出图8中各峰的面积，从而得出各产物的比例：峰1:峰2= 9.7%:90.3%，可见单修饰产物是主要的修饰产物。4.2.2 “离子交换柱辅助”的固相修饰产物的分离纯化对用“离子交换柱辅助”的固相修饰方法得到产物，采用阶段洗脱的策略进行分离、SDS-PAGE法进行组分鉴定。图10 SC-mPEG 20kDa固相辅助修饰产物离子交换色谱图Fig.10 Ion Exchange Chromatography of the SC-mPEG 20kDa HV 2 on column modification图11 SC-mPEG 20kDa固相辅助修饰产物离子交换洗脱物电泳图Fig. 11 SDS-PAGE of peaks collected from Fig.10 洗脱组分鉴定同4.2.1。图10中峰1，2分别为SC-mPEG 20kDa二修饰和单修饰产物。通过积分法得出图10中各产物的比例：峰1：峰2= 3.9%：96.1%。相比液相分离在纯度及修饰专一性上都有了显著提高。但从图8、11比较中发现固相修饰的转化率比液相要低。这可能是由于固相修饰中，柱内填充着的离子交换介质导致环境复杂，蛋白和PEG在水溶液中状态以及分子大小差异使得它们在柱中的分配不同，致使反应物接触几率降低。4.2.3 修饰产物体外抗凝活力测定采用凝血酶滴定法对修饰水蛭素进行活性检测。图12 各种单修饰水蛭素体外比活Fig. 12 The specific activity ratios of the mono-PEGylated HV2s in vitro图12所示，固相修饰的蛋白活力保留率显著高于液相修饰。固相修饰提高修饰反应的单一性，且活力保留率比较高。此种现象从另一个角度说明固相修饰可以提高修饰专一性。4.2.4水蛭素修饰位点的预测与分析 采用溶剂可及表面积法对水蛭素修饰位点预测发现：在液相修饰中除Lys47外其它三个赖氨酸的NH2残基都比较容易被修饰；在固相修饰中，Lys 27， Lys 35比Lys 24， Lys 47更易被修饰，又因为Lys27位于N域的核心部位，靠近三个二硫键，因此PEG对K27的修饰会降低水蛭素的活性。而Lys35位于水蛭素的一个柔性很大的伸向溶液的环上，既远离水蛭素/凝血酶作用区，又远离水蛭素的N域核心。因此可以推测，得到的活性较高的PEG修饰产物应该修饰在Lys35上。5 讨论 目前用于修饰蛋白质的活化PEG种类较多,可以根据蛋白质本身的特点和要求选择不同种类的活化PEG,例如,专一性修饰肽链的N端氨基、半胱氨酸的巯基、赖氨酸的侧链氨基等13。所选择被修饰的基团必须是蛋白质功能的非必需基团,否则将导致蛋白质活性下降甚至完全丧失。本文选择了对位于非活性中心的His和Lys进行修饰。（1）在pH6.0的条件下用SC-mPEG 20kDa对His位点进行定点修饰。液相修饰中得到了以组氨酸位置异构体为主的单修饰产物，且目的单修饰产物占修饰产物的94.6%, 是微酸性条件下的主要修饰产物，且目的单修饰产物体外抗凝活性保留率为34% 。“填料辅助”的固相修饰中，在pH6.0 20mM PBS, r-Hir: SC-mPEG=1:3的条件下得到的单修饰产物的抗凝活性保留率达34.85%。通过对检测修饰产物中SC-mPEG与重组水蛭素的偶联键的检测，推断修饰位点为N-末端氨基。（2）在pH8.0条件下，用SC-mPEG 20kDa对Lys位点进行定点修饰。采用分子动力学模拟法预测：液相修饰的位点有Lys 27、Lys 35和Lys 24；Lys35是固相修饰的主要修饰位点。在本实验条件下，液相修饰和“离子交换柱辅助”的固相修饰中单修饰产物分别占修饰产物的90.3%、96.1%。活性保留率分别为55%,96%。固、液相修饰专一性及纯度与微酸条件下的修饰水平相当，但活性保留率有了显著提高，并且固相修饰明显优于液相修饰。因此在pH8.0 条件下，采用 “离子交换柱辅助”固相修饰的方法对lys进行定点修饰能得到较高比率、纯度且较高活性保留率的单修饰产物。 本实验实现了修饰反应与分离的偶联，减少了操作步骤，并且离子交换辅助的固相修饰方法为水蛭素的单修饰开辟了新途径。但也存在不足，如固相修饰法的转化率较低、活化PEG易水解等问题，可尝试通过不同离子交换填料来进行分析研究。参考文献：1Markwart,F.“The development of hirudin as an anti-thrombotic drug”,Thromb.Res.,74,123(1994).2Rydel,T.J.,Ravichandran,K.G.,Tulinsky,A.,Bode,W.,Huber,R.,Roitsch,C.,Fenton,J.W,“The structure of a complex of recombinant hirudin and human-thrombin”,Science,249,277280(1990).3Rydel,T.J.,Tulinsky,A.,Bode,W.,Huber,R.,“Refined structure of the hirudin-thrombin complex”,J.Mol.Biol.,221,583601(1991).4Markwardt,F.,“Past,present and future of hirudin”,Haemost. 21(Suppl.1),1126(1991).5George C A, Brian G T, Kenneth J G et al. Production and ClinicalDevelopment of a Hansenula polymorpha-Derived PEGylated Hirudin. Seminarsin Thrombosis and Hemostasis, 2001, 357-371.6于爱平,蒋中华,钟根深,董春娜,吴祖泽。聚乙二醇修饰水蛭素的分离纯化与活性分析。药物生物技术，2004 ,11 (5) :302-05.7Haina Qin,Zhi-Long Xiu,Dalian Zhang et al. Improved Analytical Methods for Pegylated Hirudin,Chinese J Chen Eng,2007,15(4):586-590.8 Stepaniants S, Izrailev S, and Schulten K. Extraction of lipids from phospholipid membranes by steered molecular dynamics. J. Mol. Model., 1997, 3:473 475.9 Vitali J, Martin PD, Malkowski MG et al. J. Biol. Chem., 1992, 267:17670.10Markwarkt F, Hirudin as inhibitor of thrombin. In S.P.Colowick, N.O.Kaplan, editiors, In: Methods in Enzymology, 1th ed., New York: Academic Press, 924-32，1957.11Wong, S. S. Chemistry of protein conjugation and crosslinking. 1991,CRC Press, Boca Raton, FL.12Lee, H., Jang, I. H., Ryu, S. H., and Park, T. G. N-terminal site-specific mono-PEGylation of epidermal growth factor. Pharm.Res. 2003,20:818-825.13RobertsMJ, BentleyMD, Harris JM. Chemistry for peptide and protein pegylationJ.Adv Drug Deliv Rev, 2002, 54(4): 459-47.附图表 表1 水蛭素PEG修饰产物组分理论分子量 Table 1 The estimated molecular weights of the PEGylated hirudinPEGylated productsMW/kDaDi-PEGylated(20 kDa)HV247Mono- PEGylated(20 kDa)HV227Tri- PEGylated(5 kDa)HV222Di- PEGylated(5 kDa)HV217Mono- PEGylated(5 kDa)HV212 表2凝血酶滴定法测固相辅助单修饰产物活性Table 2 Analysis of the mono-PEGylated product of solid-phase assisted PEGylation by thrombin titration method待滴定样品所耗标准酶活单位样品浓度（mg/ml）单修饰产物 115v 0.011 r-Hir(对照) 30v 0.001 图1 阴离子交换色谱分离修饰反应混合物（pH6.0）Fig.1 Separation of the PEGylation mixture (prepared at pH6.0) by anion-exchange chromatography 图2 修饰产物的电泳结果（15%-5%）Fig.2 SDS-PAGE analysis of PEGylated r-hirudin.注：1:标准PEGs；2:图1中的峰1； 3：图1中的峰2； 4: 图1中的峰3 图3 重组水蛭素以及单修饰重组水蛭素的体外抗凝活性测定Fig.3 In vitro anticoagulant activity of r-hirudin and monopegylated r-hirudin 图4 组氨酸修饰位置异构体含量测定Fig. 4 The proporton assay of His-pegylated positional isomer 注：1:液相单修饰产物（图1中的峰2 经中性羟胺处理）； 2:液相辅助单修饰产物（图1中的峰2）； 3: r-Hirudin(对照) 图5 固相修饰反应混合物（pH6.0 20mM PBS, r-Hir: SC-mPEG=1:3）的分离纯化Fig.5 Separation of the solid-phase assisted PEGylation reaction mixture (pH6.0 20mM PBS, r-Hir: SC-mPEG=1:3 ) 图6 固相修饰反应混合物(pH6.0 20mM PBS,r-Hir:SC-mPEG=1:3)的纯化产物的电泳图谱Fig.6 SDS-PAGE analysis of the separation products of the solid-phase assisted PEGylation reaction mixture (pH6.0 20mM PBS, r-Hir: SC-mPEG=1:3 )注：1：标准PEGs；2：图5中的峰1；3：图5中的峰2；4：图5中的峰3图7 固相辅助单修饰产物高效凝胶过滤图谱Fig.7 HPSEC analysis of the monoPEGylated product of the solid-phase assisted PEGylation注：1:固相辅助单修饰产物（图5中的峰2 经中性羟胺处理）； 2:固相辅助单修饰产物（图5中的峰2）； 3:图5中的峰3； 4:r-Hirudin(对照)图8 SC-mPEG 20kDa液相修饰产物离子交换色谱图Fig. 8 Ion Exchange Chromatography of the SC-mPEG 20kDa HV 2 prepared in solution phase35kDa20kDa12kDa10kDa Marker Peak1 Peak2图9 SC-mPEG 20 kDa液相修饰产物离子交换洗脱物电泳图Fig.9 SDS-PAGE of peaks collected from Fig.8图10 SC-mPEG 20kDa固相辅助修饰产物离子交换色谱图Fig.10 Ion Exchange Chromatography of the SC-mPEG 20kDa HV 2 on column modificationMarker Peak1 Peak235kDa20kDa12kDa10kDa 图11 SC-mPEG 20kDa固相辅助修饰产物离子交换洗脱物电泳图Fig.11 SDS-PAGE of peaks collected from Fig.10 图12 各种单修饰水蛭素体外比活Fig.12 The specific activity ratios of the mono-PEGylated HV2s in vitro1 SC-mPEG 20kDa液相修饰产物；2 SC-mPEG 20kDa固相修饰产物