第四章DNA的突变损伤和修复课件.ppt
Chapter 4. DNA damage, repair，mutation,第一节：突变（mutation),一、突变的主要类型,突变是DNA碱基序列水平上的永久的、可遗传的改变。碱基序列的变化可以分为下面几种类型 ： 碱基替换（base substitution），即DNA分子中一个碱基被另一个碱基替代；插入（insertion），涉及一个或多个碱基插入到DNA序列中；缺失（deletion），涉及DNA序列上一个或多个碱基的缺失；,重复（duplication），一段碱基序列发生一次重复；倒位（inversion），一段碱基序列发生倒转，但仍保留在原来的位置上；易位（translocation），一段碱基序列从原来的位置移出，并插入到基因组的另一位置。,1. 碱基替换 碱基替换又称为点突变（point mutation），是一种最简单的突变。碱基替换可以分为转换（transition）和颠换（transversion）两种类型。转换是指嘌呤与嘌呤之间，或嘧啶与嘧啶之间的替换；颠换是指嘌呤与嘧啶之间的替换。,转换：嘌呤与嘌呤之间，嘧啶与嘧啶之间的互换 AG T C颠换：嘌呤与嘧啶之间发生互换 A T or C T A or G G T or C C A or G,根据碱基替代对多肽链中氨基酸顺序的影响，点突变又可以分为同义突变、错义突变和无义突变三种类型。,有时DNA的一个碱基对的改变并不会影响基因所编码的蛋白质的氨基酸序列，这是因为改变后的密码子和改变前的密码子是简并密码子，它们编码同一种氨基酸，这种基因突变称为同义突变（synonymous mutation)。,由于碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变为决定另一种氨基酸的密码子的基因突变叫错义突变（missense mutation）。,基因突变有可能使它所编码的蛋白质部分或完全失活，例如人血红蛋白链的基因如果将决定第6位氨基酸的密码子由GAG （谷氨酸）变为GTG(缬氨酸)，从而引起镰刀形细胞贫血病。,fig. 11.2,sickle cell disease,有一些错义突变造成的氨基酸替代并不影响蛋白质的功能，我们就称之为中性突变。例如密码子AGGAAG，导致了Lys取代了Arg，这两种氨基酸都是碱性氨基酸，性质十分相似，所以蛋白的功能并不发生重大的改变。中性突变连同同义突变一起被称为沉默突变（silent mutation）。,由于某个碱基替代使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变（nonsense mutation）。其中密码子改变为UAG的无义突变又叫琥珀突变，密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变。无义突变使多肽链的合成提前终止，产生截短的蛋白质，这样的蛋白质常常是没有活性的。,突变也可以把终止密码子转变成编码某一氨基酸的有义密码子，造成终止信号的通读（readthrough），结果是多肽链的C末端添加了一段氨基酸序列。对于大多数蛋白质，C末端延伸一段短的氨基酸序列，并不影响它们的功能，但是过长的延伸会影响蛋白质的折叠，降低蛋白质的活性。,2. Deletions , Insertions and Frameshift mutations,基因的编码序列中插入或者缺失一个或两个碱基，会使DNA的阅读框架发生改变，导致插入或缺失部位之后的所有密码子都跟着发生变化，结果产生一种截短的或异常的多肽链，这种突变称为移码突变（frameshift mutations）。移码突变常常完全破坏了编码蛋白质的功能，除非移码突变发生在靠近读码框的远端的地方。,Frame shift mutation,5 AUG UGG GGA CCC AAG GGU AGC CCC . 3 (wild-type) met trp gly pro lys gly ser pro . 5 AUG UGG GGG ACC CAA GGG UAG CCC C. 3 (mutant) met trp gly thr gln gly stop,Two changes in polypeptides are possible: (1) every amino acid downstream of the mutation is changed, (2) a truncated (shortened) protein is produced.,然而，一次插入或者缺失三个碱基会添加或者删除一个完整的密码子，阅读框又得到恢复。这时，除了添加或缺失一个氨基酸残基，蛋白质的其他部分并未发生变化。如果添加（或缺失）的氨基酸不在蛋白质的功能区，仍能产生功能蛋白。,3. DNA重排,DNA重排包括缺失、倒位、易位和重复。基因组中相似序列之间的配对，以及随后发生的重组可以造成DNA的重排。如图，同一DNA分子的两个同向重复序列之间的配对和重组将使两个重复序列之间的部分形成一个独立的环，从原来的DNA分子上释放出来。原来的DNA分子则产生相应的缺失。,图表示同一DNA分子上的两个反向重复序列发生配对形成的茎环结构。配对后的重组将导致反向重复序列之间的部分发生倒位。大肠杆菌染色体含有7个拷贝的rRNA基因。有一些大肠杆菌菌株，染色体上两个rRNA操纵子之间的序列发生了倒位。这些菌株能够存活，但生长速度比正常的菌株要慢一些。,二、突变的产生,1自发突变,（1）复制差错可以引起自发突变（spontaneous mutation）,DNA聚合酶在DNA复制过程中偶尔会出现差错，将错误的碱基插入到DNA分子中，引发突变。另外，碱基的互变异构有时也会导致突变的发生。DNA分子中的碱基都存在两种互变异构体，它们处于动态平衡中，所以每一种碱基都可以从一种异构体转变为另一种异构体。,DNA复制时，碱基配对的性质由于碱基互变异构化而发生的改变也能产生突变。图表示偶尔在复制叉到达的关键时刻，模板上的G从酮式变为稀醇式，致使碱基的配对性质发生了变化，与T而不是与C配对。DNA再复制一次产生的两个子代双螺旋中的一个将带有突变，罕见的互变异构体会转变成其常见形式，配对性质有恢复到正常。由于正常碱基形成异构体的几率很低，所以自发突变的频率也很低，一般为1061010。如果某一碱基类似物能以较高的频率产生异构体，当掺入DNA分子后，就能提高突变率。,Tautomeric shifts can be a source of rare spontaneous mutation,During the next round of DNA replication, the transition mutation becomes “fixed” in the DNA.,并非所有的复制错误都是点突变，异常的复制也可以造成插入或缺失突变。当复制叉遇到串联重复序列时模板链与新生链之间有时会发生相对移动，导致部分模板链被重复复制或者被遗漏，其结果是新生链多了或少了一些重复单位。复制滑移（strand slippage）是微卫星（microsatellite）产生的主要原因。,(a) Normal replication. (b) Backward slippage, resulting in the insertion mutation.,(c) Forward slippage, resulting in the deletion mutation.,微卫星是一种短串连重复DNA。典型的微卫星是以1，2，3或4 bp长的序列为单位，重复1020次形成的。人类微卫星中，最常见的类型是二核苷酸重复序列，在整个人类基因组中约140 000拷贝。比如，人类基因组具有CA重复的微卫星，CACACACACACACAC，占基因组0.25，共8 Mb。,发生在短重复序列处的链的滑移也可能与人类的三核苷酸重复序列扩增疾病（trinucleotide repeat expansion disease）的发生有关。例如，人类HD基因含有串联重复635次的5-CAG-3，编码蛋白质产物中的多聚谷胺酰胺。在亨廷顿氏病（Huntington disease）中，这些重复序列扩增至36121个拷贝，增加了多聚谷胺酰胺的长度，造成蛋白质功能障碍。一些与智力缺陷有关的疾病与基因前导区的三核苷酸扩增引起的染色体脆性位点（fragile site）有关。,(2)碱基的脱氨作用引起的自发突变,在正常的生理条件下，腺嘌呤、鸟嘌呤、尤其是胞嘧啶可以自发地发生脱氨作用（deamination），脱去嘌呤环或嘧啶环上的氨基。胞嘧啶脱氨产生尿嘧啶，因此复制时在新生链对应的位点上插入的是腺嘌呤而不是鸟嘌呤。腺嘌呤自发脱氨转变成次黄嘌呤，次黄嘌呤优先与胞嘧啶配对，而不是与胸腺嘧啶配对。因此，腺嘌呤和胞嘧啶的脱氨作用可以造成突变。鸟嘌呤脱氨后变成了黄嘌呤（xanthine），由于黄嘌呤仍与胞嘧啶配对，只是它们之间只形成两个氢键，因此鸟嘌呤的脱氨作用并不能引起突变。,Deamination of C yields U which base pairs with AResults in C-G to T-A transitionThis occurs spontaneously,Deamination,2. Mutations are produced by mutagens,某些物理或化学因素可以提高突变率，这些能够导致突变的物理或化学因素就称为诱变剂（mutagen）。诱变剂会对DNA分子造成损伤。如果损伤在DNA复制之前还没有被体内的修复系统所修复，在DNA复制过程中，当复制叉抵达损伤部位时，常常发生复制错误，从而引起诱变。不同的诱变剂以不同的方式对DNA分子产生损伤，因而诱导突变的方式可能也不同。对DNA造成损伤的因素并不一定都是诱变剂，比如造成DNA断裂的断裂剂。这种类型的损伤可阻遏复制，导致细胞死亡。,(1)物理诱变剂,紫外线引起相邻的嘧啶碱基产生嘧啶二聚体,X-射线和-射线是电离辐射，它们作用于水分子以及其他的细胞内分子产生离子和自由基，尤其是羟自由基（hydroxyl radical）。具有高度反应活性的自由基会对DNA分子产生广泛的损伤。X-射线和-射线也可以直接作用于DNA，对DNA产生损伤。在分子生物学发展的早期，X射线经常被用来在实验室产生突变。X射线倾向于产生多种突变，并且常常造成DNA重排，例如缺失、倒转和移位。,加热可以促进碱基和戊糖之间N-糖苷键的水解，结果导致DNA分子上出现AP（apurinic/apyrimidinic, 无嘌呤/无嘧啶）位点，其中嘌呤更容易从DNA分子上脱落。AP位点处的糖磷酸基团不稳定，很快被降解，在双链DNA分子上留下一个缺口。双链DNA分子上的缺口一般没有诱变作用，因为这种损伤可以被有效修复。事实上，在人的一个细胞中，每一天会形成10 000个AP位点。但是，在某些情况下，缺口可以产生突变，比如大肠杆菌细胞中的SOS反应被激活时。,(2) 化学诱变剂,碱基类似物（base analog）指化学结构与核酸分子中的正常碱基类似的化合物，在DNA正常合成过程中，碱基类似物可以与模板上的碱基配对掺入到DNA分子中，而不被DNA聚合酶的3 5外切酶活性所切除。如果是单纯的碱基替代并不引发突变，因为在下一轮DNA复制时又可以产生正常的DNA分子。然而，碱基类似物能以更高的频率发生酮式和稀醇式的互变异构，或者形成两种形式的氢键，这就使碱基类似物具有诱变作用（mutagenic）。,碱基类似物Base-analogue mutagens的诱变作用,最常被应用碱基类似物是5-溴尿嘧啶（5bromouracil, 5-BU或BU）和2-氨基嘌呤(2-aminopurine, 2-AP)。通常情况下5-溴尿嘧啶以酮式结构存在，是胸腺嘧啶(T)的结构类似物，能与A配对。但它有时能以稀醇式结构存在，与G配对。,在DNA复制时，BU以通常的酮式结构取代T与A配对掺入到DNA分子中。在下一轮复制中，酮式结构可以变成稀醇式结构，与G配对。再经过一轮的复制，G与C配对，引起TA至CG的转换。在DNA复制时BU也可以取代C与G配对，产生GC至AT的转换，但这种能力较弱。不管哪种情况，BU掺入到DNA分子后，必须经过两轮复制才能产生稳定的可遗传的突变。,ATGC transition,2-氨基嘌呤是腺嘌呤的结构类似物，它能代替A进入DNA分子中与T配对有两个氢键，结合的程度较牢固；它也能与C形成只有一个氢键的碱基对，结合得较弱。随后经DNA复制，C与G配对完成AT至GC的转换，且这种转换多是单方向的，因为2-氨基嘌呤较难代替G而与C配对。,脱氨剂 (Deamination agents ）的诱变作用,许多化学诱变剂能以不同的方式修饰DNA分子的碱基，改变其配对性质而引起突变。脱氨剂（deamination agent）可以除去碱基上的氨基，改变其配对性质，造成碱基转换突变。脱氨作用也可以自发地发生，但是一些化学物质，例如亚硝酸（nitrous acid），可以促进腺嘌呤、胞嘧啶和鸟嘌呤脱氨作用的发生。,腺嘌呤脱氨后变成次黄嘌呤（hypoxanthine），次黄嘌呤与C配对而不是与T配对，胞嘧啶脱氨后变成尿嘧啶与A配对而不是与C配对。因此，腺嘌呤和胞嘧啶的脱氨作用可以造成突变。,烷化剂是一类能够向碱基上添加烷基基团的诱变剂。烷化剂很容易将烷基加到DNA链中嘌呤或嘧啶的N或O上，其中鸟嘌呤的N7和腺嘌呤的N3最容易受攻击。,烷化剂 (Alkylating ）的诱变作用,嵌入剂（intercalating agents）诱变作用,吖啶橙（acridine orange）、原黄素( proflavine)和溴化乙啶（ethidium bromide）等吖啶类染料有效的移码突变诱变剂。吖啶类化合物是一种平面三环分子，其大小和形状与一个嘌呤-嘧啶碱基对相似，因此能够插入DNA分子中两个相邻的碱基对之间，使得原来相邻的碱基对分开一定的距离，致使DNA在复制时增加或缺失一个碱基，造成移码突变。,活性氧,分子氧（O2）对DNA分子不会造成损伤，但是活性氧会对DNA分子产生广泛的损伤。活性氧包括超氧化物自由基（Superoxide）、羟自由基（hydroxyl radical）、过氧化氢（hydrogen peroxide）等。与分子氧相比，活性氧携带了更多的电子。细胞内的活性氧既可以由细胞内的正常代谢途径产生，也可以由环境因子诱导产生。这些自由基可在许多位点上攻击DNA，产生一系列氧化产物。,在众多氧化损伤中，鸟嘌呤8位碳原子的氧化最为常见，其氧化产物8-羟基鸟嘌呤(8-hydroxy-guanine)较为稳定，易于检测，被视为DNA氧化损伤的标志物。8-羟基鸟嘌呤优先与A配对，在DNA复制时产生G:C到T:A的颠换。,“O2-” hyperoxide“H2O2”Peroxide“OH” hydroxyl,三、正向突变、回复突变与突变的校正,目前为止，我们所讨论的突变属于正向突变（forward mutation），也就是改变了野生型性状的突变。相反的过程也可以发生，这种使突变型性状恢复到野生型性状的突变就称为回复突变（reverse mutation）。回复突变可以自发地发生，也可以用诱变剂处理增加其频率。回复突变产生的机制十分复杂，最简单的情形是第二次突变与第一次突变发生在同一位点，并且恢复了野生型序列这是真正的回复突变。,然而，真正的回复突变很少发生，大多数回复突变都发生在另一位点。因此，这样的第二次突变并未恢复野生型的碱基序列，只是其表型被抑制了。第二点突变可以发生在同一基因之中，也可以发生在不同的基因之中，前者称为基因内抑制，后者称为基因间抑制。在这一章，我们仅考察一下基因内抑制形成的机制。,错义突变所造成的表型性状的改变可能是因为突变影响到了蛋白质空间结构，进而导致蛋白质活性的丧失。假设，一种蛋白质空间结构的形成完全取决于多肽链上两个特定氨基酸残基之间的静电吸引作用。如果突变导致其中一个带正电荷的氨基酸残基被一带负电荷的氨基酸残基所取代，蛋白质蛋白质就不能正确折叠。但是，如果第二次突变使另一带负电荷的氨基酸残基又被一带负电荷的氨基酸残基取代，蛋白质就会形成正确的构象。,1. 基因内抑制,图表示了另一种更为复杂的基因内抑制。在这里，蛋白质的结构由6个氨基酸残基之间的疏水作用维持的。正向突变使其中一个侧链较小的氨基酸残基，被一个侧链较大的氨基酸残基所取代。而第二位点的回复突变使原来与丙氨酸相互作用的较大的氨基酸残基变为较小的氨基酸残基，恢复了疏水作用，因而恢复了蛋白质分子的功能。,对第2位点氨基酸取代的抑制效应进行分析有助于揭示蛋白质的空间结构。如果氨基酸A被X取代所产生的突变型效应被发生在另一位点的氨基酸取代（比如氨基酸B被Y取代）所抑制，A和B两个氨基酸在蛋白质的空间结构中彼此接近，或者位于两个蛋白质上两个相互作用的区域。,移码突变的回复突变通常发生在同一基因的另一个位点上，并且回复突变位点靠近原初的突变位点，只有这样两个突变位点之间才会有很少的氨基酸发生改变。两个突变位点之间的氨基酸序列发生改变不会对蛋白质的功能产生显著影响。,2基因间抑制,我们已经知道，编码一种氨基酸的密码子变成终止密码子称为无义突变，无义突变产生一种截短的、通常无功能的蛋白质。无义突变可以被另一基因上的突变所抑制。无义突变的抑制突变通常是一个tRNA基因突变，导致其反密码子发生改变，结果产生一种能够识别终止密码子的tRNA。,在图中，野生型基因中一个编码酪氨酸的密码子UAC突变成一个终止密码子UAG。突变基因编码一条无活性的蛋白质片段。细胞内无意突变的抑制突变发生在亮氨酰tRNA基因内，突变使tRNALeu的反密码子由3-AAC-5转变成3-AUC-5。突变的tRNA把终止密码子UAG读成亮氨酸的密码子。,这种突变的tRNA称为抑制子tRNA（suppressor tRNA）。一般把终止密码子UAG称为琥珀型（amber），UAA为赭石型(ochre)，UGA为乳白型(opal)。琥珀型抑制子为识别UAG的突变型tRNA。赭石型抑制子反密码子为AUU，由于反密码子和密码子识别过程中的摆动原理，赭石型抑制tRNA可以识别UAA和UAG两种反密码子。乳白型反密码子很少发现。,抑制tRNA的产生并不会影响读码框中有义密码子的识别。对于一种密码子细胞往往有多个拷贝的tRNA基因，即使其中一个拷贝发生了突变，也不会影响到对密码子的识别。所以，抑制突变至少在微生物中相当普遍，人们在细菌的谷胺酰胺、亮氨酸、丝氨酸、酪氨酸和色氨酸tRNA基因中发现了抑制突变。由抑制tRNA插入的氨基酸可能就是原来的氨基酸，这时蛋白质的功能得到了完全的恢复。或者，抑制tRNA在突变位点插入了另外一种氨基酸，使得突变基因产生了一个有部分活性的蛋白质。,在蛋白质合成过程中，终止密码子由释放因子识别。这样，抑制tRNA和释放因子对终止密码子的识别存在竞争。因此，抑制作用不是完全的，抑制效率通常是1040。这样的抑制效率可以为细胞足够的功能蛋白。然而，抑制tRNA也能识别未突变基因的终止密码子，造成通读，产生延长的多肽链。携带抑制突变的细胞生长的速度比正常的细胞要慢也就不足为奇了。事实上，只有细菌和低等的真核生物（例如，酵母，roundworms）能够容忍抑制突变。在昆虫和哺乳动物中，抑制突变是致死的。,四、突变的热点,突变可以发生在基因组中的任一位点。但是在基因组中，也存在一些位点，这些位点发生突变的几率比随机分布所估计的要高出许多，可能是预期的10倍或100倍，这些位点被称为突变的热点（hot spot），发生在热点上的突变常常是相同的。,大多数热点是DNA分子中的5甲基胞嘧啶位点。5甲基胞嘧啶是DNA合成后，胞嘧啶被修饰后形成的，在DNA分子中与鸟嘌呤正确配对。然而，5甲基胞嘧啶常常发生自发脱氨形成胸腺嘧啶，导致G-T对的产生，在双链DNA分子中产生了一个错配。当DNA复制时，在一个子代DNA分子中，A-T对就取代了G-C对，导致突变的发生。,突变热点的形成还有其他原因。如前所述，短的串联重复序列在DNA复制时会发生链的滑移，造成重复单位的插入与缺失。因此，短的串联重复序列也是突变的热点。例如，大肠杆菌lac I基因中有三个连续的CTGG序列，很容易产生一个CTGG序列的插入突变或缺失突变。,一系列物理或化学因素可以对DNA造成化学损伤。这些因素包括化学诱变剂、辐射以及DNA分子自发的化学反应等。有些类型的DNA损伤，如胸腺嘧啶二聚体或DNA骨架的断裂，使得DNA不能再作为复制和转录的模板。,第二节 DNA的损伤和修复,另一些损伤产生了改变了的碱基，它们不会阻止复制和转录的进行，但是可引起错配，在下一轮复制之后导致DNA序列的永久改变。例如，胞嘧啶通过脱氨作用转化为尿嘧啶，产生UG错配，在下一轮复制之后，一条子代DNA分子上的C G被 T A所取代。细胞在进化过程中，形成了多种修复机制，以保证在损伤阻遏复制或者产生突变之前就识别并修复损伤。,一、光 复 活（ Photoreactivation ）,在可见光存在的情况下，DNA光解酶（DNA photolyase）把环丁烷嘧啶二聚体分解为单体。DNA光解酶,又称光复活酶（photoreactivating enzyme）。光解酶在暗中结合到环丁烷二聚体上，吸收300350 nm的光后被激活，裂解二聚体后与DNA分子脱离。由于这种修复作用只在可见光下才可发生，所以这种修复机制称为光复活。,（64）光产物光解酶受光激活后，可以修复（64）损伤。光复活是一种广为存在的DNA修复机制，在很多细菌和一些真核生物（包括某些脊椎动物）中都存在，但是在人类和有胎盘的哺乳动物中没有这种修复机制。,Fig14-21. Photoreactivation cleaves pyrimidine dimers.,No DNA synthesis,350-500nm,photolyase,Bind to dimer in darkbut lack energy to remove crosslink,二、烷基的转移,一些酶可将烷基从核苷酸转移到自身的多肽链上，例如，在人类细胞中发现有一种O6-甲基鸟嘌呤甲基转移酶，能直接将DNA链鸟嘌呤O6 位上的甲基移到蛋白质的半胱氨酸残基上而修复损伤的DNA。,O6-methylguanine DNA methyltransferase,N,N,N,N,H2N,O-CH3,R,O6-methylguanine nucleotide,guanine nucleotide,H,H,大肠杆菌的Ada（adaptation to alkylation）蛋白可以通过两个活性中心去除DNA分子上的甲基基团。Ada蛋白的两个活性中心分别位于多肽链的N-末端和C-末端。,大肠杆菌的Ada（adaptation to alkylation）蛋白可以通过两个活性中心去除DNA分子上的甲基基团。Ada蛋白的两个活性中心分别位于多肽链的N-末端和C-末端。 DNA光解酶和烷基转移酶直接作用于DNA的损伤部位，把受到损伤的核苷酸恢复到原初的状态，因此上述两种修复机制又称直接修复（direct repair）。,核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)需要移去一段包括损伤在内的核苷酸序列，然后再通过DNA合成把余下的单链缺口填补上。它可以修复一系列损伤，包括环丁烷二聚体、64光产物和链间交联等引起的DNA变形（major distortion）。,三、核苷酸切除修复,当正在进行转录的RNA聚合酶遇到DNA损伤时，RNA聚合酶的移动受阻，RNA合成终止。这时，细胞的修复系统将优先修复模板链上的损伤。在细菌细胞中，转录修复耦联因子（transcription-repair coupling factor, TRCF）检测到受阻的RNA聚合酶后，指导UvrAB与受阻位点结合，启动切除修复。转录耦联修复的意义在于它将修复酶集中于正在被活跃转录的基因上。,在真核细胞中，转录耦联修复尤其重要，因为真核生物基因组的编码区相对稀少，距离较远。真核细胞实现转录修复耦联的关键组分是通用转录因子TFIIH。TFIIH具有解旋酶活性，在转录起始的时候解开DNA双链。在转录的过程中，TFIIH能够检测到DNA分子由于化学损伤产生的变形。当TFIIH遇到DNA损伤时，会募集切除修复系统，切断解链区，释放出受到损伤的区段。DNA聚合酶修复单链缺口，转录得以重新开始。,四、碱基切除修复,碱基切除修复是清除DNA分子中受损碱基的一种主要方法。DNA糖基化酶（glycosylases）能够切断脱氨碱基、甲基化碱基和氧化碱基等非正常碱基与脱氧核糖之间的糖苷键，在DNA上产生一个无嘌呤（apurinic）或无嘧啶（apyrimidinic）位点（AP位点）。细胞胞内的AP核酸内切酶，附着在AP位点上，并在AP位点的5-端切断磷酸二酯键，形成一个游离的3OH末端。DNA聚合酶I利用其5-3外切酶活性切去AP位点以及其下游的一段核苷酸序列，同时延伸3-OH末端填补缺口。最后的切口由DNA连接酶封闭。,不同的受损碱基由专一性的DNA糖基化酶负责切除。胞嘧啶脱氨产生的尿嘧啶由尿嘧啶-N-糖基化酶（uracil-N-glycosylase）从DNA分子上去除。,Fig14-18. dealing with oxidized guanine.,Prevent incorporation of preformed 8-oxoG into DNA.,MutT, MutM, MutY,五、错配修复（mismatch repair）,DNA聚合酶的35外切酶活性可将错误掺入的核苷酸去除。聚合酶的这种校正功能将DNA复制的忠实度提高100倍。然而，DNA聚合酶的校正作用并非绝对安全，有些错误插入的核苷酸会逃脱检测，并在新合成的链与模板链之间形成错误配对。在下一轮复制时错误插入的核苷酸将指导与其互补的核苷酸插入到新合成的链中，结果导致DNA序列中产生一个永久性改变。,DNA的错配修复系统（mismatch repair）可以检测到DNA复制时错误插入并漏过校正检验的任何碱基，并对之进行修复，将DNA合成的精确性又提高了23个数量级，对维护DNA复制的正确性十分重要。由于复制中出现的错配碱基存在于子链中，因此该系统必须在复制叉通过之后有一种能够识别亲本链与子链的方法，以保证只从子链中纠正错配的碱基。,我们已经知道大肠杆菌染色体DNA是被甲基化的。DNA腺嘌呤甲基化酶（DNA adenine methylase, Dam）将GATC序列中的A修饰成6-甲基腺嘌呤。DNA胞嘧啶甲基化酶（DNA cytosine methylase, Dcm）将CCAGG和CCTGG中的C修饰成5甲基胞嘧啶。这三种序列都是回文序列，所以DNA分子两条链的甲基化程度是相同的。这些甲基化的碱基并不干扰碱基间的正常配的，6-甲基腺嘌呤和5-甲基胞嘧啶仍与T和G形成正确的碱基配对。类似的情况是胸腺嘧啶（即5-甲基尿嘧啶）和尿嘧啶都与A配对。,刚完成复制的DNA，旧链是甲基化的，但新链要在复制完成几分钟后才被甲基化。刚完成复制的DNA保持几分钟的半甲基化状态为错配修复系统提供了一个识别亲本链和子链的基础。大肠杆菌主要的错配修复系统，MutSHL通过判断GATC序列是否发生甲基化来识别新生链和模板链。大肠杆菌中许多与DNA修复有关的基因用mut（mutator）表示，原因是这些基因发生突变会导致有机体的突变率增高。,六、重组修复（recombinational repair）,在讨论重组修复机制之前，有必要先分析一下胸腺嘧啶二聚体对DNA复制的影响。当聚合酶III遇到胸腺嘧啶二聚体时，会在二聚体位点停顿下来。这时，细胞会在二聚体的下游开始下一个冈崎片段的合成，新生链在二聚体对应的位置上出现一个缺口。通过重组过程可填补新生链上的缺口。缺口可用图所示的DNA重组方式填补：受损DNA复制时，一条子代DNA分子在损伤的对应部位出现缺口。,另一条子代DNA分子完整的母链与有缺口的子链DNA进行重组交换，母链DNA上相应的片段被用于填补子链上的缺口，而母链DNA出现又出现一个新的缺口。母链上的缺口再以另一条子链DNA为模板，经DNA聚合酶催化合成一新DNA片段进行填补，最后由DNA连接酶连接，完成修补。,一个双链损伤变成两个单链损伤,重组修复并不能去除损伤，损伤仍然保留在原来的位置。但是重组修复能使细胞完成DNA复制，并且新合成的子链是完整的。经多次复制后，损伤就被“冲淡”了，在子代细胞中只有一个细胞是带有损伤DNA的。重组修复机制对于细胞处理不易被修复或者不能被修复的损伤有着特殊的意义。,Recombinational Repair,Thymine dimer,Undamaged parental strandrecombines into the gapopposite the dimer, leaving a gap on the other parentalstrand.,Recombination is dependent RecA protein,Recombinational Repair,The gap in the undamaged parental strand is filled by DNApol I and ligase. The thyminedimer can now be repaired by excision repair,5,5,3,3,3,5,Thymine dimer,Thymine dimer,Recombinational Repair (Post-Replication Repair),DNA replication,Structuraldistortion,Excise patch from intact strand and insert in gap,Repair gap,Excision repair?,(RecA),六、SOS反应（SOS responses）,1.SOS反应：当DNA受到严重损伤时，染色体的DNA复制被抑制，进而诱导细胞产生SOS反应：大约20个与DNA损伤修复和DNA复制功能恢复有关的基因的表达水平升高，细胞的DNA修复能力得到加强，甚至出现DNA的跨损伤（translesion synthesis）合成。,2. SOS反应的诱导,当DNA受到严重损伤后，由于细胞内的切除修复和重组修复致使DNA单链部分在细胞中积累。RecA蛋白因与单链DNA结合而被活化，活化后的RecA蛋白再与LexA结合，引起LexA的自切，解除LexA对SOS基因的阻遏作用。,3.SOS基因： 在SOS反应中，SOS基因是按照一定的顺序被诱导表达的。SOS基因的表达时间由LexA与基因的SOS框的亲和力决定。按照在SOS反应中的表达时期，可以大致把SOS基因分为3组。首先被诱导的SOS基因是一些参与单链损伤修复的基因（比如，uvrA， uvrB，uvrD）或者与损伤耐受性有关的基因（比如，polB）。编码LexA和DinI的基因也在这一时期被诱导表达。DinI的功能是延迟激活跨损伤的DNA合成。,如果参与单链修复的基因不能帮助恢复正常的DNA合成速度，参与重组修复的基因便被诱导表达，它们包括recA和recN。如果出现大范围的DNA损伤，依靠提高重组修复的能力仍不能克服损伤对DNA复制的抑制作用，以sfiA和umuDC为代表的第3组基因被激活。umuDC操纵子被激活后细胞会进行DNA跨损伤复制。SfiA的作用是抑制细胞的分裂。如果DNA的复制速度恢复到正常，这3类基因按照与激活相反的顺序依次被关闭。相反，如果细胞仍不能修复DNA损伤，原噬菌体被诱导裂解细胞。,4. SOS诱导突变,umuC和umuD（UV-induced mutagenesis, umu），它们属于同一个操纵子，转录方向是D C。如上所述，与其他SOS基因一样，umuC和umuD基因在正常情况下被LexA阻遏。当DNA受损、复制受阻时，与单链DNA结合的RecA不但促进LexA自体切割，同样也能促进UmuD的自体切割，只是RecA促进UmuD切割的效率相当低，这就保证了UmuD在SOS反应的晚期才会发生自体切割，形成UmuD。两分子UmuD与一分子的UmuC组成的三聚体称为DNA聚合酶V。,在损伤位点，DNA聚合酶V取代停顿下来的DNA聚合酶III复制DNA的损伤区。这种DNA聚合酶的一个重要性质是，虽然它们是模板依赖性的，但是它们向新生链的3末端添加核苷酸时并不依赖碱基配对原则，因此DNA聚合酶V又称为差错倾向聚合酶（error-prone polymerase）。在损伤位点的另一侧，DNA聚合酶III迅速取代DNA聚合酶V进行DNA合成。尽管这类DNA聚合酶在进行跨损伤DNA合成时不遵循碱基配对原则，但是插入的核苷酸仍不是随机的。,
